Immunochromatographic Assay Developing of Rice ... - CRDC

Agricultural Sci. J. 42(2)(Suppl.): 645-649 (2011) ว. วิทย์. กษ. 42(2)(พิเศษ): 645-649 (2554)
การพัฒนาชุดตรวจสอบไวรัสใบหงิกของข้าวด้วย Immunochromatographic Assay
Developing of Rice Ragged Stunt Virus Test Kit Using Immunochromatographic Assay
วิชชุดา รัตนากาญจน์ 1 รัศมี ฐิติเกียรติพงศ์1 1
และ วันพร เข็มมุกด์
Rattanakarn, W. 1 , Dhitikiattipong, R. 1 and Khemmuk, W. 1
Abstract
Gold labeled IgG flow test (GLIFT) was developed as test kit for rice ragged stunt virus (RRSV) detection
based on immunochromatographic assay. Accuracy, convenience and rapid detection are the novel properties of this
technique. The GLIFT kit will be very useful for varietal screening in breeding program, forecasting and early warning of
rice ragged stunt virus epidemic. The RRSV IgG was purified and tested by dot immunobinding assay (DIBA) to obtain
the proper concentration for using in GLIFT kit. IgG was conjugated with colloidal gold and amount of 100 - 120 µl (6.6
µl/cm) of IgG conjugated gold were used for lining on 15 - 18 cm conjugated release pad (CRP). Control line and test line
were made on nitrocellulose membrane using 40 µl (2.2 µl/ cm) of goat anti-rabbit (GAR) and IgG respectively. The
appearance of color on both test line and control line indicated positive result. While no color was shown on the test line
in case of negative result. GLIFT kit were tested for their efficacy to detect RRSV from infected rice leaves and
viruliferous brown planthoppers. Satisfactory result was obtained with color gradually appeared on control line and test
line within 5 - 10 minutes.
Keywords: rice ragged stunt virus, detection, immunochromatographic assay, gold labeled IgG flow test (GLIFT), test kit
บทคัดย่อ
การนําเทคนิค Gold labeled IgG flow test (GLIFT) มาพัฒนาและปรับใช้เป็ นชุดตรวจสอบไวรัสใบหงิกของข้าว (RRSV)
ด้วยวิธี immunochromatographic assay ทีสามารถตรวจสอบได้แม่นยํา ใช้ง่าย สะดวกและอ่านผลได้รวดเร็ว ทําการเตรียมและ
ทดสอบคุณภาพ IgG ของไวรัสใบหงิก ด้วยวิธี dot immunobinding assay (DIBA) เตรียม gold conjugated IgG โดยนําอนุภาค
ทองในสารละลายอนุภาคทองแขวนลอย (colloidal gold) มาเชือมต่อกับ IgG ของ RRSV และเตรียม conjugated release pad
(CRP) โดยใช้ gold conjugated IgG ปริมาตร 100 - 120 ไมโครลิตรต่อ 15 - 18 เซนติเมตร (6.6 ไมโครลิตร ต่อเซนติเมตร) ทําเส้น
control line ด้วย goat anti-rabbit (GAR) และ test line ด้วย IgG ของ RRSV ปริมาณ 40 ไมโครลิตรต่อ 2.5 X 18 เซนติเมตร (2.2
ไมโครลิตรต่อเซนติเมตร) บนแผ่น nitrocellulose membrane เมือประกอบเป็ นชุดตรวจสอบแล้ว ทําการทดสอบกับนํ าคั นใบข้าวจาก
ต้นข้าวทีเป็ นโรคและเพลี ยกระโดดสีนํ าตาลทีมีเชื อไวรัสใบหงิก พบว่า ชุดตรวจสอบ GLIFT kit ทีได้พัฒนาปรับใช้ครั งนี สามารถ
