زﻧﺒﻮر ﻋﺴﻞ اﯾﺮان ژﻧﻮم ﻣﯿﺘﻮﮐﻨﺪري در ﺟﻤﻌﯿﺖ ﺗﻨﻮع ﻣﻨﻄﻘﻪ ي C - دانشگاه تهران
زﻧﺒﻮر ﻋﺴﻞ اﯾﺮان ژﻧﻮم ﻣﯿﺘﻮﮐﻨﺪري در ﺟﻤﻌﯿﺖ ﺗﻨﻮع ﻣﻨﻄﻘﻪ ي C - دانشگاه تهران
زﻧﺒﻮر ﻋﺴﻞ اﯾﺮان ژﻧﻮم ﻣﯿﺘﻮﮐﻨﺪري در ﺟﻤﻌﯿﺖ ﺗﻨﻮع ﻣﻨﻄﻘﻪ ي C - دانشگاه تهران
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
تنوع منطقه <strong>ي</strong> بین ژنی COI-COII ژنوم میتوکن<strong>در</strong><strong>ي</strong> <strong>در</strong> جمعیت<br />
زنبور عسل ایران<br />
1<br />
1<br />
1<br />
1<br />
1<br />
مریم صف<strong>در</strong><strong>ي</strong> شاهرود<strong>ي</strong> ، حسن مهربانی یگانه ، عباس پاکدل ، اردشیر نجاتی جوارمی و غلامعلی نهضتی پاقلعه<br />
1<br />
دانشکده کشاورز<strong>ي</strong> و منابع طبیعی کرج، <strong>دانشگاه</strong> <strong>تهران</strong><br />
*مریم صف<strong>در</strong><strong>ي</strong> شاهرود<strong>ي</strong> safdai_m2002@yahoo.com<br />
چکیده<br />
هدف این مطالعه تعیین تنوع ژنتیکی <strong>در</strong> منطقه <strong>ي</strong> بین ژنی<br />
استفاده از تکنیک<br />
COI-COII<br />
PCR-RFLP<br />
DNA صورت گرفت و منطقه بین ژنی<br />
بود. به این منظور از حدود<br />
200<br />
COI-COII<br />
ناحیه DNA<br />
تکثیر شده با<br />
DraI<br />
دو الگو<strong>ي</strong> هضمی متفاوت<br />
4<br />
ژنوم میتوکن<strong>در</strong>یایی <strong>در</strong> جمعیت ها<strong>ي</strong> مختلف زنبور عسل ایران با<br />
زنبور کارگر بالغ جمع آور<strong>ي</strong> شده از مناطق مختلف ایران استخراج<br />
<strong>در</strong> آنها با استفاده از یک جفت آغازگر عمومی تکثیر یافت. با برش آنزیمی این<br />
قطعه ا<strong>ي</strong> با اندازه ها<strong>ي</strong><br />
420 و 64 ،47 ،41<br />
و همچنین با اندازه ها<strong>ي</strong><br />
،420<br />
39 و 47 ،64<br />
DNA<strong>ي</strong> میتوکن<strong>در</strong><strong>ي</strong> بودند.<br />
کلمات کلید<strong>ي</strong>:<br />
جفت باز<strong>ي</strong> تولید شد. بر اساس نتایج الگو<strong>ي</strong> هضمی آنزیم<br />
DraI<br />
تنوع ژنتیکی- زنبور عسل- منطقه <strong>ي</strong> بین ژنی DNA<strong>ي</strong> -COI-COII میتوکن<strong>در</strong><strong>ي</strong><br />
جمعیت ها<strong>ي</strong> زنبور عسل ایرانی متعلق به گروه C خط<br />
مقدمه<br />
یکی از حشرات شناخته شده <strong>در</strong> رده بند<strong>ي</strong> حیوانات زنبور عسل است<br />
(Apis mellifera)<br />
محدودیت ها<strong>ي</strong> جغرافیایی پراکنده شده است. با استفاده از نتایج مطالعات ریخت شناسی و ملکولی،<br />
که <strong>در</strong> کل جهان با همه <strong>ي</strong><br />
26<br />
زیر گونه <strong>ي</strong> زنبور<br />
عسل شناسایی شده است که <strong>در</strong> پنج خط تکاملی جا<strong>ي</strong> می گیرند: خط اروپا<strong>ي</strong> شمالی و غربی (M)، آفریقا<strong>ي</strong> مرکز<strong>ي</strong> و جنوبی<br />
(A)، منطقه <strong>ي</strong> مدیترانه <strong>ي</strong> شمالی و اروپا<strong>ي</strong> شرقی<br />
نهایت گروه منطقه <strong>ي</strong> شرقی کشور اتیوپی<br />
، (C)<br />
خط شرق مدیترانه و خاور نزدیک و شرق خاورمیانه<br />
(O)<br />
.(3) (Y)<br />
خطوط تکاملی زنبورها<strong>ي</strong> عسل را می توان با استفاده از مطالعه <strong>ي</strong> تنوع <strong>در</strong> منطقه <strong>ي</strong> ژنومی<br />
COI-COII<br />
زیر واحد سیتوکروم اکسیداز یک و دو) از ژنوم میتوکن<strong>در</strong><strong>ي</strong> مشخص نمود. هضم این منطقه با استفاده از آنزیم<br />
