Tổng quan về các kỹ thuật phân tích sử dụng trong thiết lập chất chuẩn gốc (primary standard)

https://twitter.com/daykemquynhon 

plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 

www.facebook.com/daykem.quynhon 

http://daykemquynhon.blogspot.com 

http://daykemquynhon.ucoz.com 

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / 

Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định 

BỘ Y TẾ 

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 

VÕ THỊ TÚ QUYÊN 

TỔNG QUAN VỀ CÁC KỸ THUẬT PHÂN 

TÍCH SỬ DỤNG TRONG THIẾT LẬP 

CHẤT CHUẨN GỐC 

(PRIMARY STANDARD) 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ 

DIỄN ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN 

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM 

HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO) 

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/ 

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN 

HÀ NỘI - 2018 

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú 

www.facebook.com/daykemquynhonofficial 

www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial





BỘ Y TẾ 

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 




VÕ THỊ TÚ QUYÊN 

Mã sinh viên: 1301348 

TỔNG QUAN VỀ CÁC KỸ THUẬT PHÂN 

TÍCH SỬ DỤNG TRONG THIẾT LẬP 

CHẤT CHUẨN GỐC 

(PRIMARY STANDARD) 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ 

Người hướng dẫn: 

NCS.ThS. Nguyễn Lâm Hồng 

Nơi thực hiện: 


Bộ môn Hóa <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> & Độc chất 





HÀ NỘI - 2018 








LỜI CẢM ƠN 




Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ 

thầy cô, gia đình và bạn bè. Đến nay khi khóa luận đã hoàn thành, tôi xin phép được bày 

tỏ sự biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến họ. 

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và sự kính trọng đến NCS.ThS. 

Nguyễn Lâm Hồng - Giảng viên Bộ môn Hóa <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> & Độc chất, người thầy đã trực 

tiếp tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi hoàn 

thành khóa luận. Tôi cũng xin cảm ơn HVCH. Đào Tú Anh vì đã dành thời gian tra 

cứu, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình tìm tài liệu. 

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến <strong>các</strong> thầy cô trong Bộ môn Hóa <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> 

& Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã <strong>quan</strong> tâm, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa 

qua. 

Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, toàn thể <strong>các</strong> thầy cô giáo và 

cán bộ nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã luôn tận tình chỉ bảo, 

giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại đây. 

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè - những 

người đã luôn đồng hành, cổ vũ và động viên tôi trong học tập và trong cuộc sống. 

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018 

Sinh viên 

Võ Thị Tú Quyên 













MỤC LỤC 




DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 

DANH MỤC CÁC BẢNG 

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ 

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1 

CHƯƠNG 1. KHÁI NIỆM VỀ CHẤT CHUẨN GỐC ................................................... 2 

1.1. Khái niệm <strong>về</strong> chất chuẩn đối chiếu .................................................................... 2 

1.2. Phân loại chất chuẩn đối chiếu hóa học: ............................................................ 2 

1.2.1. Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc (primary chemical reference standards - 

PCRS) .................................................................................................................... 2 

1.2.2. Chất chuẩn đối chiếu hóa học thứ cấp (secondary chemical reference 

standards - SCRS) ................................................................................................. 3 

1.3. Hướng dẫn quy trình thiết lập chất chuẩn gốc ................................................... 4 

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN CÁC KỸ THUẬT XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU NHẬN 

DẠNG CHẤT CHUẨN GỐC ....................................................................................... 10 

2.1. Mô tả vật lý ...................................................................................................... 10 

2.1.1. Kiểm tra cảm <strong>quan</strong> .................................................................................... 10 

2.1.2. Kính hiển vi <strong>quan</strong>g học ............................................................................. 10 

2.1.3. Xác định điểm chảy ................................................................................... 10 

2.1.4. Góc quay cực riêng .................................................................................... 10 

2.2. Bộ phổ nhận dạng <strong>về</strong> cấu trúc.......................................................................... 11 

2.2.1. Kỹ <strong>thuật</strong> <strong>quan</strong>g phổ hồng ngoại (IR) ......................................................... 11 

2.2.2. Kỹ <strong>thuật</strong> <strong>quan</strong>g phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) ........................ 12 

2.2.3. Kỹ <strong>thuật</strong> phổ khối lượng (MS) .................................................................. 13 

2.2.4. Kỹ <strong>thuật</strong> phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) .......................................... 15 

2.2.5. Phân <strong>tích</strong> nguyên tố ................................................................................... 16 


2.2.6. Nhiễu xạ tia X ............................................................................................ 16 

CHƯƠNG 3. TỔNG QUAN CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỘ TINH KHIẾT NGUYÊN 

LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GỐC .................................................................... 17 

3.1. Nguồn gốc và <strong>phân</strong> loại tạp chất trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc . 17 















3.1.1. Nguồn gốc tạp chất .................................................................................... 17 

3.1.2. Phân loại tạp chất ...................................................................................... 17 

3.2. Các <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> xác định tạp chất trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc .... 19 

3.2.1. Kỹ <strong>thuật</strong> xác định gián tiếp: ...................................................................... 19 

3.2.2. Kỹ <strong>thuật</strong> xác định độ tinh khiết trực tiếp ................................................... 37 

3.2.3. Kết hợp cả 2 <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> xác định độ tinh khiết trực tiếp và gián tiếp .......... 39 

CHƯƠNG 4. TÌNH HÌNH THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GỐC TRÊN THẾ GIỚI VÀ 

Ở VIỆT NAM ................................................................................................................ 40 

4.1. Tình hình thiết lập chất chuẩn gốc trên thế giới .............................................. 40 

4.2. Tình hình thiết lập chất chuẩn gốc tại Việt Nam ............................................. 41 

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................................... 43 

1.1. Kết luận ............................................................................................................ 43 

1.2. Đề xuất ............................................................................................................. 43 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 

PHỤ LỤC 













DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 




Kí hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt 

AAS Atomic Absorption Spectrometry Quang phổ hấp thụ nguyên tử 

ACN Acetonitrile Acetonitril 

APCI 

ASEAN 

CCĐC 

Atmospheric Pressure Chemical 

Ionization 

Association of Southeast Asian 

Nations 

Ion hóa hóa học ở áp suất khí 

quyển 

Hiệp hội <strong>các</strong> quốc gia Đông Nam 

Á 

Chất chuẩn đối chiếu 

CE Capillary Electropherosis Điện di mao quản 

CEC Capillary Electrochromatography Điện sắc ký mao quản 

CIEF Capillary Isoelectric Focusing Điện di mao quản hội tụ đẳng điện 

CITP Capillary Isotachophoresis Điện di mao quản đẳng tốc 

CZE Capillary Zone Electrophoresis Điện di mao quản vùng 

DAD Diode Array Detector Detector mảng diod 

DMF N,N-dimethylformamide N,N-dimethylformamid 

DMI 1,3-dimethyl- 2-imidazolidinone 1,3-dimethyl- 2-imidazolidinon 

DSC Differential Scanning Calorimetry Quét nhiệt vi sai 

EDQM 

European Directorate for the 

Quality of Medicine -HealthCare 

Hội đồng Châu Âu <strong>về</strong> chất lượng 

thuốc 

EI Electron Impact Ion hóa bằng dòng electron 

EOF Electroendosmotic Flow Dòng điện thẩm 

EPRS 

European Pharmacopeia Reference 

Substances 

Chất chuẩn đối chiếu Dược điển 

Châu Âu 

ESI Electrospray Ionization Ion hóa bằng tia điện 


FAAS 

Flame Atomic Absorption 

Spectrometry 

GC Gas Chromatography Sắc ký khí 

Nguyên tử hóa bằng ngọn lửa 















GMP Good Manufacturing Practices Thực hành tốt sản xuất thuốc 

HL 

HĐDĐ 

HPLC 

ICH 

ICP-MS 

ICRS 

High Performance Liquid 

Chromatography 

International Conference on 

Harmonisation of Technical 

Requirements for Registration of 

Pharmaceuticals of Human Use 

Inductively Coupled Plasma- Mass 

Spectroscopy 

International Chemical Reference 

Substances 

Hàm lượng 

Hội đồng Dược điển 

Sắc ký lỏng hiệu năng cao 

Hội nghị quốc tế <strong>về</strong> hài hòa <strong>các</strong> 

yêu cầu <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> để đăng ký dược 

phẩm <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> cho con người 

Quang phổ plasma cảm ứng kết nối 

phổ khối lượng 

Chất chuẩn đối chiếu quốc tế 

IP International Pharmacopoeia Dược điển quốc tế 

IR Infrared Radiation Quang phổ hồng ngoại 

ISO 

International Organization for 

Standardization 

Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế 

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện 

LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng 

MEKC 

Micellar Electrokinetic 

Chromatography 

Sắc ký mixen điện động 

MS Mass Spectroscopy Phổ khối lượng 

NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hật nhân 

NP-HPLC Normal Phase-High Performance 

PCRS 

Liquid Chromatography 

Primary Chemical Reference 

Standards 

Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha 

thuận 

Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc 

PDE Permitted daily exposure Liều phơi nhiễm cho phép mỗi 


ngày 

Ph.Eur European Pharmacopoeia Dược điển Châu Âu 

PTN 

Phòng thí nghiệm 















qNMR 

Quantitative Nuclear Magnetic 

Resonance 

RP-HPLC Reversed Phase-High Performance 

S 

SCRS 

TCCS 

Liquid Chromatography 

Secondary Chemical Reference 

Standards 

Cộng hưởng từ hạt nhân định 

lượng 

Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo 

Diện <strong>tích</strong> 

Chất chuẩn đối chiếu thứ cấp 

Tiêu chuẩn cơ sở 

TGA Thermogravimetric Analysis Phân <strong>tích</strong> nhiệt trọng lượng 

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng 

TOF Time- of- Flight Analyser Bộ <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> thời gian bay 

USPRS 

United States Pharmacopeia 

Reference Substances 

Chất chuẩn đối chiếu Dược điển 

UV-VIS Ultraviolet - Visible Spectroscopy Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả 

VKNTTƯ 

Mỹ 

kiến 

Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung 

Ương 

WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới 













DANH MỤC CÁC BẢNG 




Bảng 4.1 So sánh kết quả độ tinh khiết thu được thông qua DSC với kết quả độ tinh 

khiết thu được thông qua sắc ký và <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> khác .................................. 11 













DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ 




Hình 3.1 Hình ảnh <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> MEKC của một mẫu muối natri amoxicillin .............PL-2 

Hình 4.1 Phổ IR của 1,5 mg Indinavir số kiểm soát 105231 ……………………...PL-3 

Hình 4.2 Phổ UV của Indinavir số kiểm soát 105231……………………………...PL-4 

Hình 4.3 Sắc ký đồ của Indinavir số 105231 được theo dõi ở bước sóng 220 nm....PL-7 













ĐẶT VẤN ĐỀ 




Chất chuẩn nói chung và chất chuẩn gốc nói riêng có vai trò rất <strong>quan</strong> trọng trong 

lĩnh vực kiểm tra chất lượng, giám sát chất lượng nguyên liệu làm thuốc và chế phẩm 

thuốc của ngành Dược. Ngoài ra nó còn được dùng để đánh giá thử nghiệm thành thạo 

cho <strong>các</strong> kiểm nghiệm viên của <strong>các</strong> PTN muốn đăng kí tham gia làm PTN thành viên 

trong <strong>các</strong> chương trình hợp tác thiết lập chất chuẩn của Trung tâm hợp tác <strong>về</strong> CCĐC của 

WHO hay Hội đồng Dược điển Mỹ, Ủy ban đối chiếu của ASEAN, Hội đồng Dược điển 

Châu Âu [41]. 

Hiện nay, <strong>các</strong> chất chuẩn <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> cho công tác kiểm nghiệm và nghiên cứu ở Việt 

Nam thường được mua từ <strong>các</strong> nguồn chất chuẩn nước ngoài như Hội đồng Dược điển 

Mỹ, Anh, Châu Âu,… (USPRS, BPCRS, EPCRS, ICRS), <strong>các</strong> hãng hóa chất lớn (Merck, 

Sigma Aldrich,…); chất chuẩn quốc gia được thiết lập trong nước tại VKNTTƯ và Viện 

Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM, chất chuẩn làm việc do <strong>các</strong> phòng thử nghiệm tự thiết 

lập. Nhu cầu <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> chất chuẩn trong nước ngày càng lớn, tuy nhiên chất chuẩn được 

thiết lập trong nước chủ yếu là chuẩn thứ cấp được nối với chuẩn quốc tế và công tác 

thiết lập chất chuẩn gốc trong nghiên cứu và phát triển thuốc mới và chất chuẩn có nguồn 

gốc từ dược liệu trong trường hợp không có chuẩn gốc để nối đang còn rất hạn chế. Do 

vậy, công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc đặc biệt thuốc có nguồn gốc từ dược 

liệu đang gặp khó khăn do thiếu chất chuẩn. 

Để chủ động hơn trong thiết lập chất chuẩn và trong trường hợp nghiên cứu phát 

triển thuốc mới, chưa có chất chuẩn nối, khóa luận “<strong>Tổng</strong> <strong>quan</strong> <strong>về</strong> <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> <strong>phân</strong> 

<strong>tích</strong> <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> trong thiết lập chất chuẩn gốc (Primary Standard)” được thực hiện với 

mong muốn đem đến một cái nhìn tổng <strong>quan</strong> <strong>về</strong> thiết lập chất chuẩn gốc cũng như cung 

cấp những hiểu biết cơ bản, khả năng phát triển và ứng <strong>dụng</strong> của nó trong ngành Dược 

tại Việt Nam với ba mục tiêu chính sau: 

1. Khái niệm <strong>về</strong> chất chuẩn gốc và <strong>các</strong> bước trong quy trình thiết lập chất chuẩn 


gốc. 

2. <strong>Tổng</strong> <strong>quan</strong> <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn gốc. 

3. <strong>Tổng</strong> <strong>quan</strong> <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> xác định độ tinh khiết của chất chuẩn gốc. 