ตรวจสอบไวรัสใบหงิกจากใบข้าวและเพลี ยกระโดดสีนํ าตาลทีมีเชื อไวรัสใบหงิกได้ ทีความเข้มข้นของสารละลายตัวอย่างมี 1 : 10
โดยสามารถทราบผลได้ภายในระยะเวลาทีรวดเร็ว คือ เส้น control line และ test line จะปรากฏสีในเวลาประมาณ 5 - 10 นาที
คําสําคัญ: ไวรัสใบหงิกของข้าว การตรวจสอบ วิธี immunochromatographic assay เทคนิค gold labeled IgG flow test (GLIFT) ชุด
ตรวจสอบ
คํานํา
การวินิจฉัยโรคพืชทีมีสาเหตุจากเชื อไวรัสในพืชบางชนิด ไม่สามารถวินิจฉัยได้ด้วยสายตาหรือวิธีการใดทีไม่ยุ ่งยาก ส่วนมาก
จําเป็ นต้องตรวจสอบด้วยเครืองมือและสารเคมีในห้องปฏิบัติการ ซึงการตรวจสอบนั นมีหลายขั นตอนและต้องใช้เวลาในแต่ละขั นตอน ทั งนี
อาจใช้เวลาหลายวันหรือหลายเดือน ดังนั นจึงมีการพัฒนาปรับใช้วิธี enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) และพัฒนาผลิตเป็ น
ELISA KIT สําหรับตรวจสอบไวรัสสาเหตุโรคของพืชเศรษฐกิจทีสําคัญหลายชนิด แต่การตรวจด้วย ELISA KIT นั นมีหลายขั นตอน และใช้
เวลาในการตรวจสอบอย่างน้อยประมาณ 3 - 5 ชัวโมง ซึงผู ้ทีตรวจสอบด้วยวิธีนี จะต้องมีทักษะและประสบการณ์ในการตรวจสอบ จึงมี
การศึกษาพัฒนาวิธีการตรวจสอบไวรัสของพืชให้สามารถตรวจสอบได้รวดเร็ว และใช้ได้ง่ายขึ น โดยนําวิธี immunochromatographic assay
ซึงอาศัยหลักการทางเซรุ่มวิทยา (serology) และการไหลของปฏิกิริยา (lateral flow technique) บนแผ่นไนโตรเซลลูโลส เมมเบรนร่วมกับวิธี
Lateral flow Test (LFT) มาใช้ เพือการตรวจวินิจฉัยโรคอย่างถูกต้อง แม่นยําและรวดเร็ว สามารถควบคุมโรคอย่างได้ผลและมีประสิทธิภาพ
สามารถดําเนินการป้ องกันกําจัดโรคได้อย่างรวดเร็วและทันต่อเหตุการณ์ การตรวจวินิจฉัยโรคพืชนอกจากจะต้องเป็ นวิธีการทีแม่นยํา และ
สะดวกแล้ว ควรทีจะสามารถใช้ตรวจสอบได้เองโดยผู ้ใช้ในทุกระดับ ซึงได้แก่ นักวิชาการ และเจ้าหน้าทีผู ้เกียวข้อง รวมทั งต้องมีราคาทีไม่
แพงมาก ทั งนี ได้มีการพัฒนาวิธีการตรวจสอบไวรัสของกล้วยไม้และไวรัสของมันฝรัง ด้วยเทคนิค gold labeled IgG flow test (GLIFT) ที
พัฒนามาจากวิธี immunochromatographic assay ทําให้การตรวจสอบไวรัสมีความสะดวกขึ นมากและอ่านผลได้ในเวลารวดเร็ว คือ ใช้เวลา
1
สํานักวิจัยและพัฒนาข้าว กรมการข้าว ลาดยาว จตุจักร กทม. 10900 โทรศัพท์ 0-2579-3693
1
Bureau of Rice Research and Deveopment, Rice Department, Ladyao, Chatuchack, Bangkok 10900

646 ปี ที 42 ฉบับที 2 (พิเศษ) พฤษภาคม - สิงหาคม 2554 ว. วิทยาศาสตร์เกษตร
ในการตรวจเพียง 5 นาที (สุรภี และคณะ, 2547; กิตติศักดิ และคณะ, 2549) นอกจากนี ยังมีการพัฒนาและนําเทคนิค GLIFT ไปปรับใช้และ
ผลิตเป็ นชุดตรวจวินิจฉัยโรคไวรัสและแบคทีเรียของพืชเศรษฐกิจทีสําคัญชนิดอืนๆ อีกหลายโรคด้วยกัน (สุรภี และคณะ, 2551)
ในกรณีของโรคข้าวทีมีสาเหตุจากไวรัสนั น โรคทีสําคัญและมีการระบาดเป็ นระยะๆ ซึงมักระบาดหลังจากมีการระบาดของ
แมลงพาหะ คือ โรคใบหงิก หรือ โรคจู ๋ (Rice ragged stunt) ทีมีสาเหตุเกิดจาก Rice ragged stunt virus (RRSV) ต้นข้าวจะแสดง
อาการของโรคใบหงิกทีเป็ นอาการเด่นของโรค (typical symptom) หลังจากทีได้รับการถ่ายทอดเชื อไวรัสจากแมลงพาหะ ประมาณ 30