و <strong>در</strong><br />
(منطقه <strong>ي</strong> بین ژنی دو<br />
DraI<br />
50<br />
هدف<br />
الگو<strong>ي</strong> هضمی <strong>در</strong> خطوط A<br />
و M<br />
از این مطالعه، بررسی تنوع ژنتیکی <strong>در</strong> مکان<br />
نشان داده است ولی <strong>در</strong> خط C تنها<br />
5<br />
COI-COII<br />
الگو<strong>ي</strong> باند<strong>ي</strong> برش یافته دیده شده است(7).<br />
بیشتر از<br />
<strong>در</strong> جمعیت زنبور عسل ایرانی است. زنبور دار<strong>ي</strong> مهاجرتی و<br />
واردات ملکه دو عامل مهم <strong>در</strong> افزایش یکنواختی، از دست دادن تنوع ژنتیکی و وارد شدن ژنها از جمعیت ها<strong>ي</strong> غیر بومی به<br />
جمعیت ها<strong>ي</strong> محلی زنبور عسل است.<br />
از تنوع ژنتیکی بین جمعیت ها می توان <strong>در</strong> مطالعات حفاظت، بهبود نژاد ها<strong>ي</strong> زنبور<br />
عسلی که به لحاظ اقتصاد<strong>ي</strong> مهم اند و دارا<strong>ي</strong> ویژگی ها<strong>ي</strong> مطلوبی چون مقاومت به بیمار<strong>ي</strong> ها و سازگار<strong>ي</strong> به شرایط خاص<br />
هستند، استفاده نمود.
مواد و روش ها<br />
نمونه گیر<strong>ي</strong> و استخراج :DNA زنبور ها<strong>ي</strong> کارگر بالغ از مناطق مختلف ایران شامل کرج (40نمونه)، چالوس<br />
(20)، گلستان<br />
،(20) اصفهان ،(40) کرمان (20)<br />
کارگر گرفته شد. زنبور ها<strong>ي</strong> عسل تا زمان استفاده برا<strong>ي</strong> استخراج<br />
سلسیوس نگهدار<strong>ي</strong> شدند.<br />
استفاده قرار گرفت.<br />
و قسمت جنوبی استان سیستان و بلوچستان(40) جمع آور<strong>ي</strong> شدند. از هر کلنی یک زنبور<br />
همچنین نمونه هایی از کلنی هایی<br />
DNA<br />
96 <strong>در</strong> اتانول<br />
<strong>در</strong>صد و <strong>در</strong> دما<strong>ي</strong><br />
-20<br />
(10)<br />
استخراج DNA<br />
از جفت پرایمر زیر تکثیر شد.<br />
از کل بدن هر زنبور بر اساس روش اسد<strong>ي</strong> و همکاران<br />
<strong>در</strong>جه <strong>ي</strong><br />
که ملکه <strong>ي</strong> آنها از کشور ترکیه وارد شده بود نیز مورد<br />
(2009)<br />
انجام گرفت. منطقه <strong>ي</strong><br />
COI-COII<br />
با استفاده<br />
Forward: 5' GGC AGA ATA AGT GCA TTG 3'<br />
Reverse: 5' CAA TAT CAT TGA TGA CC 3'<br />
برنامه <strong>ي</strong> PCR نیز به این صورت بود: مرحله <strong>ي</strong> واسرشت ساز<strong>ي</strong> اولیه<br />
چرخه شامل<br />
<strong>ي</strong> بسط نهایی<br />
آگارز<br />
دقیقه <strong>در</strong> دما<strong>ي</strong> 4<br />
94<br />
<strong>در</strong>جه <strong>ي</strong> سلسیوس، پس از آن<br />
35<br />
30 <strong>در</strong>جه برا<strong>ي</strong> 94<br />
ثانیه، دما<strong>ي</strong> اتصال46 <strong>در</strong>جه برا<strong>ي</strong><br />
45<br />
ثانیه و زمان بسط<br />
45<br />
ثانیه <strong>در</strong> دما<strong>ي</strong><br />
72<br />
دقیقه <strong>در</strong> دما<strong>ي</strong> 6<br />
72<br />
2<br />
<strong>در</strong>جه بود. مرحله<br />
<strong>در</strong>جه <strong>در</strong> نظر گرفته شد. محصولات PCR جهت اطمینان از تکثیر و کیفیت آن بر رو<strong>ي</strong> ژل<br />
<strong>در</strong>صد الکتروفورز شد و پس از رنگ آمیز<strong>ي</strong> با اتیدیوم بروماید تحت نور ماورا<strong>ي</strong> بنفش مشاهده شد.<br />
