Rezumatul tezei de doctorat - USAMV Cluj-Napoca

More documents

Recommendations

Info

timp de 2-3 săptămâni, pentru a verifica dezvoltarea structurilor sexuale. Toate tulpinile au fost caracterizate şi identificate conform cheilor de identificare comunicate de Johnson Jr. şi col., 2002 (Dieguez-Uribeondo şi col., 2007). ObservaŃiile microscopice s-au efectuat pentru fiecare probă din fiecare bazin, procedându-se în felul următor: s-a prelevat cu o ansă microbiologică o porŃiune din colonia dezvoltată pe mediul PDA, s-a pus pe o lamă histologică, s-a mărunŃit cu o lamă de bisturiu, s-a adăugat o picătură de soluŃie Lugol pentru colorare, s-a omogenizat, iar la final preparatul a fost acoperit cu o lamelă histologică. ObservaŃiile s-au efectuat cu microscopul cu contrast de fază, imaginile preluându-se cu o camera digitală adaptată la microscop. I.3.5. ExtracŃia şi detectarea ADN-ului din fungi ExtracŃia ADN s-a făcut după protocolul liu Colao Maria Chiara (1999). ExtracŃia ADN a fost efectuată din miceliumul fungic dezvoltat în cultură pură pe mediul lichid PDB (Potato dextrose broth). S-au utilizat kitul de extracŃie de la Qiagen, Dneasy Plant Minikit (conform http://www.qiagen.com) şi extracŃia rapidă a ADN prin soluŃie PBS (tampon fosfat salin). ExtracŃia de ADN s-a efectuat pe 69 de probe, obŃinute pe combinaŃia de mediu solidlichid Potato Dextrose Agar (PDA-agar cu cartof-dextroză)- Potato Dextrose Broth (PDBbulion cu cartof-dextroză). Fiecare probă realizată pe fiecare bazin a fost divizată în două părŃi egale, fiind realizate în total 138 probe, pentru a se putea efectua extracŃia comparativă prin cele două metode utilizate. I.3.5.1. ExtracŃia ADN-ului din fungi utilizând kituri de extracŃie (QIAGEN) DNeasy Plant minikit este o procedură bazată pe coloane “spin”, care încorporează: liza probelor, îndepărtarea ARN-ului, îndepărtarea proteinelor şi a polizaharidelor, precipitarea ADN-ului, şi legarea acestuia de membranele coloanelor “spin”. Sunt efectuate multiple spălări pentru a îndepărta contaminanŃii, apoi ADN-ul este îndepărtat de pe membrană. 12
Echipament, materiale şi reactivi utilizate în experiment: - Colonii fungice în fază staŃionară (aproximativ 1 x 10 9 ), în număr de 69 pe probe, pe bazine de provenienŃă; Kitul de la Qiagen. I.3.5.2. ExtracŃia ADN-ului din fungi utilizând soluŃii La extracŃia rapidă a ADN utilizând soluŃie de PBS (fosfat tampon salin), efectuată pe un număr de 69 probe, s-a procedat în felul următor: într-un tub Eppendorf se cântăresc 120 mg Ńesut fungic, peste care se adaugă 200 µl soluŃie PBS. Probele se centrifughează la 3000 rpm timp de 20 minute, apoi se elimină supernatantul. OperaŃiunea a fost repetată de 5 ori, până la curăŃarea peletei de ADN fungic. Apoi probele s-au pus în baie de apă, la 95°C pentru spargerea peretelui celular, timp de 15 minute. Se uscă probele la etuvă 30 minute, după care se adaugă soluŃie TE (Tris-EDTA) de rehidratare a ADN-ului. Pentru metoda rapidă de extracŃie a ADN cu soluŃie NE se folosesc anumite materiale chimice, soluŃiile trebuind preparate în laborator. Materialele şi consumabilele au fost următoarele: pipete Eppendorf, cu volume reglabile; tuburi (Eppendorf); vârfuri de pipete de dimensiuni diferite (dimensiuni mari, medii şi mici); apă sterilă. I.3.6. Cuantificarea ADN prin metoda directă de determinare a purităŃii şi concentraŃiei ADN cu spectofotometrul Nanodrop ND-1000 Pentru determinarea purităŃii şi concentraŃiei ADN s-a utilizat spectofotometrul Nanodrop ND – 1000. Pentru a se putea afla concentraŃia ADN extras din probele de fungi s- a utilizat metoda directă de determinare, care presupune măsurarea densităŃii optice a probei de ADN, la lungimea de undă 260/280 nm, pe un spectrofotometru, în domeniul UV/VIS. I.3.7. Regiunea ITS de la fungi şi primerii utilizaŃi La fungi şi alte eucariote, există două locaŃii pentru ADNr: genomul nuclear şi genomul mitocondrial. Cel din urmă conŃine două gene care codifică genele mitocondriale mici şi mari ale ARNr. ADNr nuclear la fungi este organizat, în general, într-o unitate 13
Page 1 and 2: UNIVERSITATEA DE ŞTIINłE AGRICOLE
Page 3 and 4: II.6. REZULTATELE RESTRICłIEI ENZI
Page 5 and 6: diverse specii piscicole. De aici s
Page 7 and 8: Fig.1. LocaŃiile în care s-au efe
Page 9 and 10: A fost constituit un număr de 207
Page 11: Sabouraud Dextrose Broth (SDB-bulio
Page 15 and 16: Primerii folosiŃi de către noi î
Page 17 and 18: CAPITOLUL II REZULTATELE CERCETĂRI
Page 19 and 20: Mediile diametrului coloniilor de S
Page 21 and 22: laborator specifice metodologiei de
Page 23 and 24: Deoarece am utilizat în experiment
Page 25 and 26: fragmente: primul la aproximativ 45
Page 27 and 28: II.7. REZULTATE PRIVIND STUDIUL ÎN
Page 29 and 30: mai mare genetică, indivizii despr
Page 31 and 32: MenŃionăm faptul că în toate ba
Page 33 and 34: CAPITOLUL III CONCLUZII ŞI RECOMAN
Page 35 and 36: isexualis (761 pb, o identitate de
Page 37 and 38: BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ 1. Colao Ma
Page 39 and 40: 19. Oroian, T.E., 2006, SelecŃia a
Page 41 and 42: UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Page 43 and 44: SPECIES FROM SAPROLEGNIACEAE FAMILY
Page 45 and 46: The specific literature presents up
Page 47 and 48: Fig.1. The locations where the rese
Page 49 and 50: estimation of the spawns infestatio
Page 51 and 52: pellets were filtred, washed with d
Page 53 and 54: The DNA rapid extraction using PBS
Page 55 and 56: We used a comparatively mixture of
Page 57 and 58: II.1. THE RESULTS OF SAPROLEGNIA CU
Page 59 and 60: Reading time 24 48 72 n Culture med
Page 61 and 62: asexual one. We can precisely concl
Page 63 and 64:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 700pb- Fig.3. Ele
Page 65 and 66:
pairs length. The sequencing result
Page 67 and 68:
II.7. RESULTS REGARDING THE GENETIC
Page 69 and 70:
higher genetic distance, the indivi
Page 71 and 72:
We mention the fact that in al the
Page 73 and 74:
extraction have values between 1,10
Page 75 and 76:
13. In researches on the aquatic fu
Page 77 and 78:
40. Frisvad, J.C., Bridge, P.D., Ar
Page 79:
61. *** http://www.sigmaaldrich.com
show all

Rezumatul tezei de doctorat - USAMV Cluj-Napoca

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?