1 












CHƯƠNG 1. KHÁI NIỆM VỀ CHẤT CHUẨN GỐC 




1.1. Khái niệm <strong>về</strong> chất chuẩn đối chiếu 

Nguyên liệu đối chiếu là những nguyên liệu có sự đồng nhất và ổn định <strong>về</strong> một 

hoặc một số tính chất, được thiết lập để phù hợp với một quá trình <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> hoặc đo 

lường đã định sẵn [12], [43], [45], [59]. 

Thuật ngữ “chất chuẩn đối chiếu hóa học” hay còn gọi là “chất chuẩn đối chiếu” 

hay “chất đối chiếu hóa học” được WHO định nghĩa như sau: 

“Chất chuẩn đối chiếu hóa học là nguyên liệu đồng nhất, xác thực, được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> 

trong <strong>các</strong> phép thử vật lí, hóa học mà ở đó <strong>các</strong> tính chất của nó được so sánh với <strong>các</strong> tính 

chất của chất cần thử, với độ tinh khiết phù hợp với mục đích <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong>” [5], [83]. 

Trong lĩnh vực kiểm tra chất lượng của ngành Dược, <strong>các</strong> phương pháp <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> 

trong <strong>các</strong> Dược điển hiện hành có thể yêu cầu CCĐC trong <strong>các</strong> phép thử sau [14], [69], 

[73], [80], [85]: Đo phổ IR để định tính, đo phổ UV để định lượng, định lượng bằng <strong>các</strong> 

phương pháp so sánh màu, <strong>các</strong> phương pháp sắc ký để định tính và định lượng, <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> 

<strong>thuật</strong> tách để định lượng, <strong>các</strong> phương pháp định lượng vi sinh, <strong>các</strong> thử nghiệm hóa học 

- miễn dịch, hiệu chuẩn thiết bị. 

1.2. Phân loại chất chuẩn đối chiếu hóa học: 

1.2.1. Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc (primary chemical reference standards - 

PCRS) 

Khái niệm: “Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc là chất được công nhận rộng rãi, 

có <strong>các</strong> chỉ tiêu chất lượng phù hợp với tài liệu công bố, cụ thể và giá trị ấn định của nó 

được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> làm tiêu chuẩn <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> mà không cần phải so sánh với chất hóa học 

khác” [83], [85]. 

Theo ICH Guideline Q7 định nghĩa: Chất chuẩn gốc là một chất được đưa ra bởi 

một loạt <strong>các</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> để trở thành nguyên liệu đáng tin cậy có độ tinh khiết cao. Chất 


chuẩn này có thể: 

• Thu được từ nguồn được công nhận chính thức; 

• Được bào chế bằng tổng hợp độc lập (independent synthesis); 

2 















• Thu được từ nguyên liệu sản xuất có độ tinh khiết cao; 

• Được bào chế bằng <strong>các</strong>h tinh chế tiếp <strong>các</strong> nguyên liệu sản xuất có sẵn [37]. 

– Các chuẩn gốc - PCRS chính thức: 

Các chất chuẩn gốc chính thức có thể tìm được từ <strong>các</strong> nguồn sau: Trung tâm hợp 

tác <strong>về</strong> chất chuẩn đối chiếu của WHO, Hội đồng Dược điển Châu Âu, <strong>các</strong> phòng thí 

nghiệm trực thuộc của Hội đồng Dược điển Anh và Mỹ [21], [67], [81]. 

Chất chuẩn quốc tế (ICRS) là một chất chuẩn gốc được thiết lập tại Trung tâm 

hợp tác <strong>về</strong> <strong>các</strong> chất chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) <strong>về</strong> tiêu chuẩn chất lượng 

của <strong>các</strong> chế phẩm dược <strong>dụng</strong>. Các tổ chức tham gia hợp tác đánh giá ICRS do WHO chỉ 

định. ICRS được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> chủ yếu trong <strong>các</strong> phép thử vật lý, hóa học, định lượng của 

<strong>các</strong> chuyên luận dược phẩm được công bố trong IP [40], [85]. 

Chuẩn theo Dược điển Châu Âu (EPRS): Được thiết lập và cung cấp bởi Ban thư 

ký Kỹ <strong>thuật</strong> thuộc Hội đồng Dược điển Châu Âu [26]. 

Chuẩn theo Dược điển Mỹ (USPRS): Được thiết lập và <strong>phân</strong> phối bởi Hội đồng 

chất đối chiếu Dược điển Mỹ [80]. 

– Các chuẩn gốc-PCRS tiêu chuẩn nhà sản xuất: Trong trường hợp chưa có chất 

chuẩn gốc chính thức, nhà sản xuất có thể được xây dựng chất chuẩn gốc của cơ sở 

(in-house primary reference standard) bao gồm số lô và đầy đủ đặc tính của chất 

chuẩn gốc. 

1.2.2. Chất chuẩn đối chiếu hóa học thứ cấp (secondary chemical reference 

standards - SCRS) 

Khái niệm: Chất chuẩn thứ cấp là một chất chuẩn đối chiếu hóa học mà <strong>các</strong> tính 

chất hay chỉ tiêu chất lượng của nó được xác định bằng <strong>các</strong>h so sánh với một chất chuẩn 

gốc. Chuẩn thứ cấp được dùng làm chất chuẩn đối chiếu cho <strong>các</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> thường ngày 

của phòng thí nghiệm [37], [83], [85]. 

Phân loại chất chuẩn thứ cấp: 


– Chuẩn thứ cấp - SCRS “chính thức” là một chuẩn thứ cấp khu vực hay quốc gia. 

• Chuẩn thứ cấp - SRCS ASEAN: do <strong>các</strong> PTN của <strong>các</strong> HĐDĐ, viện kiểm nghiệm 

quốc gia thiết lập, trong quá trình thiết lập chuẩn có <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> chuẩn gốc PCRS để 

3 















so sánh. Quá trình thiết lập, <strong>phân</strong> phối chất chuẩn Dược điển do <strong>các</strong> HĐDĐ thực 

hiện và tuân theo <strong>các</strong> hướng dẫn của ISO guide 35 – 2017 [44]. 

• Chuẩn quốc gia - VNRS: Được thiết lập tại Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung ương 

- Bộ Y tế hoặc Viện Kiểm Nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh - Bộ Y tế; 

được đánh giá bởi ít nhất hai khoa thử nghiệm là khoa Thiết lập chất chuẩn & 

chất đối chiếu và một khoa thử nghiệm khác trong Viện; được liên kết với chất 


– Chuẩn làm việc (Working standard): Là một chuẩn thứ cấp do một nhà sản xuất hoặc 

một PTN tự thiết lập [66]. 

1.3. Hướng dẫn quy trình thiết lập chất chuẩn gốc 

Chất chuẩn gốc được công nhận rộng rãi do đó quy trình thiết lập chất chuẩn gốc 

phải được ban hành bởi <strong>các</strong> tổ chức có thẩm quyền và tuân thủ nghiêm ngặt. 

Quy trình thiết lập chất chuẩn gốc gồm 6 bước như sau [20], [83]: 

‣ Bước 1: Đánh giá nhu cầu thiết lập chất chuẩn gốc 

Sản xuất, xác nhận, duy trì và <strong>phân</strong> phối <strong>các</strong> chất chuẩn gốc là việc tốn nhiều chi 

phí và thời gian, do đó vấn đề đầu tiên cần được đánh giá là liệu có một quy trình nào 

đó có thể thay thế bởi một quy trình khác thỏa mãn yêu cầu tương đương mà không cần 

phải dùng đến chất chuẩn gốc hay không. 

‣ Bước 2: Thu thập nguyên liệu nguồn 

Nguyên liệu nguồn có chất lượng đạt yêu cầu có thể được lựa chọn từ lô nguyên 

liệu sản xuất có chất lượng tốt nhất và được cung cấp bởi <strong>các</strong> nhà sản xuất dược phẩm. 

Các <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> tinh chế là cần thiết để nguyên liệu được chấp nhận <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> như một chất 


<strong>dụng</strong>: 

Các yêu cầu <strong>về</strong> độ tinh khiết cho một chất chuẩn gốc phụ thuộc vào mục đích <strong>sử</strong> 

• Một chất chuẩn gốc đề xuất cho một phép thử định tính không đòi hỏi sự tinh 


khiết quá cao, bởi sự hiện diện của một tỷ lệ nhỏ tạp chất thường không ảnh 

hưởng đáng chý ý đến phép thử. 

• Các chất chuẩn gốc được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> trong <strong>các</strong> phép định lượng nên có độ tinh khiết 

cao. Theo nguyên tắc cơ bản hướng dẫn, độ tinh khiết 99,5% trở lên là cần thiết, 

4 















tính trên nguyên liệu dạng khan hoặc không chứa <strong>các</strong> chất dễ bay hơi. 

Khi nguyên liệu nguồn <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> làm chất chuẩn gốc được lấy từ nhà cung cấp, cần 

cung cấp <strong>các</strong> tài liệu sau: 

• Chứng chỉ <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> với đầy đủ thông tin <strong>về</strong> <strong>các</strong> phương pháp thử, giá trị được 

tìm thấy và số lượng bản sao được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> (nếu có), và <strong>quan</strong>g phổ và/hoặc sắc 

ký đồ thích hợp; 

• Kết quả của bất kỳ nghiên cứu độ ổn định nào; 

• Thông tin <strong>về</strong> điều kiện bảo quản tối ưu cần thiết để đảm bảo độ ổn định (cân nhắc 

<strong>về</strong> nhiệt độ và độ ẩm); 

• Kết quả của bất kỳ nghiên cứu <strong>về</strong> tính hút ẩm và/hoặc công bố <strong>về</strong> tính hút ẩm của 

nguyên liệu nguồn; 

• Sự xác định của <strong>các</strong> tạp chất được phát hiện và/hoặc thông tin cụ thể <strong>về</strong> hệ số đáp 

ứng liên <strong>quan</strong> được xác định bằng những phương pháp rút gọn liên <strong>quan</strong> đến 

thành phần chính, và/hoặc phần trăm khối lượng tạp chất; 

• Bảng dữ liệu an toàn nguyên liệu cập nhật. 

‣ Bước 3: Đánh giá nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc 

Cơ <strong>quan</strong> ban hành cần phải xem xét tất cả <strong>các</strong> dữ liệu thu được từ những kiểm tra 

nguyên liệu thiết lập chuẩn bằng nhiều phương pháp <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> khác nhau. Mức độ và 

phạm vi <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> được yêu cầu phụ thuộc vào mục đích <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> chất chuẩn gốc. 

i. Sử <strong>dụng</strong> trong phép thử định tính 

Để <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> cho phép thử định tính, một lô nguyên liệu có chất lượng tốt (đạt yêu 

cầu <strong>về</strong> độ tinh khiết) được lựa chọn từ một quy trình sản xuất. Điều <strong>quan</strong> trọng nhất là 

kiểm tra được năng lực của nguyên liệu thông qua việc thử nghiệm trên <strong>các</strong> phép thử dự 

định. Thông thường chỉ cần kết quả đánh giá từ một phòng thí nghiệm đủ tiêu chuẩn 

[83]. 

ii. 

Sử <strong>dụng</strong> trong <strong>các</strong> phép thử tinh khiết 


Yêu cầu <strong>về</strong> độ tinh khiết của chất chuẩn gốc <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> với mục đích thử độ tinh 

khiết sẽ cao hơn so với mục đích định tính. Nếu <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> sắc ký lớp mỏng 

(TLC), độ tinh khiết tối thiểu có thể là 90%, tuy nhiên đối với <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> sắc ký lỏng (LC) 

hoặc sắc ký khí (GC) thì ít nhất là 95%. Thông thường chỉ cần một phòng thí nghiệm 

5 















tham gia đánh giá chất chuẩn gốc dùng cho phép thử tinh khiết. Nếu chất chuẩn gốc 

được <strong>phân</strong> lập lần đầu tiên, phải áp <strong>dụng</strong> <strong>các</strong> phép thử hóa học và vật lý thích hợp như 

cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lượng (MS) và <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> nguyên tố để mô tả 

đặc tính cấu trúc [85]. 

iii. 

Sử <strong>dụng</strong> trong <strong>các</strong> phép định lượng 

Nếu chất chuẩn gốc được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> trong một phép định lượng, mức độ và phạm 

vi kiểm tra sẽ rộng và nghiêm ngặt hơn. Tối thiểu ba phòng thí nghiệm cần hợp tác để 

đánh giá chất đề xuất, <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> nhiều <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> được thiết lập và thẩm định bao gồm cả 

phương pháp được quy định trong Dược điển. Khi áp <strong>dụng</strong> phương pháp không đặc hiệu 

như đo <strong>quan</strong>g phổ UV hay so màu, cần phải kiểm tra đáp ứng tương đối giữa hoạt chất 

và tạp chất có mặt. Khi <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> một phương pháp chọn lọc điều <strong>quan</strong> trọng là xác định 

chính xác số lượng tạp chất. Trong trường hợp này, tốt nhất nên kiểm tra chất chuẩn đề 

xuất bằng nhiều phương pháp nhất có thể, bao gồm phương pháp tuyệt đối [83], [85]. 

iv. 

Sử <strong>dụng</strong> trong hiệu chuẩn <strong>dụng</strong> cụ, thiết bị 

Mức độ kiểm tra tương tự như đối với chất chuẩn <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> trong <strong>các</strong> phép định 

lượng. Một số phòng thí nghiệm cần hợp tác để đánh giá chất chuẩn được đề xuất bằng 

<strong>các</strong>h <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> nhiều <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> để xác nhận độ tinh khiết của chất chuẩn đề xuất 

là phù hợp. 

‣ Bước 4: Các phương pháp hóa học và vật lý được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> để đánh giá chất chuẩn 

gốc 

Các phương pháp lựa chọn được chia thành hai nhóm lớn: 

Nhóm <strong>các</strong> phương pháp nhận dạng: 

• Các mô tả vật lý: Cảm <strong>quan</strong>, kính hiển vi <strong>quan</strong>g học, nhiệt độ nóng chảy, góc 

quay cực riêng. 