محصولات PCR<br />
صورت بود که<br />
<strong>در</strong> مرحله <strong>ي</strong> بعد با استفاده از آنزیم<br />
(TTTAAA) DraI<br />
7<br />
میکرولیتر محصول<br />
استفاده از آب مقطر استریل به<br />
2 ،PCR<br />
20<br />
مورد هضم قرار گرفتند. شرایط واکنش هم به این<br />
میکرولیتر بافر و یک میکرولیتر آنزیم استفاده شد و حجم نهایی واکنش با<br />
میکرولیتر رسانده شد. مخلوط واکنش به مدت<br />
12<br />
سلسیوس قرار داده شد. محصولات هضم برا<strong>ي</strong> مشاهده <strong>ي</strong> قطعه <strong>ي</strong> بزرگتر رو<strong>ي</strong> ژل آگارز<br />
قطعات کوچک تر بر رو<strong>ي</strong> ژل اکریل آمید<br />
نتایج و بحث<br />
آنزیم<br />
ساعت <strong>در</strong> حمام آب گرم<br />
37<br />
2/5<br />
12<br />
<strong>در</strong>صد الکتروفورز شد.<br />
نتایج حاصل از هضم محصول PCR <strong>در</strong> شکل ها<strong>ي</strong> یک و دو نشان داده شده است. <strong>در</strong> شکل یک قطعه <strong>ي</strong><br />
نشان داده شده است و <strong>در</strong> شکل شماره <strong>ي</strong> دو نیز قطعات کوچک تر نشان داده شده اند.<br />
<strong>در</strong>جه<br />
<strong>در</strong>صد و برا<strong>ي</strong> مشاهده <strong>ي</strong><br />
420<br />
DraI<br />
(185 غالب بود<br />
قطعاتی با اندازه ها<strong>ي</strong><br />
جفت باز<strong>ي</strong><br />
دارا<strong>ي</strong> سه مکان برش <strong>در</strong> منطقه <strong>ي</strong> تکثیر شده بود و دو الگو<strong>ي</strong> هضمی ایجاد نمود. <strong>در</strong> الگو<strong>ي</strong> اول که دارا<strong>ي</strong> فراوانی<br />
نمونه)، قطعاتی با طول<br />
420 و 64 ،41 ،47<br />
تولید شد و <strong>در</strong> الگو<strong>ي</strong> دوم<br />
5)<br />
39 و 47 ،64 ،420<br />
ایجاد شد. که این الگوها ویژگی خط<br />
مربوط به کشور ترکیه نیز دارا<strong>ي</strong> الگو<strong>ي</strong> باند<strong>ي</strong> مشابه با الگو<strong>ي</strong> اول بودند.<br />
پیش جنگ و همکاران<br />
C<br />
92 (2011)<br />
زنبور کارگر جمع آور<strong>ي</strong> شده از<br />
15<br />
بررسی قرار دادند. هضم این منطقه با DraI چهار قطعه <strong>ي</strong> بریده شده با طول ها<strong>ي</strong><br />
هیچ تنوعی <strong>در</strong> بین نمونه ها مشاهده نشد. جبار<strong>ي</strong> فرهود و کنس<br />
نمونه از نمونه ها<strong>ي</strong> چالوس و کرج)<br />
مدیترانه است. الگو<strong>ي</strong> هضمی نمونه ها<strong>ي</strong><br />
منطقه <strong>ي</strong> مختلف ایران به عنوان ماده <strong>ي</strong> آزمایشی مورد<br />
64 ،47 ،41<br />
(2005)<br />
و 420 جفت باز حاصل نمود.<br />
با انجام مطالعه ا<strong>ي</strong> بر رو<strong>ي</strong> نمونه ها<strong>ي</strong> زنبور عسل
جمع آور<strong>ي</strong> شده از پنج منطقه <strong>در</strong> شمال و شمال شرقی ایران، نیز نتایج مشابهی به دست آورند. ازدیل و همکاران (2009) <strong>در</strong><br />
مطالعه <strong>ي</strong> خویش که <strong>در</strong> آن از زنبورها<strong>ي</strong> عسل ایران از منطقه <strong>ي</strong> شمال غربی نیز نمونه گیر<strong>ي</strong> کرده بودند <strong>در</strong> نمونه ها<strong>ي</strong> ایرانی<br />
الگو<strong>ي</strong> باند<strong>ي</strong> با قطعات<br />
47 ،64 ،420<br />
مختلفی و از جمله دارا<strong>ي</strong> الگو<strong>ي</strong><br />
39 و<br />
41 و 47 ،64 ،420<br />