วัน นอกจากโรคใบหงิกแล้ว โรคเขียวเตี ย จัดว่าเป็ นอีกโรคข้าวทีมีสาเหตุจากไวรัสทีสําคัญอีกโรคหนึง โรคเขียวเตี ยมีสาเหตุเกิดจาก
Rice grassy stunt virus ต้นข้าวจะแสดงอาการของโรคเขียวเตี ยทีเป็ นอาการสําคัญของโรค ประมาณ 15 - 20 วัน ซึงไวรัสทั ง 2 ชนิดนี
มีเพลี ยกระโดดสีนํ าตาลเป็ นแมลงพาหะนําโรค (insect vector) ทั งนี มีรายงานการระบาดของเพลี ยกระโดดสีนํ าตาลทําความเสียหาย
ตั งแต่ปลายปี 2552 และในช่วงเดือน มีนาคม - เมษายน 2553 พบการระบาดในเขตภาคกลาง ภาคเหนือตอนล่าง และภาค
ตะวันออกเฉียงเหนือบางส่วน ครอบคลุม 18 จังหวัด เป็ นพื นทีมากกว่า 2.3 ล้านไร่ โดยพบโรคใบหงิกและโรคเขียวเตี ยในแปลงนา 11
จังหวัด จากการทีต้นข้าวจะแสดงอาการของโรคใบหงิก ประมาณ 30 วัน และแสดงอาการโรคเขียวเตี ย ประมาณ 15 - 20 วัน หลังจาก
ทีได้รับการถ่ายทอดเชื อจากแมลงพาหะเชื อ และใช้เวลาต่างกันในข้าวแต่ละพันธุ ์ จึงเป็ นการยุ ่งยากในการวินิจฉัยสําหรับเจ้าหน้าทีใน
พื นที รวมทั งเกษตรกรเอง โดยเฉพาะโรคใบหงิก ซึงเกษตรกรทีไม่คุ ้นเคยกับโรคนี เสียค่าใช้จ่ายในการใส่ปุ ๋ ยและพ่นสารป้ องกันกําจัด
โรคโดยทีไม่คุ ้มค่า ทําให้เพิมต้นทุนการปลูกข้าวของเกษตรกร
การพัฒนาการตรวจสอบไวรัสสาเหตุโรคข้าว ได้แก่ ไวรัสใบหงิกของข้าว และไวรัสสาเหตุโรคข้าวอืนๆ นั น ได้มีการพัฒนา
และปรับใช้เทคนิคทางเซรุ่มวิทยาหลายวิธี ได้แก่ latex agglutination test (LAT), dot immunobinding assay (DIBA), tissue blot
และ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) โดยสามารถตรวจสอบได้ทั งจากต้นข้าวและแมลงพาหะ (Hibino และคณะ,
1982; Omura และคณะ, 1983; อมรา และคณะ, 2535) ซึงมีการนํามาใช้เพือการควบคุมโรค การทดสอบปฏิกิริยาของพันธุ ์และสาย
พันธุ ์ข้าว การคัดเลือกพันธุ ์ต้านทานโรค รวมทั งการพยากรณ์และเตือนการระบาดของโรคและแมลงพาหะ เพือลดความสูญเสีย
ผลผลิตข้าว ลดการใช้สารเคมีในการป้ องกันกําจัดแมลง และเป็ นการรักษาสภาพแวดล้อมด้วย ดังนั นจึงทําการศึกษาและพัฒนา
วิธีการตรวจสอบเชื อไวรัสใบหงิกของข้าว ด้วยวิธี imunochromatographic assay โดยการเชือมต่อแอนติซีรัม (IgG) ของไวรัสใบ
หงิกกับอนุภาคทองในสารละลายอนุภาคทองแขวนลอย (colloidal gold) ซึงเป็ นสารทีมีสีในตัวของอนุภาค สามารถแสดงผลของ
ปฏิกิริยาให้เห็นได้ชัดเจน เพือพัฒนาและปรับใช้เป็ นชุดตรวจสอบ gold labeled IgG flow test (GLIFT) ในการตรวจสอบไวรัสใบ
หงิกของข้าว ตามวิธีของ Hampton และคณะ (1990) และวิธีของกลุ ่มไวรัสวิทยา กลุ ่มงานวิจัยโรคพืช สํานักวิจัยและพัฒนาการ
อารักขาพืช (กรมวิชาการเกษตร, 2550) สําหรับให้นักวิชาการและผู ้ทีเกียวข้อง สามารถนําไปใช้ตรวจสอบได้ด้วยตนเอง โดยสามารถ
เห็นผลได้ในเวลาทีรวดเร็ว จะช่วยให้การควบคุมโรคได้ทันต่อเหตุการณ์ รวมทั งสามารถนําไปใช้ในโครงการปรับปรุงพันธุ ์ข้าว เพือ
ตรวจสอบปฏิกิริยาต่อโรคใบหงิกของพันธุ ์/สายพันธุ ์ข้าว ซึงจะช่วยประหยัดเวลาในการทดสอบ โดยทีไม่ต้องรอจนต้นข้าวแสดง
อาการของโรคอย่างเด่นชัด รวมทั งช่วยในการตรวจวินิจฉัยโรคในกรณีทีสงสัย หรือต้นข้าวทีแสดงอาการของโรคไม่ชัดเจน เพือให้