• Bộ phổ: Nếu chất chuẩn gốc được đề xuất có cấu trúc đã được xác định rõ ràng 

thì có thể nhận dạng thông qua bộ dữ liệu phổ IR, NMR, MS, UV bằng <strong>các</strong>h so 


sánh. Nếu chất chuẩn được đề xuất là chất có cấu trúc mới hoặc thiếu dữ kiện mô 

tả <strong>về</strong> tính chất thì ngoài việc <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> bộ phổ (IR, NMR, MS, UV) thì cần phải <strong>sử</strong> 

<strong>dụng</strong> thêm <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> hiện đại dùng để mô tả <strong>các</strong> hợp chất mới như 

<strong>phân</strong> <strong>tích</strong> nguyên tố, nghiên cứu tinh thể học, <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> nhóm chức,… để mô tả 

6 















đầy đủ đặc tính của chất chuẩn được đề xuất [85]. 

Nhóm <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> xác định độ tinh khiết: 

• Xác định tạp chất liên <strong>quan</strong> bằng <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong>: HPLC/DAD, LC/MS, CE. 

• Xác định tạp chất vô cơ bằng phương pháp: tro toàn phần, tro sulfat, AAS, ICP- 

MS. 

• Xác định lượng nước và <strong>các</strong> chất dễ bay hơi bằng mất khối lượng do làm khô, 

<strong>phân</strong> <strong>tích</strong> nhiệt trọng lượng TGA; ngoài ra lượng nước có thể được xác định bằng 

<strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> chuẩn độ Karl Fischer, lượng dung môi dễ bay hơi xác định bằng GC 

[80]. 

• Xác định độ tinh khiết trực tiếp bằng <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong>: qNMR, DSC. 

Theo hướng dẫn của USP một số phương pháp <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> thường được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> [79]: 

- Cảm <strong>quan</strong>; 

- Kiểm tra nhận dạng (NMR, IR, UV,…); 

- Kiểm tra độ tinh khiết gián tiếp (khoảng nóng chảy, góc quay cực riêng,…); 

- Kiểm tra độ tinh khiết trực tiếp (Độ tinh khiết sắc ký, xác định tạp chất vô cơ, 

xác định tạp chất bay hơi gồm nước và dung môi bay hơi); 

- Phân <strong>tích</strong> nhóm chức (chuẩn độ, UV/VIS, <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> nguyên tố,…); 

- Định lượng dựa vào lô chất chuẩn đặc tính tốt khác trước đó. 

‣ Bước 5: Xác định giá trị ấn định 

Giá trị ấn định được xác định dựa trên kết quả đánh giá liên phòng trong đó <strong>các</strong> 

PTN <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> phương pháp <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> khác nhau. Thông thường <strong>các</strong> giá trị này được tập 

hợp từ ít nhất 3 PTN độc lập tham gia thiết lập chuẩn gốc. Giá trị thực nghiệm thu được 

này đại diện tốt nhất cho ước tính giá trị thực [83]. 

Khi tất cả <strong>các</strong> phép thử độ tinh khiết đã được hoàn thành và <strong>các</strong> phương pháp đã 

được thẩm định đầy đủ, độ tinh khiết của chất chuẩn gốc được tính theo công thức sau: 

Hay: 

Độ tinh khiết = 100% – % tạp chất hữu cơ - % tạp chất vô cơ - % 

nước - % dung môi tồn dư [79], [85]. 

Độ tinh khiết = [100% - (nước + dung môi tồn dư + tạp chất vô cơ) 


× độ tinh khiết sắc ký/điện di] (%) [75]. 

Giá trị ấn định được xác lập bằng <strong>các</strong>h so sánh kết quả <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> giữa <strong>các</strong> PTN 

thông qua việc <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> phương pháp kiểm định thống kê ANOVA [7], [42]. 

7 















‣ Bước 6: Xử lý và <strong>phân</strong> phối <strong>các</strong> CCĐC 

Sự nguyên vẹn (<strong>về</strong> mặt đặc tính) phải được đảm bảo và duy trì trong suốt thời 

gian <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong>. 

Hoạt động đóng gói: Phải tuân thủ <strong>các</strong> yêu cầu GMP. Lọ chứa chất chuẩn gốc 

phải tránh độ ẩm, ánh sáng, oxy và phải được kiểm tra tính thấm ẩm. Các chất đắt tiền 

hoặc chỉ có sẵn với lượng rất nhỏ có thể được pha thành dung dịch sau đó đông khô 

hoặc bay hơi. Một số chất chuẩn gốc phải được đóng gói trong khí trơ hoặc trong điều 

kiện độ ẩm được kiểm soát. 

Bảo quản: Thông tin <strong>về</strong> <strong>các</strong> điều kiện bảo quản thường có thể lấy từ nhà sản xuất 

nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc và nên được yêu cầu thường xuyên khi một chất 

chuẩn mới được thiết lập. Lưu trữ ở nhiệt độ khoảng 2℃ - 8℃ với <strong>các</strong> biện pháp chống 

hấp thụ độ ẩm thích hợp đã được chứng minh phù hợp cho hầu hết <strong>các</strong> chất chuẩn [83]. 

Độ ổn định: Độ ổn định của <strong>các</strong> chất chuẩn gốc nên được theo dõi bằng <strong>các</strong>h kiểm 

tra lại thường xuyên và nên được thay thế ngay khi xuất hiện một sự thay đổi đáng kể 

một đặc tính. Việc lựa chọn phương pháp <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> thích hợp để theo dõi sự ổn định phụ 

thuộc vào tính chất và mục đích <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> của chất chuẩn. 

Thông tin được cung cấp với <strong>các</strong> chất chuẩn gốc: Trên nhãn của chất chuẩn gốc 

cần cung cấp <strong>các</strong> thông tin sau [41], [83]: 

• Tên thích hợp: tên quốc tế (International Nonproprietary Name – INN); 

• Tên của cơ <strong>quan</strong> ban hành; 

• Số lượng của nguyên liệu trong bao bì; 

• Số lô hoặc số đăng ký. 

Phân phối và cung cấp: việc <strong>phân</strong> phối trong cùng một quốc gia thường không 

gây ra vấn đề tuy nhiên khi <strong>các</strong> mẫu được gửi đi <strong>các</strong> nước khác, cả bên gửi và bên nhận 

đều có thể gặp khó khăn do sự khác nhau <strong>về</strong> quy định bưu chính, hải <strong>quan</strong>. Vì vậy cần 

phải tìm <strong>các</strong>h giải quyết <strong>các</strong> rào cản đối với <strong>phân</strong> phối chất chuẩn gốc. 


Thời hạn <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong>: Các chất chuẩn gốc không có “hạn <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong>” theo nghĩa thông 

thường. Để tránh việc loại bỏ lãng phí <strong>các</strong> chất đạt yêu cầu, cơ <strong>quan</strong> ban hành có thể <strong>sử</strong> 

<strong>dụng</strong> cơ chế kiểm soát chung của mẻ chất chuẩn gốc. Nếu đặc biệt cần thiết phải xác 





8 








định ngày hết hạn hoặc ngày kiểm tra lại, cần ghi lại trên nhãn và/hoặc trong một số tài 

liệu kèm theo chất chuẩn gốc và phải lưu lại hồ sơ [83]. 









9 








CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN CÁC KỸ THUẬT XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU 

NHẬN DẠNG CHẤT CHUẨN GỐC 




2.1. Mô tả vật lý 

2.1.1. Kiểm tra cảm <strong>quan</strong> 

Các đặc điểm nhìn thấy được như màu sắc, kết cấu (texture), hình thái học 

(morphology) cũng như sự nhiễm bẩn nhìn thấy được. Các chất hầu như sẽ thay đổi màu 

sắc hoặc kết cấu khi tiếp xúc với <strong>các</strong> tác nhân như ánh sáng hoặc độ ẩm. Do đó, kiểm 

tra cảm <strong>quan</strong> là một biện pháp <strong>quan</strong> trọng để kiểm tra <strong>các</strong> chất chuẩn [66]. 

2.1.2. Kính hiển vi <strong>quan</strong>g học 

Kính hiển vi <strong>quan</strong>g học liên <strong>quan</strong> đến việc kiểm tra nguyên liệu thiết lập chuẩn 

và xác định sự kết tinh dưới kính hiển vi. Một đánh giá ban đầu <strong>về</strong> hình thái chất chuẩn, 

tính đồng nhất, một khía cạnh định tính của khúc xạ ánh sáng bằng tinh thể có thể dễ 

dàng <strong>quan</strong> sát bằng <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> này. Các hạt tinh thể sẽ xuất hiện sự thay đổi từ sáng đến 

tối (hoặc thay đổi màu sắc), dạng vô định hình sẽ không thay đổi khi xoay bàn soi của 

kính hiển vi <strong>phân</strong> cực [71]. 

2.1.3. Xác định điểm chảy 

Điểm chảy của một chất là nhiệt độ đã hiệu chỉnh, tại đó hạt chất rắn cuối cùng 

của chất thử nghiệm chuyển thành trạng thái lỏng, bắt đầu biến màu, hóa than hoặc sủi 

bọt. Để xác định điểm chảy, tùy theo tính chất lý học của từng chất mà áp <strong>dụng</strong> phương 

pháp xác định điểm chảy phù hợp [5]. Điểm chảy là một hằng số vật lý biểu thị sự nhận 

dạng và độ tinh khiết của nguyên liệu [14], [85]. 

2.1.4. Góc quay cực riêng 

Theo Dược điển Việt Nam V- PL 6.4: Góc quay cực là góc của mặt phẳng <strong>phân</strong> 

cực khi bị quay đi khi ánh sáng <strong>phân</strong> cực đi qua chất đó nếu là chất lỏng hoặc qua dung 

dịch chất đó nếu là chất rắn. Nếu không có hướng dẫn riêng, góc quay cực α được xác 


định ở nhiệt độ 20℃ và với chùm tia đơn sắc có bước sóng ứng với vạch D (589,3 nm) 

của đèn natri qua lớp chất lỏng hay dung dịch có bề dày 1 dm. Góc quay cực riêng [α] 20 

D 

của một chất lỏng là góc quay cực đo được khi chùm ánh sáng D truyền qua lớp chất 

lỏng ddó có bề dày là 1 dm ở 20℃ chia cho tỷ trọng tương đối của chất ở cùng nhiệt độ. 

10 















Góc quay cực riêng [α] 20 

D 

của một chất rắn là góc quay cực đo được khi chùm ánh sáng 

D truyền qua lớp dung dịch có bề dày 1 dm và có nồng độ là 1 g/ml, ở 20℃ (góc quay 

cực riêng của chất rắn luôn được biểu thị cùng với dung môi và nồng độ dung dịch đo) 

[5], [14]. Góc quay cực riêng được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> để xác nhận chất chuẩn [14], [66]. 

2.2. Bộ phổ nhận dạng <strong>về</strong> cấu trúc 

2.2.1. Kỹ <strong>thuật</strong> <strong>quan</strong>g phổ hồng ngoại (IR) 

2.2.1.1. Nguyên tắc 

Phổ hồng ngoại là một <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> dựa vào sự dao động và quay của <strong>các</strong> nguyên tử 

trong <strong>phân</strong> tử khi cho tia bức xạ IR đi qua mẫu <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> và xác định phần tia tới bị hấp 

thụ với những năng lượng nhất định trong vùng bức xạ có số sóng 4000 - 670 cm -1 . 

Vùng này cung cấp những thông tin <strong>quan</strong> trọng <strong>về</strong> <strong>các</strong> dao động của <strong>các</strong> liên kết trong 

<strong>các</strong> loại nhóm chức do đó là <strong>các</strong> thông tin <strong>về</strong> cấu trúc của <strong>các</strong> <strong>phân</strong> tử [85]. Vì mỗi mức 

năng lượng tại đỉnh bất kỳ trong phổ hấp thụ IR xuất hiện tương ứng tần số dao động 

của một phần trong <strong>phân</strong> tử chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong>. Vì mỗi dạng liên kết có tần số dao động khác 

nhau và hai dạng liên kết như nhau trong hai hợp chất khác nhau ở trong môi trường 

khác nhau, nên hai <strong>phân</strong> tử có cấu trúc khác nhau sẽ không thể có phổ IR giống nhau 

[6]. 

Để có thông tin cấu trúc chính xác từ phổ IR, cần tìm hiểu <strong>các</strong> tần số mà tại đó 

<strong>các</strong> nhóm chức khác nhau hấp thụ. Có thể <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> bảng tương <strong>quan</strong> IR (cung cấp <strong>các</strong> 

thông tin <strong>về</strong> hấp thụ của <strong>các</strong> nhóm chức khác nhau) [6]. 

2.2.1.2. Ưu nhược điểm 

Ưu điểm: Phổ IR là đặc trưng cho <strong>các</strong> nhóm chức có trong hợp chất hữu cơ (trừ 

trường hợp đồng <strong>phân</strong> <strong>quan</strong>g học) [6], [85] và phổ IR thường không bị ảnh hưởng nhiều 

bởi sự có mặt của một lượng nhỏ tạp chất (lên đến vài phần trăm) trong chất thử [85]. 

Nhược điểm: Ứng <strong>dụng</strong> <strong>về</strong> định tính của phổ IR trong trường hợp đồng <strong>phân</strong> 

<strong>quan</strong>g học bị hạn chế [6], [85]. 


2.2.1.3. Ứng <strong>dụng</strong> 

Phổ IR được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> chủ yếu như một phép xác định cấu trúc và nhận dạng chất 

<strong>phân</strong> <strong>tích</strong> thông qua <strong>các</strong> đỉnh đặc trưng cho <strong>các</strong> nhóm chức đặc biệt trong <strong>phân</strong> tử hợp 

11 















chất [3], [85]. Bằng <strong>các</strong>h so sánh phổ IR của hai hợp chất ta có thể xác định chúng có 

giống nhau hay không [6]. Phổ IR là <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> nhận dạng được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> phổ biến nhất 

cho <strong>các</strong> chất chuẩn gốc [66], [85]. Có thể nhận dạng chất chuẩn gốc bằng <strong>các</strong>h so sánh 

với dữ liệu phổ đã công bố trong nghiên cứu trước đây [14], [26]. 