مشاهده نمودند. نمونه ها<strong>ي</strong> مربوط به کشور ترکیه <strong>در</strong> این مطالعه دارا<strong>ي</strong> الگوها<strong>ي</strong><br />
گزارش شده اند که با نتایج ما همخوانی دارد.<br />
1- شکل<br />
قطعه <strong>ي</strong> 420 جفت باز<strong>ي</strong> حاصل از هضم محصول PCR بر رو<strong>ي</strong> ژل آگارز<br />
<strong>در</strong>صد. 2/5<br />
2- شکل<br />
قطعات کوچک حاصل از هضم محصول PCR بر رو<strong>ي</strong> ژل اکریل آمید<br />
الگو<strong>ي</strong> نمونه است).<br />
12<br />
<strong>در</strong>صد (عدد پایین ستون نشان دهنده <strong>ي</strong>
1. Asadi, N. 2009. Cytogenetics and molecular genetics in animal science. Animal science<br />
research institute of Iran. Karaj. pp 57.<br />
منابع<br />
2. Ferreira, K., O. L. Silva, M. Arias and M. Del Lama. Cytochrome-b variation in Apis<br />
mellifera samples and its association with COI-COII patterns. 2009. Genetica. 135:<br />
149-155.<br />
3. Garnery, L., M. Solignac, G. Celebrano and J. M. Cornuet. 1993. A simple test using<br />
restricted PCR amplified mitochondrial DNA to study the genetic structure of Apis<br />
mellifera L., Experienta 49: 1016-1021.<br />
4. Jabbari Farhoud, H. and M. Kence. 2005. Morphometric and MtDNA analysis in honeybee<br />
populations (Apis mellifera L.) of north and northeast Iran. Proceedings of the Balkan<br />
Scientific Conference of Biology in Plovdiv. P:594-597.<br />
5. Ozdil, F., M. A. Yildiz, H. G. Hall. 2009. Molecular characterization of Turkish honey bee<br />
populations (Apis mellifera) inferred from mitochondrial DNA RFLP and sequence<br />
analysis. Apidologie 40:570-576.<br />
6. Pish Jang, J., M. Ali Yihz, B. Fakhri and A. Nobakht. 2011. A study of the diversity in COI-<br />
COII intergenic region of mitochondrial DNA in different Persian honeybee (A.<br />
Mellifera Meda). J. Basic. Appl. Sci. Res. 1:2150-2154.<br />
7. Ruttner, F. 1988. Biogeography and Taxonomy of Honeybees. Springer-Verlag, Berlin.<br />
variation in mitochondrial COI-COII intergenic region of Iranian honey<br />
bee population<br />
Maryam Safdari Shahroudi 1 , Hassan Mehrabani Yeganeh 1<br />
1 University of Agricalture and Natural Resourse, University of Tehran, Karaj<br />
* safdari_m2002@yahoo.com<br />
Abstract:<br />
The goal of This study was the determination of genetic variation in COI-COII intergenic region of<br />
mtDNA in different Iranian honeybee populations by using RFLP-PCR. DNA extraction was carried<br />
out from 200 worker honey bees, collected from different locations of Iran, and COI-COII intergenic<br />
region of the samples were amplified using a universal primer pair. Based on the results of digestion of<br />
the amplicons by DraI, the samples were separated in two different digestion profiles. The first group<br />
with 4 restriction fragments 41, 47, 64 and 420 bp was distinguished from the second group with<br />
having 39, 47, 64 and 420 bp bands. According to DraI restriction analysis, Iranian honeybees were<br />
grouped as a member of C mtDNA lineage.<br />
Keywords: genetic variation- Apis mellifera- COI-COII - mitochondrial DNA