สามารถตรวจวินิจฉัยโรคได้อย่างถูกต้องและแม่นยํา
อุปกรณ์และวิธีการ
1. การสกัด Immuno gamma-globulin (IgG) ของ RRSV
เตรียมแกมมาโกลบูลินทีบริสุทธิ จากแอนติเซรัมของไวรัสใบหงิกทีผลิตได้ (วิชชุดา และคณะ, 2549) ด้วยการ cross –
absorption ระหว่างแอนติเซรัมและนํ าคั นจากใบข้าวปกติ และสกัดแยก IgG โดยเตรียมนํ าคั นจากใบข้าวปกติทีบดด้วยไนโตรเจนเหลว
และเติมสารละลาย phosphate buffer อัตรา 1 กรัมต่อ 20 มิลลิลิตร นําไปหมุนเหวียงที 6,000 รอบต่อนาที นาน 20 นาที เก็บนํ าใสมา
หมุนเหวียงที 12,000 รอบต่อนาที นาน 45 นาที เก็บตะกอนมาผสมกับนํ าใส อัตรา 1: 10 ของ buffer ทีใช้ นํามาผสมกับ แอนติเซรัม
อัตรา 0.5 : 1.0 มิลลิลิตร บ่มไว้ทีอุณหภูมิ 37ºC นาน 1 ชัวโมง นําไปหมุนเหวียงที 6,000 รอบ/นาที นาน 10 นาที นําส่วนนํ าใสมาผสมกับ
นํ าคั นใบข้าวจากต้นข้าวปกติ ปริมาตร 0.5 มิลลิลิตร บ่มทีอุณหภูมิ 37ºC นาน 1 ชัวโมง และหมุนเหวียงอีก 3 ครั ง นํามาผสมกับ
สารละลายแอมโมเนียมซัลเฟตทีอิมตัว นําไปปันที 6,000 รอบต่อนาที นาน 10 นาที นําสารละลายใส่ใน cellulose tube และ dialyse ใน
½ PBS (half strength PBS) นานข้ามคืน (overnight) เปลียน buffer ทุกๆ 6 ชัวโมง ทั งหมด 3 ครั ง นําสารละลายที dialyse แล้ว มาผ่าน
DEAE cellulose column ทีเตรียมโดยการผสม DEAE กับ ½ PBS ใส่ลงใน pipette ขนาด 10 มิลลิลิตร ทีตัดปลายและจับด้วย stand ให้
อยู ่ในลักษณะตั งฉากกับพื น โดยมีความสูงของ DEAE cellulose column ประมาณระดับ 4 - 5 มิลลิลิตร ของ pipette เก็บสารละลาย
IgG ทีผ่าน column ลงมาในหลอดทีรองรับอยู ่ ปริมาตรหลอดละ 1 มิลลิลิตร ทั งนี รักษาระดับปริมาตรของ ½ PBS ทีอยู ่ส่วนบนของ
column ให้มีปริมาตรเท่ากับความสูงของ column โดยการเติม ½ PBS เป็ นระยะๆ วัดความเข้มข้นของ IgG แต่ละหลอด ด้วย
spectophptometer ที 280 nm และปรับความเข้มข้นของ IgG ให้มีค่าเป็ น 1.4 เพือให้มีความเข้มข้นของโปรตีนเท่ากับ 1 มิลลิกรัมต่อ
มิลลิลิตร เก็บ IgG ไว้ในตู ้แช่แข็ง อุณหภูมิ –20 ºC
2. การทดสอบคุณภาพและความเข้มข้นของ IgG ของ RRSV ด้วยวิธี DIBA : ทดสอบคุณภาพของ IgG ทีความเข้มข้นต่างๆ ใน
การตรวจสอบไวรัสใบหงิก โดยวิธี dot Immunoinding assay (DIBA) ใช้ nitrocellulose membrane (NCM) รองรับปฏิกิริยา โดยการ

่
ว. วิทยาศาสตร์เกษตร ปี ที 42 ฉบับที 2 (พิเศษ) พฤษภาคม - สิงหาคม 2554 647
ทดสอบปฏิกิริยาระหว่างสารละลายของ IgG ทีเจือจางใน phosphate buffer กับนํ าคั นจากใบและกาบใบข้าวทีเป็ นโรค ความเข้มข้นของ
IgG ทีทําการทดสอบคือ 1:10, 1:100, 1:1,000, 1:5,000 และ 1:10,000 หยดนํ าคั นจากใบข้าวทีเป็ นโรคและใบข้าวปกติ (สําหรับเป็ นตัว
เปรียบเทียบ) ลงบนแผ่น NCM แล้วนําไปจุ ่มในสารละลาย phosphate buffer saline (PBS), pH 7.2 จากนั นนําแผ่น NCM ไปแช่ใน
สารละลาย IgG ทีความเข้มข้นต่างๆ ในสารละลาย PBS ทีมี Tween 20 เข้มข้น 0.5% (PBS-T) และมี Skimmed milk ผสมอยู ่ด้วยเข้มข้น
5% บ่มทีอุณหภูมิ 4 ºC นานข้ามคืน (overnight) เขย่าเบาๆ ตลอดเวลา ล้างส่วนเกินของ IgG ออก โดยแช่แผ่น NCM ในสารละลาย PBS-T
