Besiyeri

BakterilerinÜretilmesiDr. Banu SANCAK

Mikrobiyal ÜremeÜreme = Hücrelerin sayısındaartma

Bakteri üremesi icingerekli olan faktörlernelerdir?

BAKTERİ ÜREMESİ İCİN GEREKLİA.Fiziksel faktörler:OLAN FAKTÖRLER1. Sıcaklık2. pH3.Ozmotik basınçB. Kimyasal faktörler1. Karbon2. Nitrojen, sülfür, fosfor3. Oksijen4. Mineraller: K, Mg, Ca…5. Büyüme fakterleri: vitaminler,a.a.ler, pürin, pirimidin

Bakterilerilaboratuvar koşullarındaüretebiliyor muyuz?Neden?

1. Canlı Ortamlar1) Deney hayvanları:Kobay, fare, sıçan, hamster, tavşan ve maymun.2) Embryonlu yumurta:Sarı kese, amniyotik zar, allantoik boşluk,embryo.3) Hücre kültürleri:Hep-2, HeLa, Vero

2. Cansız OrtamlarBesiyerleri

Fiziksel özelliklerine göreBesiyerleriKatı besiyerleriYarıkatı besiyerleriSıvı besiyerleri

Agar1843 – 1910ROBERT KOCH‣ Experimented with medium to grow bacteria on.‣ He tried gelatin, but it did not work.‣ Wife of colleague recommended agar (a gelatinlikeproduct derived from seaweed).‣ Didn’t melt, and bacteria couldn’t digest it.‣ He could also add various nutrients necessary togrow certain organisms.‣ Koch (pronounced Coke) originated use of a two partdish for growing bacteria (______ ______named after Julius Petri, a Germanbacteriologist), and a technique for isolating purebacterial colonies.

Agar• Kompleks polisakkarit• 100°C :sıvı, ~40°C katılaşırKatı (%2-3 agar)Yarıkatı (%0.3-0.5 agar)

Fiziksel özelliklerine göreBesiyerleriKatı (%2-3 agar) : Koloni oluşumuYarıkatı (%0.3-0.5 agar): HareketSıvı:Tortu, zar oluşması, bulanıklık

Besiyerleri

• KolonilerindeğerlendirilmesiKatı besiyeri

Yarı-katı besiyeriHareket özelliği• Non motile bacteriawill only be found atthe site of inoculation• Motile bacteria swim around goeverywhere

Sıvı BesiyeriIt is used as• enrichment media• biochemical testingmedia• Blood culture media

Amaçlarına göre besiyerleri1. Temel (basit)2. Zenginleştirici3. Seçici5. Ayırt edici6. Transport7. Saklama

1. Temel/Basit besiyeri♪ Buyyon (nutrient broth)Pepton %1, et suyu %1, NaCl %0.05♪ Adi agar (nutrient agar)%2-3 agar eklenmiş buyyon

2. Seçici besiyeri İstenmeyen bakterilerin inhibisyonu Antibiyotik, safra tuzu, boya …Salmonella-Shigella agarMc Conkey agar, EMB agar, Endo agar

2. Seçici besiyeriSalmonella-Shigella agar

gr/LSığır eti özütü:……… 5Pepton:……………………. 5Laktoz:……………………. 10Safra tuzları…………. 8.5Sodyum sitrat………. 8.5Sodyum tiyosülfat… 8.5Ferrik sitrat:…………. 1Nötral kırmızısı:…… 0.025Brillant yeşili:………. 0.33 mgAgar………………………… 13.5LactoseLactose fermenterAcidNeutral red Pink coloniesH2S + Ferric ammonium citrateFerrous sulfideBlack precipitate

2. Seçici besiyeriEMB (Eosin Methylene Blue)dyes inhibit Gram (+) bacteriaselects for Gram (-) bacteriaG.I. Tract infections caused by Gram (-) bacteriaGram negatif bakterileri üretir

3. Ayırt edici besiyeri Belli özelliklere göre bakterilerinbirbirinden ayırt edilmesini sağlar

gr/LPepton: …………………… 10Laktoz: ……………. 10K 2 HPO 4 : …………………. 2Eozin Y:…………………… 0.4Metilen mavisi:……… 0.06Agar: ……………………… 15pH:6.8