Trong <strong>các</strong> Dược điển, phổ IR thường được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> để xác định cấu trúc <strong>các</strong> 

nguyên liệu thuốc như: Trong IP (Allopurinol, Artemisinin, Atenolol, Atropin sulfat, 

Betamethason, Caffein, Cloramphenicol,… yêu cầu phổ phải phù hợp với phổ chuẩn) 

[85], trong USP (Abacavir, Acetaminophen, Amikacin, Amitriptylin hydrochlorid, 

Benzocain,… yêu cầu phải phù hợp với phổ chuẩn) [80], trong Dược điển Việt Nam V 

(Albendazol, Allopurinol, Ampicilin, Haloperidol,… yêu cầu phải phù hợp với phổ IR 

chuẩn đối chiếu) [5]. 

2.2.2. Kỹ <strong>thuật</strong> <strong>quan</strong>g phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) 

2.2.2.1. Nguyên tắc: 

Phương pháp <strong>quan</strong>g phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) là một trong <strong>các</strong> 

phương pháp <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện từ từ 200 - 800 nm [5]. Thông 

thường phổ tử ngoại được đo trong dung môi, với nồng độ xấp xỉ 10 -4 mol/l [8]. Có thể 

định tính một số chất bằng <strong>các</strong>h so sánh vị trí <strong>các</strong> cực đại và cực tiểu hấp thụ và tỷ lệ 

mật độ <strong>quan</strong>g giữa <strong>các</strong> bước sóng đó phải nằm trong một giới hạn cho phép; <strong>quan</strong>g phổ 

đạo hàm; chồng phổ [3], [66], [85]. 


Nhược điểm: Chỉ một số dạng cấu trúc trong <strong>các</strong> hợp chất hữu cơ mới có sự hấp 

thụ như vậy nên trên thực tế việc ứng <strong>dụng</strong> phổ UV bị giới hạn trong một số hợp chất 

nhất định, chủ yếu là <strong>các</strong> hợp chất có cấu trúc nối đôi liên hợp [4]; không áp <strong>dụng</strong> được 

khi hợp chất chưa biết rõ cấu trúc, khi hợp chất hấp thụ kém/không hấp thụ UV. Tại 

vùng bước sóng dưới 200 nm xảy ra sự hấp thụ UV không chọn lọc [65]. 



Phổ UV-VIS là một <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> cung cấp thêm thông tin để nhận dạng chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> 

[80]. Bên cạnh đó phổ UV-VIS có thể định tính một số chất bằng <strong>các</strong>h so sánh vị trí <strong>các</strong> 





12 











cực đại và cực tiểu hấp thụ và tỷ lệ mật độ <strong>quan</strong>g giữa <strong>các</strong> bước sóng đó phải nằm trong 

một giới hạn cho phép [3], [66], [85]. 

Trong <strong>các</strong> Dược điển đã áp dung <strong>quan</strong>g phổ UV-VIS để định tính được <strong>các</strong> hợp 

chất: USP (Albuterol, Atenolol, Budesonid, …) [80], IP (Aciclovir, Stavudin, 

Zidovudin,…) [85]. 

2.2.3. Kỹ <strong>thuật</strong> phổ khối lượng (MS) 


Chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> được chuyển sang thể khí và ion hóa, tạo thành <strong>các</strong> ion dương hoặc 

âm. Phương pháp phổ khối dựa trên việc đo trực tiếp tỷ số m/z, là tỷ số giữa khối lượng 

m và điện <strong>tích</strong> z của ion chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong>. Tỷ số này được trình bày dưới dạng đơn vị khối 

lượng nguyên tử (1 a.m.u = 1/12 khối lượng của 12 C) hay Dalton (1Da = khối lượng 

nguyên tử hydro) [3], [5], [14], [26]. 

Trong máy phổ khối, <strong>các</strong> ion được tạo thành trong nguồn ion, được gia tốc rồi 

được tách trong bộ phận <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> trước khi đến detector. Tất cả <strong>các</strong> quá trình trên được 

thực hiện trong một buồng hút chân không đến khoảng 10 -3 đến 10 -6 Pa. Phổ thu được 

biểu diễn cường độ tương đối của <strong>các</strong> ion khác nhau phụ thuộc vào tỷ số m/z của <strong>các</strong> 

ion đó [3]. Tín hiệu tương ứng với một ion là một nhóm <strong>các</strong> pic tương ứng với <strong>phân</strong> bố 

thống kê của <strong>các</strong> đồng vị khác nhau của ion đó. Đó là hình ảnh đồng vị ion và trong đó 

pic của đồng vị có cường độ lớn nhất của một nguyên tử được gọi là pic đơn đồng vị. 

Trong phổ MS của <strong>các</strong> hợp chất hữu cơ, không thể <strong>phân</strong> loại <strong>các</strong> <strong>phân</strong> tử hữu cơ 

khác nhau như hydrocarbon, alcohol, ester,… nhưng cần phải chú ý đến <strong>phân</strong> tử nguyên 

vẹn được ion hóa trước khi <strong>phân</strong> mảnh mà không phải là nhóm chức đặc trưng bị tách 

ra khỏi phần còn lại của <strong>phân</strong> tử [6]. 

2.2.3.2. Ưu điểm của <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> MS 

Ưu điểm: 


• Với lượng mẫu nhỏ nhất có thể xác định được khối lượng tương đối của <strong>phân</strong> tử 

và thậm chí thành phần <strong>các</strong> nguyên tố của một hợp chất. 

• Qua việc <strong>phân</strong> mảnh trong khối phổ có thể suy ra thông tin <strong>về</strong> cấu trúc hoặc thông 

tin <strong>về</strong> xác định khối lượng <strong>phân</strong> tử [3], [5], [6], [8]. 

13 















• Có thể dùng MS để xác định thành phần đồng vị của <strong>các</strong> nguyển tố trong mẫu [3] 

• Kỹ <strong>thuật</strong> bắn phá nhanh bằng nguyên tử (FAB) rất đơn giản, đặc hiệu và độ nhạy 

cho phép <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> trong khoảng picogram, thích hợp để ion hóa <strong>các</strong> chất <strong>phân</strong> 

cực và dễ <strong>phân</strong> hủy nhiệt [3], [65]. 

• Kỹ <strong>thuật</strong> ion hóa bằng tia điện (ESI) thích hợp để ion hóa <strong>các</strong> chất <strong>phân</strong> cực (khác 

với <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> EI). Kỹ <strong>thuật</strong> ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) thích hợp 

để kết nối HPLC/MS [22]. Hai <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> này cho phép phát hiện <strong>các</strong> hợp chất hữu 

cơ ở mức pictogram [2], [65]. 

• Chế độ SIM (Single-ion monitoring, chọn tín hiệu của một ion) hoặc chế độ MIM 

(multiple-ion monitoring, chọn tín hiệu của một số ion đặc trưng của chất <strong>phân</strong> 

<strong>tích</strong>) cho độ nhạy cao hơn, phát hiện hợp chất khi nồng độ dưới ngưỡng pictogram 

[3], [65]. 

• Để <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> trực tiếp <strong>các</strong> hỗn hợp sinh học phức tạp, kết hợp 2 <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> sắc ký 

lỏng và phổ khối lượng cho thấy hiệu quả. Ion hóa bằng giải hấp lazer (MALDI) 

kết hợp với bộ <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> thời gian bay (TOF) đã chứng tỏ là một công cụ mạnh 

và nhạy. Kỹ <strong>thuật</strong> này có khả năng <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> hỗn hợp của peptid và protein trong 

một khoảng nồng độ rộng từ picomol (10 -12 mol) đến attomol (10 -18 mol), đây là 

một lợi thế của <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> này với ứng <strong>dụng</strong> rộng trong hóa hữu cơ, nghiên cứu dược 

phẩm và công nghệ sinh học. 

Nhược điểm: Phổ MS không <strong>phân</strong> biệt được <strong>các</strong> đồng <strong>phân</strong>. Trong ion hóa bằng 

dòng electron (EI), độ nhạy cỡ nanogram [65]; <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> EI thường tạo ra nhiều mảnh 

nhỏ, ít hoặc thậm chí không có ion <strong>phân</strong> tử cho nên đôi khi khó biện giải phổ. Trong 

trường hợp đó người ta dùng kĩ <strong>thuật</strong> ion hóa “mềm” hơn. Mặt khác, <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> này 

đòi hỏi phải hóa hơi mẫu nên ít thích hợp với <strong>các</strong> chất <strong>phân</strong> cực hoặc dễ bị nhiệt <strong>phân</strong> 

hủy [3]. 


Phổ khối lượng là công cụ hiệu quả để định tính và định lượng <strong>các</strong> hợp chất hữu 


cơ như protein, peptid, <strong>các</strong> hoạt chất, <strong>các</strong> sản phẩm chuyển hóa, tạp chất hay <strong>các</strong> sản 

phẩm <strong>phân</strong> hủy khác [80]. 





14 











2.2.4. Kỹ <strong>thuật</strong> phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 


Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> nghiên cứu cấu trúc <strong>phân</strong> tử 

bằng sự tương tác của bức xạ điện từ tần số radio với tập hợp hạt nhân được đặt trong 

từ trường mạnh. Các hạt nhân này là một phần của nguyên tử và <strong>các</strong> nguyên tử lại được 

tập hợp lại thành <strong>phân</strong> tử và do đó phổ có thể cung cấp thông tin chi tiết <strong>về</strong> cấu trúc <strong>phân</strong> 

tử. Có nhiều hạt nhân có thể dùng để nghiên cứu bằng <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> NMR nhưng hydro và 

carbon là chung nhất. Phổ NMR cung cấp thông tin <strong>về</strong> số lượng nguyên tử khác biệt <strong>về</strong> 

mặt từ tính có mặt trong <strong>phân</strong> tử nghiên cứu [6]. 


Ưu điểm: Phổ NMR cung cấp thông tin <strong>về</strong> cấu trúc <strong>phân</strong> tử rất chi tiết do đó nó 

có tính đặc hiệu cao [6], [27]. Tính hữu ích của <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> NMR phát sinh từ <strong>quan</strong> sát 

thấy rằng cùng một loại hạt nhân, khi nằm trong <strong>các</strong> môi trường <strong>phân</strong> tử khác nhau thì 

có tần suất cộng hưởng khác nhau. Phổ NMR là một <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> mạnh để xác định cấu trúc 

vì tính đặc hiệu của nó trong việc phát hiện một số hạt nhân nhất định như 1H, 13C, 31P 

và 19F. Cơ sở xác định là so sánh <strong>các</strong> tín hiệu từ mẫu thử với <strong>các</strong> tín hiệu dự kiến từ một 

tiêu chuẩn tham chiếu đủ tiêu chuẩn. Các cấu trúc tương đối đơn giản có thể được xác 

định bằng <strong>các</strong>h <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> <strong>các</strong> thay đổi hóa học, mô hình ghép nối và cường độ thu được 

từ Phổ 1H và 13C một chiều. Đối với <strong>các</strong> cấu trúc phức tạp hơn, <strong>các</strong> nhà phổ học có thể 

phải có được phổ hai chiều từ <strong>các</strong> thí nghiệm đã được phát triển để xác định kết nối đồng 

nhất hoặc kết nối hạch nhân [80]. 

Nhược điểm: Kỹ <strong>thuật</strong> NMR có độ nhạy tương đối thấp do sự khác biệt nhỏ <strong>về</strong> 

năng lượng giữa <strong>các</strong> trạng thái liên kết dẫn đến kết quả là sự khác biệt số lượng hạt nhân 

giữa 2 mức của chỉ có một phần triệu. Ngoài ra, tuổi thọ dài của hầu hết <strong>các</strong> hạt nhân 

trong trạng thái kích thích ảnh hưởng đến thiết kế của kiểm tra <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> NMR đặc biệt 

trong <strong>các</strong> thí nghiệm xung có tính lặp lại. 



Phổ NMR là một <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> hiệu quả trong xác định cấu trúc hóa học của <strong>các</strong> <strong>phân</strong> 

tử hữu cơ bằng <strong>các</strong>h giải phổ. Để xác định cấu trúc thường đo phổ 1D NMR là đủ còn 

trong <strong>các</strong> trường hợp phức tạp cần <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> thêm phổ 2D. Phổ NMR có thể được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> 

15 















cho mục đích định tính và định lượng [14], [26], trong trường hợp định tính phổ của 

nguyên liệu chất chuẩn phải luôn được ghi lại dưới cùng một điều kiện với chất <strong>phân</strong> 

<strong>tích</strong>. Khi không có sẵn dữ liệu tham chiếu cần bổ sung thêm một <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> phổ MS [27], 

[53]. 

2.2.5. Phân <strong>tích</strong> nguyên tố 

Hàm lượng <strong>các</strong> nguyên tố carbon, hydro và nitơ của chất chuẩn có thể được xác 

định bởi phương pháp <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> đốt cháy (combustion analysis). Phân <strong>tích</strong> đốt cháy cung 

cấp thông tin <strong>về</strong> công thức <strong>phân</strong> tử và độ tinh khiết của chất chuẩn. Sự kém phù hợp 

giữa thành phần nguyên tố lý thuyết và thực nghiệm thường là dấu hiệu của một tạp chất 

hoặc sự khác nhau giữa công thức <strong>phân</strong> tử lý thuyết và thực tế. Phân <strong>tích</strong> nguyên tố cũng 

có thể xác định sự có mặt của dung môi và tạp chất vô cơ [66]. 

2.2.6. Nhiễu xạ tia X 

Nguyên tắc: Mỗi pha tinh thể của một chất nhất định tạo ra một mô hình nhiễu xạ 

tia X đặc trưng. Ba loại thông tin thu được từ nhiễu xạ tia X là vị trí góc cạnh của đường 

nhiễu xạ, cường độ đường nhiễu xạ và <strong>các</strong> mặt cắt nhiễu xạ. Kết quả <strong>về</strong> vị trí góc cạnh 

và cường độ của <strong>các</strong> đường có thể <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> cho giai đoạn định tính [80]. 