ทีมี Skimmed milk เข้มข้น 5% เขย่าเบาๆ ตลอดเวลา ทั งหมด 3 ครั ง แต่ละครั งนาน 10 นาที บ่มแผ่น NCM ในสารละลาย goat anti-rabbit
serum conjugate ทีเจือจาง 1: 5,000 นาน 2 ชัวโมง ล้างแผ่น NCM ในสารละลาย PBS-T เขย่าเบา ตลอดเวลา ทั งหมด 3 ครั ง แต่ละครั ง
นาน 10 นาที นําแผ่น NCM แช่ในสารละลาย BCIP/NBT เขย่าเบาๆ จนกระทังสีของแถบโปรตีนทีเกิดขึ นชัดเจน ล้างแผ่น NCM ในนํ ากลัน
และวางบนกระดาษซับจนแห้ง ตรวจปฏิกิริยาทีเกิดขึ น พบว่า IgG ทีผลิตได้สามารถตรวจหาไวรัสโรคใบหงิกของข้าว และค่าความเข้มข้นที
เหมาะสมในการตรวจสอบด้วยวิธี DIBA คือ 1:1,000
3. การเตรียม Gold conjugated IgG : ติดฉลาก IgG ของ RRSV ด้วยอนุภาคทอง โดยนํา IgG ของ RRSV 100 ไมโครลิตร ผสมกับ
สารละลายอนุภาคทองแขวนลอย (colloidal gold) (ของ Heron Diagnostic, บริษัทไบโอจีโนเมท จํากัด ผู ้แทนจําหน่าย) ปริมาณ 10
มิลลิลิตร นํามากวนด้วย magnetic stirrer นาน 30 นาที ทีอุณหภูมิห้อง เติมสารละลาย bovine serum albumin (BSA) ทีเข้มข้น
10% กวนเบาๆ อีก 30 นาที แล้วนําไปหมุนเหวียงเพือตกตะกอน IgG ทีติดสลากด้วยอนุภาคทอง (gold particle labeled IgG) ที
9,000 รอบต่อนาที เป็ นเวลา 10 นาที ดูดนํ าใสทิ งแล้วละลายตะกอนด้วย gold diluted buffer pH 7.4 ให้มีปริมาณ 5000 - 600
ไมโครลิตร จะมีความเข้มข้นของสารละลายเป็ น 0.5 ที OD 540 เติมsucroseในอัตรา 20% เขย่าเบาๆ ให้ละลายจนหมด
4. การเตรียมแผ่น conjugated release pad (CRP) : ตัดแผ่น CRP (วัสดุเป็ น cotton linters paper) ให้มีขนาดกว้างประมาณ 0.8
– 1.0 เซนติเมตร ยาวประมาณ 15 - 18 เซนติเมตร วางลงบนกระดาษขาวทีสะอาด ใช้พู ่กันเบอร์ 0 จุ ่ม gold conjugated IgG ป้ ายลง
บน CRP ตรงกึงกลางแผ่น โดยใช้ gold conjugated IgG ปริมาณ 100 - 120 ไมโครลิตรต่อ 15 - 18 เซนติเมตร นําไปอบแห้งที 37ºC
นาน 2 ชัวโมง ห่อด้วยอลูมินัมฟอล์ย เก็บไว้ในทีแห้ง
5. การทําเส้น test line และ control line : นําแผ่น NCM (วัสดุเป็ น S&S – AE 99, size 8 ไมโครเมตร) ขนาดกว้าง 2.5 เซนติเมตร ตัด
ให้มีความยาว 18 เซนติเมตร (ขึ นกับขนาดของ backing) ทําเครืองหมายด้วยดินสอทีด้านบนของแผ่น เป็ นตําแหน่ง control line ทีอยู
ห่างจากริมด้านบนของแผ่น NCM 1 เซนติเมตร และเส้น test line อยู ่ถัดลงมาจาก control line 0.5 เซนติเมตร ใช้ปากกาหมึกซึม (ขนาด
ของปาก 0.5 - 0.7 มิลลิเมตร) จุ ่ม goat anti-rabbit (GAR) ทีเข้มข้นอัตรา 1: 3 ปริมาณ 40 ไมโครลิตรต่อแผ่น ลากเส้น control line โดยใช้
ไม้บรรทัดวางเป็ นแนวเส้นตรง โดยลากเส้นจากซ้ายไปทางขวาช้าๆ จนสุดปลาย NCM หากปากกาแห้งให้จุ ่ม GAR ใหม่ แล้วลากเส้นต่อ
ให้ขนาดเส้นทีเปี ยกบนแผ่น NCM มีขนาดเท่าๆ กันทั งเส้น ใช้ปากกาด้ามใหม่ (ขนาดเดียวกัน) จุ ่มซับ IgG ของ RRSV ทีเข้มข้น 1
มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ปริมาณ 40 ไมโครลิตรต่อแผ่น ลากเส้น test line ปฏิบัติเช่นเดียวกันกับ control line นําไปอบแห้งที 37ºC เป็ น
เวลานาน 2 ชัวโมง
6. การประกอบชุดตรวจสอบ GLIFT kit (Figure 1): นําแผ่น backing หรือ พลาสติก ขนาด 11X18 เซนติเมตร ทีเคลือบกาวไว้ 1 ด้าน
- ลอกกระดาษปิ ดกาวตรงกลางทีตําแหน่งของ NCM ออก และวางแผ่น NCM แนบลงไปให้เรียบ