Eosin Methylene Blue (EMB)AgarE. colihttp://www.cat.cc.md.us/courses/bio141/E.labmanua/lab3/embeacolony.htmlaerogenesASİT oluşumu: pembe koloni (Enterobacter aerogenes)ASİT: metalik refle (E. coli)Laktoz fermentasyonu (-): renksiz (S. typhimurium)S. TyphimuriumP. aeruginosa

MacConkey's (MAC)MacConkey’s media is both selective & differential.1. Selective because it only grows Gram-negativebacteria. Inhibits the growth of Gram-positivebacteria.2. Differential because neutral red (pH-sensitivedye) and lactose (type of sugar) have been addedto media.- Bacteria that use lactose for food (lactose fermenters),produce acidic metabolites that trigger the pHsensitive dye to turn pink.- So lactose fermenting bacteria will grow in bright pinkcolonies while non-lactose fermenters will becolorless and clear.Enteric bacteria are the most frequently encounteredbacteria isolated from many types of clinical specimens.They are most commonly lactose fermenters.

3. Ayırt edici besiyeriEMB, Endo by: Laktoz (+) ve (-) bakterilerin ayrımı

3. Ayırt edici besiyeriKanlı agar: Hemoliz özelliği kullanılarak beta ve alfahemolitik Streptokokların ayrımı27

Blood agar (BAP)Most specimens received in a clinical microbiology lab areplated onto Blood Agar. It is an enriched medium thatwill grow even fastidious bacteria.Also contains 5% sheep blood.This media is not selective. It is enriched and differential:Certain bacteria produce enzymes called ___________thatact on red cells to produce either:* ______ hemolysis: Enzymes lyse the blood cells completely,producing a clear area around the colony.* _______ hemolysis: Incomplete hemolysis produces a greenishdiscoloration around the colony.* _______ hemolysis: No effect on the red cells.Blood agar is usually inoculated from a patient’s throat swab.Microbiologist are trying to detect Group A beta hemolyticStreptococcus pyogenes (a Gram-positive cocci-shapedbacteria that causes Beta hemolysis on blood agar.)

selective &differentialmedia29

4. Zenginleştirici besiyeri Üreyebilmek için kan, serum gibi maddelere ihtiyaç gösteren Özellikle nazlı bakteriler içinKanlı agarÇikolata agar: Haemophilus influenzae, Neisseria sppSelenit FbesiyeriÇikolata agarKanlı agar (%5 kan)30

5. Transport besiyeri Amies besiyeri Stuart besiyeri Cary- Blair besiyeri

gr/LSodyum tiyoglikolat…… 1.5Sodyum Klorür……………. 5Disodyum Fosfat……….. 1.1Agar……………………………… 5AmiesStuartpH: 8.5 V.choleraetransportunda kullanılabilir

gr/LPepton……………………… 10Sodyum Klorür……….. 10pH: 8.5Kültür gecikecekse(> 6 saat) Cary Blairtercih edilmeli

6. Saklama besiyerleri Gliserollü triptik soy buyyon Gliserollü beyin kalp infüzyon buyyon

Major Contribution to CultureMedia

Besiyerlerineekim yöntemlerinelerdir?

Ekim Yöntemleri• Plak üzerine tek koloni ekim yöntemi• Tüpte sıvı besiyerine ekim yöntemi• Tüpte yarıkatı besiyerine ekim yöntemi• Tüpte katı besiyerine ekim yöntemi

Özeİnokulasyonda kullanılanaraçlar– Yuvarlak (Katı besiyerine ekim)– İğne (tüpte sıvı ve katı besiyerlerine ekim)– Çengel (küf cinsi mantar ekimi) Eküvyon

Streak Plate

Tek koloni ekim yöntemi

Tek koloni ekim yöntemi

Tek koloni ekim yöntemi

1. Aerop ve fakültatif anaeropkültür yöntemleri• Etüv (normal atmosfer)• Karbondioksitli etüv (%5-10CO 2 )• Mumlu kavanoz (%5-10 CO 2 )– 18-24 saat, 37 °C’de

2. Mikroaerofilik bakterilerinüretilmesiMumlukavanoz%1-4 O 2%5-10 CO 2 (KAPNOFİLİK)MikroaerofillerBrucella abortusCampylobacter jejuniGrow best under reduced O 2 levels and increased CO 2 levelsNormal Atmosphere:21 % O 2, 0.3 to .03 % CO 2