Khi áp <strong>dụng</strong> cho <strong>các</strong> tinh thể đơn, <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> này gọi là nhiễu xạ tia X đơn tinh thể; 

khi áp <strong>dụng</strong> cho bột, <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> gọi là nhiễu xạ tia X bột (X-ray powder diffraction - 

XRPD). Nhiễu xạ đơn tinh thể cung cấp thông tin cấu trúc cuối cùng <strong>về</strong> độ dài và góc 

liên kết cho chất chuẩn, trong khi XRPD cho thông tin <strong>về</strong> mức độ kết tinh của nguyên 

liệu cũng như giúp xác định dạng thù hình [31], [32], [70]. 






16 








CHƯƠNG 3. TỔNG QUAN CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỘ TINH KHIẾT 

NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GỐC 




3.1. Nguồn gốc và <strong>phân</strong> loại tạp chất trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc 

3.1.1. Nguồn gốc tạp chất 

Các tạp chất hoặc <strong>các</strong> sản phẩm <strong>phân</strong> hủy trong <strong>các</strong> thuốc có thể sinh ra trong quá 

trình sản xuất hoặc trong quá tình lưu trữ thuốc. Các sản phẩm <strong>phân</strong> hủy trong <strong>các</strong> sản 

phẩm thuốc có thể phát sinh từ <strong>các</strong> thuốc hoặc <strong>các</strong> sản phẩm phản ứng của thuốc với 

môi trường, với một tá dược hoặc với hệ thống bao bì trực tiếp [80]. 

Tạp chất xác định (specified impurity) là một tạp chất mà được liệt kê riêng biệt 

và được giới hạn với một tiêu chuẩn chấp nhận riêng trong một chuyên luận hoặc trong 

đặc tính một thuốc mới. Một tạp chất lý thuyết có thể được nhận biết hoặc chưa được 

nhận biết. 

Tạp chất chưa được nhận biết (unidentified impurity) là một tạp chất mà một đặc 

tính cấu trúc chưa hoàn thành và nó được xác định chỉ bằng <strong>các</strong> tính chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> định 

tính (ví dụ thời gian lưu sắc ký). 

Tạp chất không xác định (unspecified impurity) là một tạp chất mà được giới hạn 

bởi một tiêu chuẩn chấp nhận chung nhưng không được liệt kê riêng biệt với tiêu chuẩn 

chấp nhận riêng của nó [14], [39]. 

3.1.2. Phân loại tạp chất 

Tạp chất có thể được <strong>phân</strong> loại thành <strong>các</strong> loại sau [65], [80],[47]: 

– Tạp chất hữu cơ 

– Tạp chất vô cơ 

– Tạp chất bay hơi 

‣ Tạp chất hữu cơ: Tạp chất hữu cơ có thể phát sinh ra trong quá trình sản xuất và/hoặc 

lưu trữ nguyên liệu thiết lập chất chuẩn. Chúng có thể được xác định hoặc không xác 


định, dễ bay hơi hoặc không bay hơi, và bao gồm: 

• Nguyên liệu ban đầu; 

• Sản phẩm phụ; 

• Sản phẩm trung gian; 

17 















• Sản phẩm <strong>phân</strong> hủy; 

• Thuốc thử, phối tử, <strong>các</strong> chất xúc tác; 

• Các đồng <strong>phân</strong> lập thể. 

Việc xác định tạp chất hữu cơ là vấn đề thách thức nhất trong phát triển một 

phương pháp <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> phù hợp bởi vì những tạp chất hữu cơ này là duy nhất cho 

chất chuẩn gốc và có nhiều con đường thoái hóa có thể dẫn đến <strong>các</strong> tạp chất khác 

nhau. Các tạp chất hữu cơ hiện tại và tiềm ẩn phát sinh trong quá trình tổng hợp, lọc 

và lưu trữ phải được xác định và định lượng [21]. 

‣ Tạp chất vô cơ: Tạp chất vô cơ có thể là kết quả của quá trình sản xuất, chúng thường 

được biết và nhận diện và bao gồm : 

• Thuốc thử, phối tử và <strong>các</strong> chất xúc tác; 

• Kim loại nặng hoặc kim loại còn dư; 

• Muối vô cơ; 

• Các chất khác (ví dụ: thiết bị lọc, than hoạt) [80]. 

– Cụ thể nguồn gốc tạp vô cơ có thể xuất phát từ [35], [65]: 

• Nguyên liệu, thuốc thử và dung môi <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> trong quá trình sản xuất/ tổng hợp. 

Chúng có thể là ion vô cơ: clorua, sunfat, phosphat… Hoặc có thể là <strong>các</strong> kim loại 

nặng. 

• Các kim loại nặng có thể bắt nguồn từ <strong>các</strong> bình phản ứng và ống dẫn được <strong>sử</strong> 

<strong>dụng</strong> trong quá trình sản xuất [35]. 

• Bộ lọc, thiết bị lọc và chất hấp phụ được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> trong quá trình tinh chế và kết 

tinh cũng có thể giải phóng <strong>các</strong> kim loại nặng và muối của axit vô cơ. 

• Vết của một số chất phản ứng vô cơ hoặc <strong>các</strong> sản phẩm biến đổi của chúng cũng 

có thể là tạp chất. Ví dụ, trong phản ứng <strong>các</strong> sản phẩm oxy hóa với <strong>các</strong> chất oxy 

hóa như selen dioxit, chromium trioxit, muối permanganat và thủy ngân (II) có 

thể phát hiện được <strong>các</strong> vết của selen, crom, mangan hoặc thuỷ ngân…vv. 

• Các chất xúc tác dị thể như palladium và niken có thể tồn tại dưới dạng ion hóa. 

• Sự <strong>phân</strong> hủy hoạt chất: ví dụ như muối phosphat từ quá trình thủy <strong>phân</strong> của este 


photpho, hydrazin từ sự <strong>phân</strong> ly hoặc hydrazon thủy <strong>phân</strong> [65]. 

‣ Tạp chất bay hơi: 

– Tạp chất bay hơi bao gồm nước và dung môi tồn dư. 

18 















Dung môi tồn dư là chất lỏng hữu cơ được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> làm phương tiện để pha 

chế <strong>các</strong> dung dịch hoặc hỗn dịch trong tổng hợp thuốc. Vì chúng thường có độc tính 

đã biết nên việc lựa chọn <strong>các</strong> biện pháp kiểm soát thích hợp được thực hiện dễ dàng 

[80]. 

– Nguồn gốc của tạp chất bay hơi: 

• Dung môi để kết tinh hoạt chất: thường là dung môi <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> trong những giai 

đoạn tinh chế cuối cùng. 

• Dung môi chạy sắc ký: Nếu bước cuối cùng hoạt chất được tinh chế bằng sắc ký 

cột, thì dung môi sắc ký cũng có thể có mặt. 

• Dung môi do hấp phụ: Nếu hoạt chất là chất dễ hút ẩm nó có thể liên kết <strong>các</strong> 

thành phần dễ bay hơi trong không khí bằng <strong>các</strong>h hấp phụ hay gặp nhất là nước. 

• Bắt nguồn từ quá trình bào chế thuốc: nước, cồn, 2-propanol, chloroform, 

dichloromethan và <strong>các</strong> dung môi khác được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> trong <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> bào chế. 

Các tạp chất nên được kiểm soát trong suốt quá trình sản xuất. Các tạp chất liên 

<strong>quan</strong> đến quy trình sản xuất nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc nên được giữ ở mức 

tối thiểu để tránh sự xuống cấp và tác <strong>dụng</strong> <strong>về</strong> dược lý không mong muốn. Các hợp chất 

dễ bị thủy <strong>phân</strong>, ví dụ nên được làm khô hoàn toàn để loại bỏ ẩm và sau đó được lưu trữ 

trong máy sấy hút ẩm. Các chất chuẩn đối chiếu có chứa một tỉ lệ cao <strong>các</strong> tạp chất hữu 

cơ dễ bay hơi có thể bị thay đổi độ tinh khiết theo thời gian khi dung môi bay hơi. Ví 

dụ, tạp chất trong aceton, dung môi loại 3, được cho phép lên tới 5000 ppm hoặc 0,5% 

[21]. 

3.2. Các <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> xác định tạp chất trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc 

Nhìn chung có hai hướng chính để xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết 

lập chất chuẩn gốc là xác định trực tiếp hoạt chất chính và xác định gián tiếp qua hàm 

lượng từng loại tạp chất [85], [87]. 

3.2.1. Kỹ <strong>thuật</strong> xác định gián tiếp: 

Khi thiết lập bất kỳ một chất chuẩn gốc nào nhằm <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> trong định lượng thì 


phải xác định độ tinh khiết. Độ tinh khiết được xác định thông qua việc xác định hàm 

lượng tạp chất bằng <strong>các</strong>h <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> phù hợp [14], [26]. 





19 











Thử tinh khiết là tập hợp <strong>các</strong> phép thử nhằm phát hiện những tạp chất nhiễm vào 

nguyên liệu thiết lập chất chuẩn. Để kiểm tra độ tinh khiết, phải thử xác định sự có mặt 

của <strong>các</strong> tạp chất, số lượng và giới hạn của chúng cũng như những yêu cầu khác tùy theo 

mỗi chuyên luận [5]. 

Độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn được tính theo công thức 

[75],[58], [85]: 

vô cơ)/100 

Độ tinh khiết = (100 - % tạp chất liên <strong>quan</strong>) × (100 - % tạp bay hơi - % tạp 

= Độ tinh khiết sắc ký × (100- % tạp bay hơi - % tạp vô cơ)/100 

Trong đó: 

• Độ tinh khiết: hàm lượng phần trăm của chất chuẩn đối chiếu (đơn vị %); 

• % tạp chất liên <strong>quan</strong>: phần trăm tổng tạp chất liên <strong>quan</strong> tính thep phương pháp 

chuẩn hóa diện <strong>tích</strong>. 

3.2.1.1. Các <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> xác định tạp chất hữu cơ 

a. Các <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> xác định tạp chất liên <strong>quan</strong> 

a.1. Kỹ <strong>thuật</strong> sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> tách trong đó <strong>các</strong> chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> di 

chuyển qua cột chứa <strong>các</strong> hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên <strong>quan</strong> đến hệ số 

<strong>phân</strong> bố của chúng giữa hai pha tức là liên <strong>quan</strong> đến ái lực tương đối của <strong>các</strong> chất này 

với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải <strong>các</strong> chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào <strong>các</strong> 

yếu tố đó. Thành phần của pha động đưa chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> di chuyển qua cột cần được điều 

chỉnh để rửa giải <strong>các</strong> chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> với thời gian hợp lý [3]. 

Sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể thực hiện theo nhiều <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> khác nhau tùy 

thuộc vào đặc điểm cấu tạo của chất cần <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> và yêu cầu của công việc. Có thể 

thống kê <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> sắc ký lỏng theo mức độ phổ biến trong thực tế như sau: 


– Sắc ký <strong>phân</strong> bố hiệu năng cao: <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> phổ biến nhất hiện nay là sắc ký pha liên kết. 

Pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất mang rắn: silica, alumina… Trong loại 

này, dựa vào cấu tạo của pha liên kết mà chia ra thành 2 dạng pha tĩnh đó là: 

20 















• Sắc ký pha đảo (RP-HPLC): Khi <strong>các</strong> nhóm –OH của silicagel đã được silan hóa 

bởi <strong>các</strong> chuỗi Carbon (C8, C18, phenyl…) tính <strong>phân</strong> cực của pha tĩnh bị giảm đi 

hoặc mất hẳn, khi đó dùng pha động <strong>phân</strong> cực. 

• Sắc ký pha thuận (NP-HPLC): Các nhóm –OH của silicagel được thay thế bởi 

<strong>các</strong> nhóm –NH2, –CN… làm thay đổi độ <strong>phân</strong> cực của pha tĩnh, dùng pha động 

không <strong>phân</strong> cực hoặc ít <strong>phân</strong> cực hơn so với pha tĩnh. 

– Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao: 

• Pha tĩnh là chất rắn <strong>phân</strong> cực. Chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> tranh chấp với pha động ở <strong>các</strong> vị trí 

hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh. Lưu giữ chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> do lực hấp phụ. 

• Pha tĩnh thường <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> là silic oxyd (silica) và nhôm oxyd (alumina). Pha động 

có sức rửa giải khác nhau, đặc trưng bởi giá trị εo - thể hiện sức rửa giải của <strong>các</strong> 

dung môi đối với chất hấp phụ là alumina và silica. Trị số εo càng lớn thì sức rửa 

giải càng mạnh. Nếu pha động gồm nhiều dung môi, dựa vào <strong>phân</strong> số mol của 

từng dung môi để tính trị số εo của hệ [3], [46], [82]. 

Hiện nay, phần lớn <strong>các</strong> phép thử tạp chất liên <strong>quan</strong> được thực hiện bằng phương 

pháp HPLC/DAD (detector mảng diod) do phương pháp có độ nhạy phù hợp để xác 

định tạp chất dưới dạng vết và tự động hóa cao. Một loạt <strong>các</strong> loại pha tĩnh và chế độ 

hoạt động khác nhau làm cho HPLC áp <strong>dụng</strong> cho đa phần <strong>các</strong> loại hợp chất từ không 

<strong>phân</strong> cực đến <strong>phân</strong> cực trung bình. Giới hạn phát hiện điển hình đối với <strong>các</strong> tạp chất liên 

<strong>quan</strong> thường là 0,1% hoặc thấp hơn 0,01%. 