- ลอกกระดาษปิ ดกาวออกตรงตําแหน่งของ CRP วางแผ่น CRP ให้เกยทับ NCM ประมาณ 1 - 2 มิลลิเมตร แนบลงไปให้เรียบ
- ลอกกระดาษปิ ดกาวตรงตําแหน่งของ Sample application pad (SAP) ออก และวางแผ่น SAP เกยแผ่น CRP 1 - 2 มิลลิเมตร แนบลงไปให้เรียบ
- ลอกกระดาษปิ ดกาวตรงตําแหน่งของ absorbing pad (Wick) ออก และวางแผ่น Wick เกยทับแผ่น NCM 1 - 2 มิลลิเมตร แนบลงไปให้เรียบ
- ตัดด้วยทีตัดกระดาษให้มีความกว้างเป็ น 0.42 – 0.45 เซนติเมตร บรรจุชุดตรวจสอบลงตลับ ทดสอบคุณภาพกับตัวอย่างนํ าคั นพืชทีเจือจาง 1: 10 เท่า
- เก็บ GLIFT kit ไว้ในถุงอลูมินัมฟอล์ย และเก็บทีอุณหภูมิห้องทีแห้ง
หมายเหตุ ในกรณีตัวอย่างทีตรวจสอบมีไวรัสใบหงิก control line และ test line จะปรากฏสี หากไม่มีไวรัสใบหงิกจะปรากฏสีเฉพาะ
control line เท่านั น (Figure 2)
Backin
Figure 1 Diagram of GLIFT kit composition

648 646 ปี ที 42 ฉบับที 2 (พิเศษ) พฤษภาคม - สิงหาคม 2554 ว. วิทยาศาสตร์เกษตร
7. การเตรียมตัวอย่างและการทดสอบคุณภาพชุดตรวจสอบ GLIFT kit : บดตัวอย่างใบข้าวจากต้นข้าวทีเป็ นโรคใบหงิกและ
เพลี ยกระโดดสีนํ าตาลทีมีเชื อไวรัสใบหงิกในสารละลาย extraction buffer ได้แก่ phosphate buffer saline pH 7.4 และ phosphate buffer
saline pH 6.5 ทีเติม 2% PVP ตามลําดับ อัตรา 1 : 10 (ตัวอย่างใบข้าวหรือแมลง : buffer) โดยเปรียบเทียบกับตัวอย่างใบข้าวจากต้นข้าวที
ไม่เป็ นโรค (healthy plant) และเพลี ยกระโดดสีนํ าตาลทีไม่มีไวรัสใบหงิก (healthy insect) ในการทดสอบคุณภาพของชุดตรวจสอบไวรัสใบ
หงิกทีพัฒนาได้ในครั งนี โดยหยดตัวอย่างนํ าคั นใบข้าวและสารละลายแมลงลงในชุดตรวจสอบ GLIFT ตัวอย่างละ 3 - 4 หยด ตรวจผลของ
ปฏิกิริยาทีเกิดขึ น
ผลและวิจารณ์ผลการทดลอง
จากการสกัด Immuno gamma-globulin (IgG) ของ RRSV นํา IgG ทีได้มาปรับให้มีความเข้มข้นของโปรตีนเท่ากับ 1
มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร แล้วทําการทดสอบคุณภาพของ IgG ทีความเข้มข้นต่าง ๆ ในการตรวจสอบไวรัสใบหงิก โดยวิธี DIBA พบว่า IgG
ทีผลิตได้สามารถตรวจหาไวรัสโรคใบหงิกของข้าวและมีค่าความเข้มข้นทีเหมาะสมในการตรวจสอบด้วยวิธี DIBA คือ 1:1,000
นํา IgG ทีเตรียมได้ไป conjugate กับสารละลายอนุภาคทองแขวนลอย (colloidal gold) ได้เป็ น IgG ทีติดสลากด้วยอนุภาค
ทอง (gold conjugated IgG or gold particle labeled IgG) ทําการเตรียมแผ่น CRP โดยใช้ภู ่กันจุ ่มและป้ ายลงบนแผ่น CRP ปริมาณ
100 - 120 ไมโครลิตร/แผ่น (15 - 18 เซนติเมตร) แล้วนําไปอบแห้ง ที 37ºC นาน 2 ชัวโมง ห่อด้วยอลูมินัมฟอล์ย เก็บไว้ในทีแห้ง จากนั น
ได้นําแผ่น NCM มาทําเส้น test line และ control line โดยใช้ปากกาหมึกซึมจุ ่ม GAR ลากเส้น control line เป็ นแนวเส้นตรง จากซ้ายไป
ทางขวาสุดปลาย NCM แล้วใช้ปากกาด้ามใหม่จุ ่ม IgG ของ RRSV ลากเส้น test line ปริมาณ 40 ไมโครลิตร/แผ่น จากนั นนําไปอบแห้งที
37ºC เป็ นเวลานาน 2 ชัวโมง นําแผ่น CRP ทีป้ ายด้วย IgG ทีติดสลากด้วยอนุภาคทอง และแผ่น NCM ทีได้ลากเส้น test line และ
control line มาประกอบเป็ นชุดตรวจสอบ บนแผ่น backing โดยประกอบร่วมกับแผ่น SAP และแผ่น wick เป็ นชุดตรวจสอบ GLIFT kit