3. Anaerobik KültürMetodları1 .Redükleyici madde(Tiyoglikolatlı besiyeri)2. Anaerobik kavanoz3. Anaerobik kabin

3. Anaerobik KültürMetodlarıTiyoglikolatlıbesiyeri• O 2 girişini önlemek için redükleyici ajanlar içerir– Tiyoglikolik asit, sistein,– Birçok mikroorg.nın üremesi için zengin besiyeri• O 2 tüpün 1/3 üst kısmına kadar penetre olmaktadır• Tiyoglikolik asit (TGA): organik bir bileşik: HSCH 2 CO 2 H.• thiol (mercaptan) + carboxylic acid ‘den mg.• HAVA VARLIĞINDA okside olur:[SCH 2 CO 2 H] 2 .

3. Anaerobik KültürMetodlarıAnaerobikkabin

3. Anaerobik KültürMetodlarıAnaerobikkavanoz

Üreme Özellikleri

Sıvı besiyerinde üreme özellikleri1. Yüzeyde halka ya dazar (ring or pellicle)oluşumu2. Flokülent (küçük parçalar)3. Bulanıklık4. Sediment

Katı besiyerindeüreme özelliklerinedir?

Koloni Özellikleri• Koloni büyüklüğü• Koloni biçimi• Koloni yapısı• Koloni rengi• Koloni kokusu• Hemolitik aktivitesi

FYI

Colonial MorphologyShapeEdgeElevationSizeChromogenesisOpacitySurfaceConsistencyEmulsifiabilityOdor54

55Shape Edge Elevation

Koloni TipleriS (Smooth) düzgün koloni– Düzgün kenarlı, yuvarlak, homojengörünümlü, hafif kabarık koloniler.– Örnek: Staphylococcus aureus

Koloni TipleriR (Rough) kaba koloni– Düzgün olmayan, kenarları girintili, yüzeyiburuşuk veya granüllü koloniler– Örnek: Mycobacterium tuberculosis

M (Mucoid) koloniKoloni Tipleri– Düzgün,yapışkan, parlak koloniler– Örnek: Klebsiella pneumoniae

• Bacillus subtilis– Colony shape and size: irregularMargin (edge): undulate (wavy)Elevation: umbonateColor: white, dullTexture: dry (or rough).• Staphylococcus aureus– Colony shape and size: circularMargin (edge): entireElevation: corvexColor: yellowTexture: butyrous (buttery)59

Bakterilerin hemoliz özelliği• Alfa hemoliz– Koloni çevresinde yeşilimsirenk değişikliği• Beta hemoliz– Koloni çevresinde şeffafrenk değişikliği

Bakterilerin hemoliz özelliği• Gama hemoliz– Koloni çevresinde renk değişikliğigörülmemesi

The Gram StainCrystalvioletGram'siodineDecolorise withacetoneCounterstain withe.g. methyl redGram-positivesappear purpleGram-negativesappear pink

Gram boyamaPreparat hazırlamaKristal viyole ile boyamaTüm hücreler boyayı alırlarLugol ile boyamaTüm hücreler mavi-siyah boyanırEtil alkol ile dekolorizasyonKarşıt boya ile boyama-Sulu fuksin

Gram pozitifGram negatif

Gram Staining Steps1. Crystal violet acts as the primary stain. Crystal violet mayalso be used as a simple stain because it dyes the cellwall of any bacteria.2. Gram’s iodine acts as a mordant (Helps to fix theprimary dye to the cell wall).3. Decolorizer is used next to remove the primary stain(crystal violet) from Gram Negative bacteria (those withLPS imbedded in their cell walls). Decolorizer iscomposed of an organic solvent, such as, acetone orethanol or a combination of both.)4. Finally, a counter stain (Safranin), is applied to stainthose cells (Gram Negative) that have lost the primarystain as a result of decolorization Dr.T.V.Rao MD67

Gram staining• Named after HansChristian Gram,differentiatesbetween Grampositivepurple andGram-negativepink stains and isused to identifyDr.T.V.Rao MD68certain pathogens.

Staining• cationic dyes - basic, with positive chargeson the chromophore• anionic dyes - acidic, with negativecharges on the chromophore• surfaces of microbes are negativelycharged and attract basic dyes – positivestaining.• negative staining – microbe repels dye &it stains the background69