Có 2 phương pháp chính để định lượng tạp chất bằng HPLC là: 

‣ Phương pháp 1: Chuẩn hóa diện <strong>tích</strong> 

Trong <strong>các</strong>h tiếp cận này hàm lượng của một tạp chất liên <strong>quan</strong> riêng lẻ được tính 

theo phương trình sau: 

Trong đó: 

% tạp đơn = 

Spic (tạp đơn) 

ΣSpic 

× 100% 

% tổng tạp chất liên <strong>quan</strong> = Σ% tạp đơn = 

ΣSpic (tạp đơn) 

ΣSpic 

• Spic (tạp đơn): diện <strong>tích</strong> của pic sắc ký tương ứng với tạp đơn đó; 

× 100% 


• ΣSpic: tổng diện <strong>tích</strong> pic sắc ký của hoạt chất và tất cả <strong>các</strong> tạp chất có liên <strong>quan</strong>. 





21 











Đây là một trong những <strong>các</strong>h đơn giản nhất để định lượng tạp chất liên <strong>quan</strong> vì 

không cần chất chuẩn đối chiếu. Phương pháp được áp <strong>dụng</strong> khi đáp ứng <strong>các</strong> tiêu chí 

sau: 

• Khoảng nồng độ tuyến tính: Do <strong>các</strong> hàm lượng <strong>các</strong> tạp chất liên <strong>quan</strong> thường 

dưới 1% và hoạt chất trên 95% do đó điều <strong>quan</strong> trọng là phải có sự tuyến tính từ 

ngưỡng nồng độ <strong>các</strong> chất liên <strong>quan</strong> (ví dụ 1%) đến nồng độ của hoạt chất (ví dụ 

95%). Tuy nhiên, trong một số trường hợp, hình dạng pic sắc ký của hoạt chất có 

thể không hoàn toàn đối xứng ở nồng độ cao như vậy. Do đó, đáp ứng có thể 

không tuyến tính trong phạm vi nồng độ rộng như vậy, và việc <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> tỷ lệ diện 

<strong>tích</strong> có thể không còn thích hợp. 

• Độ nhạy của phương pháp: Trong một số trường hợp, hình dạng pic của hoạt chất 

có thể không hoàn toàn đối xứng ở nồng độ cao nên có thể dẫn đến sự mất tuyến 

tính. Do đó, để duy trì tính tuyến tính ở nồng độ của hoạt chất, <strong>các</strong> nhà khoa học 

có thể cố gắng giảm nồng độ mẫu để cải thiện hình dạng pic của hoạt chất. Tuy 

nhiên, nếu nồng độ mẫu quá thấp, nó sẽ ảnh hưởng đến độ nhạy của phương pháp, 

và khả năng phát hiện <strong>các</strong> tạp chất liên <strong>quan</strong> thấp có thể không đầy đủ. 

• Hệ số đáp ứng: Các hệ số đáp ứng tương đối của <strong>các</strong> chất liên <strong>quan</strong> với hoạt chất 

nên gần với 1. Nếu không, phải xác định hệ số hiệu chỉnh để tính toán. Tuy nhiên, 

khi xác định độ tinh khiết của hoạt chất tự nhiên, bỏ qua sai số xuất phát từ sự 

chênh lệch <strong>về</strong> đáp ứng là không thể tránh khỏi do thành phần phức tạp ngăn cản 

việc xác định và định lượng tất cả <strong>các</strong> thành phần [19], [75]. 

‣ Phương pháp 2: Pha loãng dung dịch thử (Low-high) 

Phương pháp này <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> có thể khắc phục hạn chế của khoảng tính trong phương 

pháp chuẩn hóa diện <strong>tích</strong>. Mẫu được chuẩn bị ở cả nồng độ cao và nồng độ thấp. Mục 

đích tiêm mẫu nồng độ cao nhằm phát hiện tất cả <strong>các</strong> tạp thông qua những pic nhỏ này 

có thể phát hiện được, từ đó tăng độ nhạy của phương pháp. Tiêm mẫu ở nồng độ thấp 

được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> để đảm bảo tuyến tính trong đáp ứng của hoạt chất. Mặt khác, đáp ứng 

của hoạt chất trong mẫu nồng độ thấp tương tự như tạp liên <strong>quan</strong> có trong mẫu nồng độ 


cao. Do đó chỉ cần một khoảng tuyến tính hẹp để định lượng. Hạn chế của phương pháp 

là tổng thời gian <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> tăng lên gấp đôi và có thể mắc sai số do pha loãng. 

‣ Phương pháp 3: Sử <strong>dụng</strong> chất chuẩn tạp 

22 















So với phương pháp chuẩn hóa diện <strong>tích</strong>, phương pháp chất chuẩn tạp có một số 

ưu điểm như sau: 

• Giảm khoảng tuyến tính: Phương pháp chuẩn ngoại <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> một đường chuẩn. 

Do đó, phương pháp này chỉ yêu cầu dải tuyến tính nhỏ. 

• Cải thiện độ nhạy của phương pháp: Trong <strong>các</strong>h tiếp cận này, chỉ tính riêng <strong>các</strong> 

đáp ứng của <strong>các</strong> chất liên <strong>quan</strong> riêng lẻ. Vì diện <strong>tích</strong> pic hoạt chất trong mẫu tiêm 

không cần thiết cho việc tính toán nên có thể <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> nồng độ mẫu cao mà không 

cần lo lắng <strong>về</strong> đáp ứng ngoài khoảng tuyến tính của hoạt chất. Cách tiếp cận này 

đặc biệt hữu ích khi <strong>các</strong> nhà khoa học muốn cải thiện độ nhạy của phương pháp 

bằng <strong>các</strong>h tăng nồng độ mẫu. 

Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn một số hạn chế nhất định: 

• Chất chuẩn tạp: Cần thiết phải có một chất chuẩn tạp tốt. Ngoài ra, mỗi phép 

<strong>phân</strong> <strong>tích</strong> đòi hỏi phải cân chính xác một lượng nhỏ chuẩn tạp. Vì vậy, sai số khi 

cân có thể ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp và độ đúng. 

Một điểm lưu ý <strong>quan</strong> trọng khi thu thập dữ liệu là phải có một “ngưỡng”- đó là 

một giá trị mà khi diện <strong>tích</strong> pic dưới giá trị này sẽ bị bỏ qua. “Ngưỡng” thường bằng 

0,1% hoặc 0,05% chất đang <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> [19], [65]. 

Trong đa số <strong>các</strong> chuyên luận nguyên liệu hóa dược của Dược điển Việt Nam V, 

tạp chất liên <strong>quan</strong> được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng (Phụ luc 5.3): Cefdinir, 

Cefixim, Cefpodoxim proxetil, Ceftriaxon natri, Cefuroxim axetil, Cefuroxim natri,… 

a.2. Kỹ <strong>thuật</strong> sắc kí lỏng khối phổ (LC/MS) 

Kết hợp <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> sắc ký lỏng – khối phổ: vừa khai thác được hiệu lực <strong>phân</strong> tách 

mạnh của <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> sắc ký vừa khai thác được độ nhạy cao của khối phổ trong việc xác 

định hợp chất tách ra. Ngoài ra, khi kết hợp hai <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> thì có thể <strong>phân</strong> biệt được <strong>các</strong> 

đồng <strong>phân</strong> lập thể và đồng <strong>phân</strong> vị trí của chất [22]. Bất lợi của phương pháp tiếp cận 

này là không chỉ <strong>các</strong> hợp chất <strong>quan</strong> tâm mà cả sự nhiễm từ những dung môi được <strong>sử</strong> 

<strong>dụng</strong> cho HPLC cũng sẽ được <strong>tích</strong> lũy. Các hợp chất từ dung môi thậm chí có thể ngăn 

chặn <strong>các</strong> hợp chất được <strong>phân</strong> <strong>tích</strong>, đặc biệt là trong ion hóa FAB nếu chúng dễ ion hóa 


hơn. Sự ngăn chặn này được khắc phục bằng <strong>các</strong>h <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> dòng chảy liên tục FAB hoặc 

ESI và ion hóa APCI riêng. 

Kỹ <strong>thuật</strong> phối hợp HPLC/MS có độ nhạy cao đến mức pictogram hoặc nanogram. 

23 















Hiện nay xu hướng kết hợp mới đòi hỏi sự ứng <strong>dụng</strong> tự động hóa cao <strong>các</strong> phương 

pháp khác như GC/MS, LC/MS, CE/MS, CEC/MS,… cũng được khai thác cả <strong>về</strong> định 

tính và mô tả đặc tính định tính của hỗn hợp phức tạp [65]. 

a.3. Kỹ <strong>thuật</strong> điện di mao quản (CE) 

Điện di mao quản (CE) là một <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> tách <strong>các</strong> chất trong mao quản silica dài 

25-100 cm, đường kính trong 25-100 µm, đường kính ngoài 300-400 µm. Điện thế một 

chiều áp vào hai đầu mao quản 10-30 KV (cường độ điện trường tạo ra có thể lên đến 

500 V/cm) tạo ra quá trình chia tách: <strong>các</strong> chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> được phát hiện khi di chuyển <strong>về</strong> 

một đầu mao quản nhờ một detector thích hợp [3]. 

Việc đo vận tốc điện di động chỉ có ý nghĩa khi điều kiện thí nghiệm được xác 

định chính xác. Sự di chuyển của ion trong điện trường phụ thuộc vào bản chất của chất 

<strong>phân</strong> <strong>tích</strong>, tính chất, kích cỡ, hình dạng và điện <strong>tích</strong>. Nó cũng phụ thuộc vào thành phần 

của chất dẫn điện, tính chất, nồng độ, độ pH, sự có mặt của dung môi bổ sung và độ 

nhớt. Hướng di chuyển của ion phụ thuốc vào dấu điện <strong>tích</strong> của hạt khi nó di chuyển <strong>về</strong> 

phía điện của dấu đối diện. Sự di chuyển điện di được đo trực tiếp hoặc so sánh với chất 

tham chiếu. 

Phân loại <strong>các</strong> kiểu điện di mao quản (Theo Dược điển Việt Nam V-PL158): 

– Điện di mao quản vùng (CZE): Quá trình tách được kiểm soát bằng sự khác nhau 

<strong>về</strong> linh độ tương đối của từng thành phần trong mẫu thử hoặc dung dịch thử. Linh 

độ là hàm số của điện <strong>tích</strong> chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> và kích thước trong điều kiện nhất định của 

phương pháp. 

– Sắc ký mixen điện động (MEKC): Các chất hoạt động bề mặt được thêm vào dung 

dịch đệm làm việc ở nồng độ lớn hơn nồng độ mixen tới hạn. Các chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> có 

thể <strong>phân</strong> bố trong pha tĩnh giả do mixen tạo thành. Kỹ <strong>thuật</strong> này thường được ứng 

<strong>dụng</strong> để tách <strong>các</strong> chất trung tính và <strong>các</strong> ion. 

– Điện di mao quản gel (CGE): Tương tự như lọc gel, <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> <strong>các</strong> mao quản chứa gel 

để tách <strong>các</strong> <strong>phân</strong> tử, dựa trên cơ sở sự khác nhau tương đối <strong>về</strong> khối lượng <strong>phân</strong> tử 

hay kích thước <strong>phân</strong> tử. 


– Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (CIEF): Các chất được tách trên cơ sở sự khác 

nhau tương đối <strong>về</strong> điểm đẳng điện. 





24 











– Điện di mao quản đẳng tốc (CITP): Sử <strong>dụng</strong> hai đệm bao <strong>quan</strong>h <strong>các</strong> vùng chất <strong>phân</strong> 

<strong>tích</strong>. Cả anion và cation có thể tách thành những vùng rõ rệt. Ngoài ra, nồng độ chất 

<strong>phân</strong> <strong>tích</strong> như nhau trong mỗi vùng. Như vậy, chiều dài của mỗi vùng sẽ tỉ lệ thuận 

với lượng chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong>. 

Hai <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> điện di mao quản thường được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> nhiều nhất là điện di mao 

quản vùng và sắc ký mixen điện động. 

Điện sắc ký mao quản (CEC): CEC là một <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> tách lai tạo của CE và HPLC 

nhằm khai thác những ưu điểm kết hợp của độ chọn lọc sắc ký (pha tĩnh và pha động) 

liên <strong>quan</strong> đến pha đảo (RP) với hiệu quả cao và tính điện di của CE [65]. Trong CEC, 

mao quản được nhồi một pha tĩnh thật, thường là silica C18 như trong sắc ký lỏng. 

Nhưng nhờ có thế áp vào mao quản nên pha động di chuyển qua mao quản nhờ dòng 

điện thẩm (EOF). Do không dùng áp suất đẩy pha động qua cột nên không có hiện tượng 

sụt áp liên <strong>quan</strong> đến kích thước hạt. Có thể nói CEC là một <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> sắc ký trong đó pha 

động đi qua cột nhờ EOF nên tạo cho <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> này tách rất hiệu quả, khắc phục giới hạn 

dung lượng pic của HPLC. 

‣ Ứng <strong>dụng</strong>: 

• Phân <strong>tích</strong> dược: dùng <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> dược chất thuộc nhiều nhóm khác nhau. 

• Phân <strong>tích</strong> <strong>các</strong> <strong>phân</strong> tử sinh học, <strong>các</strong> đồng <strong>phân</strong> <strong>quan</strong>g học. Thường kết nối CEC 

với MS và <strong>quan</strong>g phổ [3]. 

• Ví dụ: CEC với phát hiện huỳnh <strong>quan</strong>g bằng laze đã được nghiên cứu để <strong>phân</strong> 

<strong>tích</strong> tạp chất có tính acid và trung tính trong heroin [54]. 

Sau khi tách <strong>các</strong> thành phần, vị trí của <strong>các</strong> chất không màu có thể được xác định 

bằng <strong>các</strong>h xử lý bằng một phản ứng tạo dẫn chất có màu hoặc huỳnh <strong>quan</strong>g. Đối với 

mục đích định lượng tại chỗ có thể được tách cẩn thận, tách rửa với một dung môi thích 

hợp và sau đó được xác định bằng một phương pháp đủ độ nhạy chẳng hạn như phương 

pháp đo <strong>quan</strong>g phổ trực tiếp hoặc sau phản ứng hóa học [65]. 

