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Bakterien zu finden, aber in den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass die VIM- Typ MBL´s immer häufiger in Vertretern der Familie Enterobacteriaceae zu finden sind. Dies lässt auf eine weitere Verbreitung dieser Resistenzfaktoren unter Bakterien mit einem höheren Infektionspotential schließen. Tatsächlich mehren sich die Fälle von nosokomialen Ausbrüchen mit solchen Keimen. MBL´s des IMP-Types wurden in den frühen 90er Jahren erstmals in Japan isoliert. In dieser Region scheinen diese Enzyme der am häufigsten zu findende Typ der “Acquired” MBLs zu sein, der auch für eine Vielzahl von nosokomialen Ausbrüchen verantwortlich war. In Europa spielen diese Enzyme im Vergleich zum VIM-Typ eine eher untergeordnete Rolle, obwohl bereits seit den späten 90er Jahren einige IMP- Varianten gefunden wurden. Zuletzt wurde im Jahr 2008 eine neue Metallo-Beta-Lactamase in K. pneumoniae bei einem schwedischen Patienten nach seiner Rückkehr aus Neu-Delhi beschrieben. Diese sogenannte New-Delhi Metallo-Beta-Lactamase (NDM-1) ist offenbar endemisch in Indien und kommt, wie KPC und OXA-48, überwiegend in bestimmten K. pneumoniae- Stämmen vor. Dass auch das bla NDM-1 -Gen auf Plasmiden lokalisiert und übertragen wird, zeigen die Berichte über NDM-1 in Enterobacter cloacae und E. coli aus den USA. Neueste Untersuchungen in Indien, Pakistan und Großbritannien bewiesen sowohl die klonale Verbreitung NDM-1-positiver K.-pneumoniae-Stämme in den Endemiegebieten als auch das Vorkommen ganz verschiedener bla NDM-1 -tragender Plasmide in K. pneumoniae, E. coli, Morganella morganii, Providencia spp. und Citrobacter freundii. Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC): Das erste Auftreten einer KPC-ß-Laktamase, welche fähig ist Carbapeneme, Penicilline, Cephalosporine und Aztreonam zu hydrolisieren, wurde bei einem in USA isolierten carbapenemresistenen K. pneumoniae – Stamm beschrieben. Später wurden KPC – Produzenten auch in anderen Teilen der Welt nachgewiesen. Es gibt aktuell neun verschiedene Varianten, wobei KPC-2 und KPC-3 am häufigsten vorkommen. Kürzlich wurden KPC-2/-3 – Produzenten auch in europäischen Ländern wie Griechenland, UK, Frankreich und Deutschland nachgewiesen. Die Verbreitung von KPC – Produzenten wird unterschätzt, weil der Nachweis von KPC und auch MBL - produzierenden K. pneumoniae phänotypisch häufig nicht erfolgreich ist, da die Carbapenemresistenz nicht immer ausgebildet wird. OXA-48 Carbapenemase: OXA-48-Carbapenemasen wurden im Jahr 2004 erstmals in K.-pneumoniae-Isolaten aus der Türkei beschrieben. Seitdem wurde diese Carbapenemase auch in Enterobacteriaceae aus Belgien, Israel, Indien, Großbritannien, Argentinien, Ägypten und dem Libanon detektiert. In Deutschland wurden 2008 erstmals OXA-48 positive Klebsiella pneumoniae in Südwestdeutschland isoliert. Wie bei KPC-produzierenden Bakterien ist es in der Regel schwierig, diese Resistenz phänotypisch zu detektieren. 6
3. Aufbau des hyplex ® SuperBug ID - Testsystems hyplex ® SuperBug ID PCR-Modul (Best. Nr. 3900): Herstellung spezifischer PCR-Amplifikate aus Probenmaterial, ausreichend für maximal zehn Hybridisierungen pro PCR-Reaktion. Verwendbare Hybridisierungsmodule: Best.-Nr. 3901 bis 3905 hyplex ® SuperBug ID Hybridisierungs-Module (Best. Nr. 3901 bis 3905): Einzelkavitäten mit immobilisierten Oligonukleotidsonden zum spezifischen Nachweis der fünf relevanten Gene (VE 96 Stück pro Sonde) und Reagenzien zur Durchführung von 96 reversen Hybridisierungen Probenmaterial: PCR-Amplifikate, die mittels des hyplex ® SuperBug ID PCR-Moduls gebildet wurden. In der folgenden Tabelle sind die für das hyplex ® SuperBug ID Testsystem separat erhältlichen spezifischen Sonden (Hybridisierungsmodule) aufgeführt. Hybridisierungsmodule für das hyplex ® SuperBug ID Testsystem Symbole Spezifität Kavitätenfarbe Best. Nr. : MTS│BR│VIM VIM (alle Varianten VIM-1 bis VIM-13) grün 3901 MTS│BR│IMP IMP (alle Varianten IMP-1 bis IMP-22) weiß 3902 MTS│BR│KPC KPC (alle Varianten KPC-1 bis KPC-10) schwarz 3903 MTS│BR│O48 OXA-48 gelb 3904 MTS│BR│NDM NDM-1 burgundy 3905 Mit einem PCR-Amplifikat können 10 Hybridisierungen durchgeführt werden. Damit kann eine Probe auf alle 5 Parameter getestet und die verschiedenen Sonden je nach Fragestellung ausgewählt werden. 4. Testprinzip hyplex ® SuperBug ID PCR-Module enthalten markierte Oligonukleotidprimer, die die simultane, spezifische Amplifikation verschiedener DNS-Bereiche in einer einzigen PCR-Reaktion ermöglichen. In Anwesenheit von relevanter DNS werden spezifische Amplifikate (aller Varianten) der Gene VIM, IMP, NDM-1, OXA-48 und KPC gebildet, die folgend mit den hyplex ® SuperBug ID Hybridisierungsmodulen visualisiert werden. Dazu werden die Amplifikate aus einer PCR mit dem hyplex ® SuperBug ID PCR- Modul hitzedenaturiert und zu einzelsträngigen, spezifischen Sonden gegeben, die an der Polystyrol-oberfläche von Mikrotiterplatten immobilisiert sind. Unter Verwendung eines Hybridisierungspuffers findet eine Hybridisierung komplementärer Sequenzen statt, die nachfolgend mittels ELISA-Prinzip detektiert werden kann. Dazu wird nach mehreren stringenten Waschschritten ein Peroxidase(POD)-Konjugat zugegeben. Dieses bindet hochspezifisch an die Markierung des an die Oligonukleotidsonde gebundenen Einzelstrangs des PCR-Produkts. Nach neuerlichen Waschschritten wird TMB-Substratlösung zugesetzt, die nach Umsetzung durch die POD eine blaue Farbe erzeugt. Diese Reaktion wird mit Hilfe einer Stopplösung beendet. Dabei ist ein 7
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