เมือนําชุดตรวจสอบ GLIFT kit มาทําการตรวจสอบไวรัสใบหงิกในนํ าคั นจากใบข้าวของต้นข้าวทีเป็ นโรคใบหงิก ต้นข้าวปกติ และ
สารละลายไวรัสทีบริสุทธิ ทีเจือจางในสารละลาย phosphate buffer pH 7.4 อัตรา 1 : 100 พบว่า ชุดตรวจสอบ GLIFT kit ทีพัฒนาในครั งนี
สามารถตรวจสอบไวรัสใบหงิกจากตัวอย่างนํ าคั นใบข้าวทีเป็ นโรคใบหงิกทีความเข้มข้น 1 : 10 และสารละลายไวรัสทีบริสุทธิ ทีความเข้มข้น
1 : 100 โดย test line ปรากฏสีขึ นมา เช่นเดียวกับ control line ภายในระยะเวลาประมาณ 5 นาที โดยทีตัวอย่างนํ าคั นใบข้าวจากต้นข้าว
ปกติ ปรากฏเฉพาะ control line (Figure 3) ทั งนี ปฏิกิริยาทีเกิดขึ นยังไม่ชัดเจนเท่าทีควร อาจเนืองจากในขั นตอนการสกัด IgG ของ RRSV ที
ใช้สารละลายแอมโมเนียมซัลเฟตทีอิมตัวในการตกตะกอน IgG แล้วทําการ dialyse ใน ½ PBS นั น แอมโมเนียมซัลเฟตละลายออกไปไม่
หมด จึงมีผลกับการ conjugate ของ IgG กับอนุภาคทอง เนืองจาก colloidal gold ตกตะกอน ทําให้การ conjugate ของ IgG และอนุภาค
ทองไม่ดีเท่าทีควร สังเกตได้จากสีของสารละลายทีเปลียนไป ปฏิกิริยาทีเกิดขึ นจึงไม่ชัดเจนเท่าทีควร ทั งนี ควรนํา IgG ไป dialyse ใน ½
PBS ใหม่ เพือทําให้ IgG สะอาดและมีคุณภาพขึ น นอกจากนี ในขั นตอนการเตรียม Gold conjugated IgG ควรเพิมเวลามากขึ นในการ
เชือมต่อ(conjugate) โดยกวนสารละลายของ IgG และสารละลายอนุภาคทองแขวนลอย ทั งก่อนและหลังเติม BSA เป็ นเวลา 1 ชัวโมง
เพือให้เกิดการสัมผัสของ IgG และอนุภาคทองดีขึ น ทําให้การติดฉลากดีขึ นด้วย แต่ชุดตรวจสอบนี สามารถตรวจพบไวรัสใบหงิกในตัวอย่าง
นํ าคั นแมลง ทั งนี เนืองจากช่วงเวลา
8 วัน ทีแมลงดูดกินต้นเป็ นโรคนั น เชื อไวรัสได้เพิมปริมาณมากเพียงพอทีแมลงจะถ่ายทอดโรคได้อย่างมี
ประสิทธิภาพ (Figure 3)
สรุปผล
การพัฒนาชุดตรวจสอบ GLIFT kit เพือตรวจสอบไวรัสใบหงิกของข้าวในครั งนี สามารถตรวจสอบไวรัสใบหงิกจากตัวอย่างนํ าคั นใบข้าวทีเป็ น
โรคใบหงิกทีความเข้มข้น 1 : 10 โดย test line และ control line ปรากฏสีภายในระยะเวลาประมาณ 5 นาที ดังนั นเทคนิค Gold labeled IgG flow test
(GLIFT) นี สามารถนํามาปรับใช้ในการผลิตชุดตรวจสอบ GLIFT kit เพือตรวจหาไวรัสใบหงิกของข้าว เพือให้นักวิชาการ และเจ้าหน้าทีทีเกียวข้อง
สามารถนําไปใช้ในการตรวจวินิจฉัยโรคใบหงิกของข้าวได้ด้วยตนเอง รวมทั งสามารถนําไปใช้ในโครงการปรับปรุงพันธุ ์ข้าวต้านทานโรคใบหงิก และมี
ความเป็ นไปได้ทีจะพัฒนาให้สามารถตรวจสอบเพลี ยกระโดดสีนํ าตาลทีนําไวรัสใบหงิก สําหรับเตือนการระบาดของโรคใบหงิก รวมทั งพัฒนาชุด
ตรวจสอบโรคไวรัสข้าวอืนๆ ด้วย
คําขอบคุณ
ขอขอบคุณ นางสาวเยาวภา ตันติวานิช และนางณัฎฐิมา โฆษิตเจริญกุล กลุ ่มวิจัยโรคพืช สํานักวิจัยการอารักขาพืช กรม
วิชาการเกษตร ทีให้คําปรึกษาและแนะนําในการดําเนินงานทดลองครั งนี
เอกสารอ้างอิง
กรมวิชาการเกษตร, 2550, การผลิตชุดตรวจสอบไวรัสพืช (GLIFT kit) เพือใช้เอง, เอกสารประกอบการฝึ กอบรม, 13 - 14 ธันวาคม 2550, กลุ ่มงานไวรัส
วิทยา กลุ ่มงานวิจัยโรคพืช สํานักวิจัยและพัฒนาการอารักขาพืช กรมวิชาการเกษตร, 50 หน้า.