Ba cơ chế tách chính được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> là pH thấp (trong <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> <strong>các</strong> thuốc cơ bản), 

độ pH cao (trong <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> <strong>các</strong> thuốc có tính acid) và điện di mao quản micellar. Các 


chất phụ thêm vào khác nhau như methanol hoặc ACN, có thể được thêm vào hệ đệm 

chính để cải thiện tính chọn lọc bằng <strong>các</strong>h thay đổi độ nhớt và độ <strong>phân</strong> cực của đệm. 

Kết quả là dòng chảy điện động và sự di động điện di của chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> có thể bị ảnh 

hưởng. Bổ sung cyclodextrins (CDs) có thể cải thiện độ <strong>phân</strong> giải [11], [57]. 

25 















Nguyên tắc định lượng tạp chất tương tự như phương pháp chuẩn hóa diện <strong>tích</strong> 

trong HPLC [65]. 

Ưu điểm: Thời gian <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> giảm, độ bền được cải thiện, giảm <strong>các</strong> yêu cầu xử 

lý mẫu trước và tiết kiệm dung môi hơn so với phương pháp HPLC [11]. 

b. Xác định tạp <strong>phân</strong> hủy hữu cơ 

Định nghĩa: Sản phẩm <strong>phân</strong> hủy của nguyên liệu thiết lập chất chuẩn được coi 

như là sản phẩm biến đổi hóa học được tạo thành trong quá trình sản xuất, <strong>phân</strong> lập, tinh 

chế, bảo quản bởi ảnh hưởng của nhiệt, dung môi (bao gồm cả pH cao và pH thấp), tác 

nhân oxy hóa, <strong>các</strong> chất phản ứng hóa học khác, độ ẩm, ánh sáng, bao bì,…[38] [17], 

[50]. 

Trên cơ sở định nghĩa này, một sự chồng chéo đáng kể có thể được <strong>quan</strong> sát giữa 

tạp chất liên <strong>quan</strong> và sản phẩm <strong>phân</strong> hủy: <strong>các</strong> tạp chất liên <strong>quan</strong> của loại sản phẩm <strong>phân</strong> 

hủy thường được hình thành trong quá trình tổng hợp và <strong>phân</strong> lập nguyên liệu thiết lập 

chất chuẩn với số lượng lớn [65]. 

“Phân hủy bắt buộc” là một quá trình liên <strong>quan</strong> đến sự <strong>phân</strong> hủy của <strong>các</strong> <strong>các</strong> 

nguyên liệu thiết lập chất chuẩn ở điều kiện cấp tốc và do đó tạo ra <strong>các</strong> sản phẩm <strong>phân</strong> 

hủy có thể được nghiên cứu xác định sự ổn định của <strong>phân</strong> tử nguyên liệu thiết lập chất 

chuẩn [13], [17]. 

Kết hợp <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> sắc ký và <strong>quan</strong>g phổ đã được chứng minh là công cụ có giá 

trị cho “<strong>phân</strong> hủy bắt buộc” và ước lượng cho mô tả tạp chất trong nguyên liệu thiết lập 

chất chuẩn [72]. 

3.2.1.2. Các <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> định lượng tạp vô cơ 

Lý do thiết lập giới hạn tạp chất vô cơ một mặt vì độc tính của một số tạp vô cơ 

(thủy ngân, arsen, hydrazin…). Mặt khác, mức độ của <strong>các</strong> tạp chất vô cơ trong nguyên 

liệu thiết lập chất chuẩn cũng là một chỉ số đánh giá cho phương pháp sản xuất/ tinh chế 

[65]. 


a. Xác định tro toàn phần 

Theo Dược điển Việt Nam V- PL 9.8: 





26 











Tiến hành: Lấy một chén sứ hoặc chén platin nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội 

trong bình hút ẩm rồi cân. Nếu trong chuyên luận riêng không có hướng dẫn gì khác thì 

lấy 1 g mẫu thử rải đều vào chén nung, sấy 1h ở 100℃ đến 105℃ rồi đem nung trong lò 

nung ở 600℃ ± 25℃. Sau mỗi lần nung, lấy chén nung cùng cắn tro đem làm nguội trong 

bình hút ẩm rồi cân. Trong quá trình thao tác không được để tạo thành ngọn lửa. Nếu 

sau khi đã nung lâu mà vẫn chưa loại hết carbon của tro thì dùng nước nóng để lấy cắn 

ra, lọc qua giấy lọc không tro rồi lại nung cắn và giấy lọc trong chén nung. Tập trung 

dịch lọc vào tro ở trong chén, làm bốc hơi cẩn thận tới khô rồi nung đến khối lượng 

không đổi [5]. 

b. Phương pháp xác định tro sulfat 

Nguyên tắc: Phương pháp <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> một quy trình để đo lượng chất còn lại không bay 

hơi từ mẫu khi mẫu được nung trong sự có mặt của acid sulfuric theo mô tả biện 

pháp sau đây [5], [80]. 

Biện pháp: Bao gồm 2 phương pháp như sau 

Phương pháp 1: (Theo Dược điển Việt Nam-PL 9.9, IP-2.3 Sulfated ash) 

Nung một chén sứ hoặc một chén platin tới đỏ trong 10 phút, để nguội trong bình 

hút ẩm rồi cân. Nếu không có chỉ dẫn gì đặc biệt gì trong chuyên luận riêng thì cho 1 g 

mẫu thử vào chén nung, làm ẩm với acid sulfuric (TT), đốt cẩn thận rồi làm ẩm với acid 

sulfuric (TT) và nung ở 800℃. Làm nguội rồi cân. Nung lại 15 phút, làm nguội rồi cân 

nhắc lại. Lặp lại quá trình này cho đến khi 2 lần cân liên tiếp, khối lượng không chênh 

nhau quá 0,5 mg [5],[65], [85]. 

Phương pháp 2: (Theo Dược điển Việt Nam V-PL 9.9, USP 40 residue 

on ignition, IP-2.3 Sulfated ash, Ph.Eur-5.6, JP-2.44) 

Phương pháp cắn sau nung/tro sulfat <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> một quy trình để đo lượng chất còn 

lại không bay hơi từ mẫu khi mẫu được nung trong sự có mặt của acid sulfuric theo mô 

tả dưới đây. Phương pháp này thường được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> để xác định hàm lượng <strong>các</strong> tạp chất 

vô cơ trong một chất hữu cơ [80]. 


Nung một chén nung sứ hoặc platin ở 600℃ ± 50℃ trong 30 phút, để nguội trong 

bình hút ẩm rồi cân. Cho vào chén nung một lượng mẫu thử như chỉ dẫn trong chuyên 

luận và cân. Làm ẩm mẫu bằng một lượng nhỏ acid sulfuric (TT) (khoảng 1ml), đốt 

27 















nóng ở mức độ nhẹ nhất có thể đến khi mẫu hóa tro hoàn toàn. Để nguội, làm ẩm cắn 

bằng một lượng nhỏ acid sulfuric (TT), đốt nóng nhẹ đến khi bay hơi hết khói trắng và 

nung ở 600℃ ±50℃ đến khi cắn thành tro hoàn toàn. Trong khi đốt và nung không được 

để tạo thành ngọn lửa. Để nguội trong bình hút ẩm, cân và tính khối lượng của cắn. Nếu 

khối lượng cắn vượt ngoài giới hạn cho phép thì lại làm ẩm cắn bằng acid sulfuric (TT) 

và nung như trên đến khối lượng không đổi nếu không có chỉ dẫn gì khác. Lượng mẫu 

thử thường dùng (từ 1 g - 2 g) được tính từ giới hạn tro sulfat đã quy định sao cho khối 

lượng tro sulfat (khoảng 1 mg) có thể cân được để đảm bảo độ chính xác [5], [80],[26], 

[61], [69], [78], [85]. 

Nếu không có hướng dẫn khác trong chuyên luận riêng thì có thể áp <strong>dụng</strong> một 

trong 2 phương pháp. 

Ứng <strong>dụng</strong>: Phương pháp xác định tro sulfat đã được ứng <strong>dụng</strong> để xác định <strong>các</strong> tạp 

chất vô cơ trong <strong>các</strong> nguyên liệu hóa dược trong Dược điển Việt Nam V. Ví dụ như 

Amlodipin besilat (không quá 0,2%; dùng 1,000 g chế phẩm; phương pháp 2), 

Amodiaquin hydroclorid (không quá 0,2%; dùng 1,0 g chế phẩm; phương pháp 2), 

Amoxicilin natri (không quá 3,0%; dùng 4,000 g chế phẩm),… 

c. Kỹ <strong>thuật</strong> <strong>quan</strong>g phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 

Nguyên tắc: Kỹ <strong>thuật</strong> <strong>quan</strong>g phổ hấp thụ nguyên tử là <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> xác định nồng độ 

<strong>các</strong> nguyên tố trong một chất bằng <strong>các</strong>h đo độ hấp thụ bức xạ bởi hơi nguyên tử tự do 

của nguyên tố đó được hóa hơi từ chất thử. Phương pháp được tiến hành ở bước sóng 

của một trong những vạch hấp thụ của nguyên tử cần xác định [3], [5]. 

Khi nguyên tử ở trạng thái hơi có thể hấp thụ <strong>các</strong> bức xạ có bước sóng xác định. 

Phổ hấp thụ <strong>các</strong> nguyên tử là phổ vạch. Vì vậy muốn thực hiện được phép đo <strong>quan</strong>g phổ 

hấp thụ nguyên tử cần phải có <strong>các</strong> quá trình sau: 

- Chọn <strong>các</strong> điều kiện và trang thiết bị phù hợp để chuyển mẫu <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> từ trạng 

thái ban đầu thành trạng thái hơi của nguyên tử tự do. 


- Chiếu chùm tia sáng thích hợp (với nguyên tố cần <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> và còn được gọi là 

bức xạ cộng hưởng) qua đám hơi nguyên tử vừa tạo ra ở trên. Các nguyên tử của 

nguyên tố cần <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> trong đám hơi sẽ hấp thụ một phần bức xạ và tạo ra phổ 





28 











hấp thụ nguyên tử. Phần bức xạ bị hấp thụ phụ thuộc vào nồng độ của nguyên tử 

đó trong môi trường hấp thụ. 

- Nhờ <strong>các</strong> bộ phận của máy <strong>quan</strong>g phổ mà người ta thu, <strong>phân</strong> ly và chọn vạch phổ 

của nguyên tố cần nghiên cứu và đo cường độ của nó [3]. 

Trong AAS người ta có thể tiến hành nguyên tử hóa mẫu theo 2 <strong>các</strong>h: <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> 

ngọn lửa (FAAS) và không ngọn lửa. Tương ứng với 2 <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> đó có <strong>các</strong> <strong>dụng</strong> cụ 

nguyên tử hóa mẫu khác nhau [3], [80]. 

Sử <strong>dụng</strong> phương pháp xác định trực tiếp trừ khi có chỉ dẫn khác. 

Chuẩn bị dung dịch chất để thử (dung dịch thử) như được mô tả trong chuyên 

luận riêng sao cho nồng độ của nguyên tố cần xác định nằm trong khoảng nồng độ của 

<strong>các</strong> dung dịch chuẩn. Chuẩn bị không ít hơn ba dung dịch chuẩn của nguyên tố cần xác 

định có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ của nguyên 

tố cần <strong>phân</strong> <strong>tích</strong>. Bất kỳ thuốc thử nào được dùng trong việc chuẩn bị <strong>các</strong> dung dịch thử 

đều phải được thêm vào <strong>các</strong> dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu trắng ở cùng nồng độ. 

Đưa dung dịch mẫu trắng vào máy, điều chỉnh tín hiệu đọc được <strong>về</strong> "0". Đưa lần lượt 

dung dịch thử và từng dung dịch chuẩn vào máy, ít nhất mỗi dung dịch làm 3 lần, ghi 

lại kết quả đọc ổn định. Rửa máy bằng dung dịch mẫu trắng sau mỗi lần đo cho đến khi 

tín hiệu trở <strong>về</strong> giá trị đọc ban đầu của mẫu trắng. Nếu <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> nguyên tử hóa 

không ngọn lửa, lò graphit phải được đốt lại giữa <strong>các</strong> lần <strong>phân</strong> <strong>tích</strong>. Từ cường độ vạch 

hấp thụ đọc được của <strong>các</strong> dung dịch chuẩn, thiết lập đường chuẩn biểu thị sự thay đổi 

cường độ vạch hấp thụ theo nồng độ nguyên tố cần xác định và từ đường chuẩn này xác 

định nồng độ nguyên tố trong dung dịch thử [5]. 

Ứng <strong>dụng</strong>: Phương pháp <strong>quan</strong>g phổ hấp thụ nguyên tử có thể định lượng được 

hầu hết <strong>các</strong> nguyên tố kim loại và một số á kim nếu như có nguồn bức xạ cộng hưởng 

[3]. 

Nhược điểm: Mỗi lần đo chỉ xác định được một kim loại; không xác định được 

<strong>các</strong> anion [65]. 


d. Kỹ <strong>thuật</strong> phổ plasma cảm ứng kết nối khối phổ (ICP-MS) 

Nguyên tắc của ICP: Plasma là một luồng khí ion hóa mang năng lượng cao, 

trong đó có chứa <strong>các</strong> cation và electron. Các khí trơ như argon thường được dùng để tạo 

29 















plasma. Có thể coi plasma như một ngọn lửa có nhiệt độ khoảng 1000-6000 0 K. Khi đưa 

mẫu vào plasma sẽ xảy ra <strong>các</strong> quá trình nguyên tử hóa, ion hóa và kích thích như khi 

đưa vào ngọn lửa. Nguyên tử chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> bị kích thích sẽ phát ra bức xạ và tạo nên 

phổ phát xạ plasma [3]. 

Theo Dược điển Việt Nam V- PL 4.6: ICP-MS là một phương pháp phổ khối với 

nguồn ion hóa là plasma kết hợp cảm ứng [5]. 

ICP-MS là một công cụ tốt có thể được <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> để sàng lọc nhanh <strong>các</strong> tạp chất 

vô cơ của mẫu trước khi định lượng [65]. 