กิตติศักดิ กีรติยะอังกูร สุรภี กีรติยะอังกูร และเยาวภา ตันติวานิช, 2549, GLIFT Kit เพือการตรวจสอบเชื อ Potato Virus Y ในมันฝรัง, วารสารวิชาการ
เกษตร, 24 (2): 168-177.
วิชชุดา รัตนากาญจน์ ดารา เจตนะจิตร และเยาวภา ตันติวานิช, 2549, การผลิตแอนติเซรัมสําหรับตรวจสอบไวรัสโรคใบหงิกของข้าว, หน้า 95-99, ใน
: เรืองย่อ การประชุมวิชาการข้าวและธัญพืชเมืองหนาว, สถาบันวิจัยข้าวกรมวิชาการเกษตร.
สุรภี กีรติยะอังกูร วันเพ็ญ ศรีทองชัย ณัฏฐิมา โฆษิตเจริญกุล และเยาวภา ตันติวานิช, 2551, โครงการผลิต GLIFT kit เพือตรวจวินิจฉัยโรคไวรัสและ
แบคทีเรียของพืชเศรษฐกิจเชิงพานิชย์, รายงานผลวิจัยเรืองเต็ม กรมวิชาการกษตร, 67 หน้า.

ว. วิทยาศาสตร์เกษตร ปี ที 42 ฉบับที 2 (พิเศษ) พฤษภาคม - สิงหาคม 2554 649 647
สุรภี กีรติยะอังกูร ขนิษฐา วงศ์วัฒนารัตน์ และกิตติศักดิ กีรติยะอังกูร, 2547, ชุดตรวจสอบโรคไวรัสกล้วยไม้ในกล้วยไม้, วารสารโรคพืช, 18(12): 1-14.
อมรา สนิมทอง เมธี ปุตตะ ดารา เจตนะจิตร วิชชุดา รัตนากาญจน์ จรรยา อารยาพันธ์ และสมคิด ดิสถาพร, 2535, การตรวจสอบปริมาณแมลงพาหะ
นําเชื อไวรัสของข้าวด้วยวิธีทางเซรุ ่มวิทยา, หน้า 64-71, ใน: รายงานผลงานวิจัย พ.ศ. 2535, กลุ ่มงานวิจัยโรคข้าวและธัญพืชเมืองหนาว กอง
โรคพืชและจุลชีววิทยา กรมวิชาการเกษตร.
Hampton, H., Ball E. and Boer S.D., 1990, Serological Methods for Detection and Identification of Viral and Bacterial Plant Pathogens,
The American Phytopathological Society, St. Paul, Minnesota, U.S.A. 389 p.
Hibino, H. and Kimura, I., 1982. Detection of Rice Ragged Stunt Virus in Insect Vector by Enzyme-linked Immunosorbent Assay,
Phytopathology 72: 656-659.
Omura, T., Minobe, Y., Kimura I., Hibino, H., Tsuchizaki, T. and Saito, Y., 1983, Improved Purification Procedure and RNA Segments of
Rice Ragged Stunt Virus. Annals of the Phytopathological Society of Japan, 49(5): 670-675.
Control line
Test line
Sample sap
Positive
Negative
Figure 2 Diagram of Gold labeled IgG flow test (GLIFT)
a
e
a
b
c
d
e
f
Figure 3 GLIFT kit for RRSV detection
a : colloidal gold
b : preparing of gold conjugated IgG pad
c : GAR and RRSV-IgG lining d,e,f : assemble for GLIFT stripe
g : RRSV detection from sap of diseased plant and viruliferous insect
h : RRSV-rice leaves and viruliferous insect saps are positive result
g
h