Chuẩn bị mẫu: chuẩn bị mẫu là rất <strong>quan</strong> trọng và là bước đầu tiên trong việc thực 

hiện bất kì <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> nào thông qua ICP-MS. Mẫu được đưa vào ngọn lửa plasma dưới 

dạng sol khí bằng <strong>các</strong>h hút mẫu lỏng hoặc rắn hòa tan vào ống phun. Thường ưu tiên <strong>sử</strong> 

<strong>dụng</strong> dung dịch nước hoặc dung dịch acid nitric loãng, bởi vì sự ảnh hưởng của <strong>các</strong> dung 

môi này là tối thiểu so với <strong>các</strong> dung môi khác. 

Quy trình: Làm theo quy trình như được chỉ dẫn trong chuyên khảo riêng cho chế 

độ phát hiện và thông số thiết bị. Dữ liệu được thu thập từ <strong>các</strong> lần đọc kết quả tuần tự 

lặp lại theo mỗi lần đưa mẫu và được tính trung bình. Nồng độ mẫu được tính toán so 

với đường cong làm việc được tạo ra bằng <strong>các</strong>h vẽ sơ đồ đáp ứng detector so với nồng 

độ chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> trong <strong>các</strong> dung dịch chuẩn [80]. 

Ưu điểm: Kỹ <strong>thuật</strong> có thể xác định được tổng <strong>các</strong> ion kim loại trong một lần đoo. 

Giới hạn phát hiện của nguyên tố rất thấp, vùng tuyến tính rộng hơn, độ ổn định và lặp 

lại tốt, độ chọn lọc cao hơn, khả năng <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> đồng vị, khả năng <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> nhanh và ít 

nhiễu [3], [55], [56], [65]. 

Nhược điểm: Không <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> được <strong>các</strong> anion như Cl - , SO4 2- ,… 

3.2.1.3. Xác định tạp chất bay hơi 

Tạp chất bay hơi bao gồm gồm nước và dung môi tồn dư. 


Phân loại dung môi tồn dư theo mức độ nguy hiểm 

• Nhóm 1: Các dung môi tránh <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> 





30 











Các chất gây ung thư cho người hay có khả năng gây ung thư cho người 

rõ rệt. Các chất gây nhiễm độc môi trường. 

• Nhóm 2: Các dung môi phải hạn chế <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> 

Các chất gây ung thư trên động vật, không độc cho gen hoặc <strong>các</strong> tác nhân 

có thể gây độc không hồi phục như độc tính trên thần kinh hoặc gây quái thai. 

Các dung môi nghi có độc tính <strong>quan</strong> trọng, nhưng hồi phục được. 

• Nhóm 3: Các dung môi độc tính thấp 

Các dung môi có độc tính thấp trên người: không cần xác định liều gây tác 

hại cho sức khoẻ. Các dung môi nhóm này có liều phơi nhiễm được phép mỗi 

ngày (PDE) ≥ 50mg/ngày [5], [28], [36], [65], [80]. 

a. Kỹ <strong>thuật</strong> xác định mất khối lượng do làm khô (Loss on drying) 

Theo Dược điển Việt Nam V- Phụ lục 9.6, USP Loss on drying: 

Định nghĩa: Mất khối lượng do làm khô là sự giảm khối lượng của mẫu thử biểu 

thị bằng phần trăm (khối lượng/khối lượng) khi được làm khô trong điều kiện xác định 

ở mỗi chuyên luận. Phương pháp này được dùng để xác định hàm lượng nước, một phần 

hoặc toàn bộ lượng nước kết tinh và lượng chất dễ bay hơi khác trong mẫu thử như tồn 

dư dung môi [5]. 

Yêu cầu: Việc xác định mất khối lượng do làm khô không được làm thay đổi tính 

chất lý hóa cơ bản của mẫu thử, vì vậy mỗi chuyên luận sẽ có quy định <strong>các</strong>h làm khô 

theo một trong <strong>các</strong> phương pháp sau: 

• Trong bình hút ẩm (với những chất hút ẩm như phosphor pentoxyd, silica gel…); 

• Trong chân không (điều kiện áp suất 1,5 kPa - 2,5 kPa có mặt chất hút ẩm 

phosphor pentoxyd và ở nhiệt độ phòng; 

• Trong chân không ở điều kiện nhiệt độ xác định (điều kiện áp suất 1,5 kPa-2,5 

kPa có mặt chất hút ẩm phosphor pentoxyd và ở điều kiện nhiệt độ quy định trong 


chuyên luận riêng); 

• Trong tủ sấy ở điều kiện nhiệt độ xác định (trong tủ sấy ở điều kiện nhiệt độ quy 

định trong chuyên luận riêng); 





31 











• Trong chân không hoàn toàn (điều kiện áp suất không quá 0,1 kPa có mặt chất 

hút ẩm phosphor pentoxyd và ở điều kiện nhiệt độ quy định trong chuyên luận 

riêng) [5]. 

Cách tiến hành: Dùng <strong>dụng</strong> cụ dùng để sấy bằng thủy tinh rộng miệng đáy bằng 

có nắp mài làm bì đựng mẫu thử; làm khô bì trong thời gian 30 phút theo phương pháp 

và điều kiện quy định trong chuyên luận rồi cân để xác định khối lượng bì. Cân ngay 

vào bì này một khối lượng chính xác mẫu thử bằng khối lượng quy định trong chuyên 

luận với sai số ± 10% (thường là 1-2 g, theo USP). Nếu không có chỉ dẫn gì đặc biệt thì 

lượng mẫu thử được dàn mỏng thành lớp có độ dày không quá 5 mm. Nếu mẫu thử có 

kích thước lớn thì phải nghiền nhanh tới kích thước dưới 2 mm trước khi cân. Tiến hành 

làm khô trong điều kiện quy định của chuyên luận. Nếu dùng phương pháp sấy thì nhiệt 

độ thực cho phép chênh lệch ± 2℃ so với nhiệt độ quy định. Sau khi sấy phải làm nguội 

tới nhiệt độ phòng cân trong bình hút ẩm có silica gel rồi cân ngay. Nếu chuyên luận 

không quy định thời gian làm khô có nghĩa là phải làm khô đến khối lượng không đổi, 

tức là sự chênh lệch khối lượng sau khi sấy thêm 1 giờ trong tủ sấy hoặc 6 giờ trong 

bình hút ẩm so với lần sấy trước đó không quá 0,5 mg. Nếu mẫu thử bị chảy ở nhiệt độ 

thấp hơn nhiệt độ sấy quy định thì trước khi đưa lên nhiệt độ đó, cần duy trì từ 1-2 giờ 

ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mẫu thử từ 5℃ đến 10℃ [5], [14], [34], [80], 

[85]. 


Với <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> này, lượng mẫu cần dùng lớn, tốn kém nguyên liệu thiết lập chất 

Kỹ <strong>thuật</strong> mất khối lượng do làm khô được ứng <strong>dụng</strong> trong <strong>các</strong> chuyên luận 

nguyên liệu hóa dược của Dược điển Việt Nam V để xác định hàm lượng nước và dung 

môi tồn dư. Thường mất khối lượng do làm khô không quá 0,5%. Nếu đã <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> <strong>kỹ</strong> 

<strong>thuật</strong> này thì sẽ không cần <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> xác định hàm lượng nước khác. Ví dụ 

như Felodipin- mất khối lượng do làm khô không được quá 0,5% (1,000 g; 105℃, 3 

giờ), Fluconazol- không được quá 0,5% (1,000 g; 105℃), Glibenclamid- không quá 


1,0% (1,000 g; 100℃ đến 105℃), Gliclazid – không quá 0,25% (1,000 g; 100℃ đến 

105℃), Acid acetylsalicylic- không quá 0,5% (1,000 g; trong chân không)… 





32 











b. Kỹ <strong>thuật</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> nhiệt trọng lượng (TGA) 

Nguyên tắc: Tương tự phương pháp mất khối lượng do làm khô. Trong TGA chất 

<strong>phân</strong> <strong>tích</strong> được kiểm soát bởi một chương trình nhiệt độ và khối lượng của nó được xác 

định liên tục như một hàm số của nhiệt độ/thời gian [14], [64], [80]. Hai thông số thực 

nghiệm được xác định đồng thời là mất khối lượng và khối lượng còn lại. <strong>Tổng</strong> “mất 

khối lượng” và “khối lượng còn lại” cộng lại bằng 100% [64]. 

Phương pháp cho phép xác định tổng hàm lượng của nước và/hoặc <strong>các</strong> dung môi 

khác ở dạng tự do hoặc liên kết [65], [80]. Tuy nhiên, không cho biết cụ thể phần khối 

lượng giảm đi là của nước hay của dung môi khác. Ngoài ra, phần dung môi nằm sâu 

trong mạng tinh thể chỉ có thể giải phóng khi nóng chảy hoặc tại nhiệt độ <strong>phân</strong> hủy tinh 

thể hoặc nhiệt độ rất cao. Trường hợp xảy ra sự chồng chéo <strong>các</strong> quá trình thì việc định 

lượng <strong>các</strong> thành phần riêng có thể mắc nhiều sai số. Khắc phục bằng <strong>các</strong>h lựa chọn <strong>các</strong> 

điều kiện tối ưu: giảm tốc độ gia nhiệt và lượng mẫu, hoặc dùng một khí dẫn nhiệt tốt 

(ví dụ khí Heli) độ <strong>phân</strong> giải tăng lên [65]. 

Cũng như <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> xác định độ tinh khiết khác, thông tin thu được từ TGA 

nên được so sánh với thông tin từ những <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> khác như GC [66]. 

Ưu điểm: Lượng mẫu cần dùng nhỏ (Lượng mẫu thường <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> trong USP là 

10-20 mg) [80]=> Phù hợp trong thiết lập chất chuẩn gốc. 

Nhược điểm: Có thể xảy ra sự không đồng nhất mẫu, lượng mẫu nhỏ có thể không 

mang tính đại diện cho chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong>. Khối lượng mẫu nhỏ thì lượng dung môi tồn dư 

chứa trong đó chỉ rơi vào khoảng một vài microgram và có thể gây sai số tương đối lớn 

khi độ nhạy giới hạn của thiết bị (0,1-1,0 μg). Nếu lò nóng lên, mật độ khí của môi 

trường trong lò sẽ giảm, khi đó giảm sự gia tăng khối lượng do môi trường tác động. 

Thay đổi thể <strong>tích</strong> mẫu trong quá trình gia nhiệt cũng làm thay đổi trọng lượng ảo. Ảnh 

hưởng của khí trơ cũng không thể bỏ qua [65]. 


c. Định lượng nước bằng thuốc thử Karl-Fischer 

Theo Dược điển Việt Nam V- Phụ lục 10.3, IP- 2.8 Determination of water by the 

Karl Fischer method: 





33 











Nguyên tắc: Phương pháp định lượng nước này dựa trên phản ứng toàn lượng của 

nước với lưu huỳnh dioxyd và iod trong dung môi khan chứa một chất base hữu cơ thích 

hợp. Dung môi hữu cơ thông <strong>dụng</strong> là methanol khan nước, cũng có khi được thay bằng 

dung môi hưu cơ khác thích hợp để hòa tan chế phẩm. Chất base hữu cơ là pyridin, 

nhưng hiện nay người ta đã dùng những chất base hữu cơ khác để thay thế như imidazol, 

2-methyl-aminopyridin [5], [14], [21], [26], [34], [80], [85]. 

Thiết bị: Hiện nay có nhiều loại <strong>dụng</strong> cụ, nhưng nguyên tắc đều phải cấu tạo sao 

cho thao tác thuận tiện và tránh ẩm. Dụng cụ gồm có một cốc chuẩn độ dung <strong>tích</strong> khoảng 

60 ml, có nắp gắn điện cực kép platin, một ống dẫn khí nitrogen, có lỗ cắm với buret và 

lỗ cắm ống thông hơi chứa chất hút ẩm. Chế phẩm cho vào bình chuẩn độ qua lỗ trên 

nắp hoặc miệng bên cạnh có nút mài. Trong quá trình chuẩn độ, khuấy bằng máy khuấy 

từ hoặc bằng luồng khí nitrogen khô đi qua dung dịch. Điểm kết thúc phản ứng được 

xác định bằng điện kế gắn trong mạch có biến trở 2000 Ω, nối với một nguồn pin 1,5 

vôn. Lúc bắt đầu kim điện kế chỉ điểm không, vì dòng điện chạy qua 2 điện cực platin 

không đáng kể. Khi nhỏ thuốc thử Karl Fischer vào dung dịch, do hiện tượng khử cực 

nên kim điện kế lệch đi nhưng lập tức trở <strong>về</strong> vị trí ban đầu, chỉ khi đến điểm dừng thì 

một giọt thuốc thử thừa sẽ làm kim lệch đi và duy trì ít nhất 30 giây. 

Tiến hành định lượng: 

- Chuẩn bị mẫu thử: Nếu không có chỉ dẫn gì khác trong chuyên luận riêng, cân 

hoặc lấy chính xác một lượng chế phẩm ước lượng chứa khoảng 10 mg đến 50 

mg nước đem định lượng. Thao tác phải nhanh và thực hiện trong phòng có độ 

ẩm thấp để tránh ẩm ở ngoài ảnh hưởng đến chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong>. 

‣ Phương pháp định lượng trực tiếp: 

Nếu không có chỉ dẫn gì khác trong chuyên luận riêng, cho khoảng 20 ml methanol 

khan (TT) hoặc dung môi thích hợp dùng cho thuốc thử Karl Fischer vào cốc chuẩn độ, 

chuẩn độ bằng thuốc thử Karl Fischer đến điểm dừng. Cho nhanh một lượng chế phẩm đã 

chỉ dẫn trong chuyên luận riêng vào cốc chuẩn độ, đóng nút ngay, khuấy đều để phản ứng 


tác <strong>dụng</strong> trong khoảng 1 phút rồi tiếp tục chuẩn độ bằng thuốc thử Karl Fischer đến điểm 

dừng. Tính hàm lượng nước X (tính bằng mg) của chế phẩm theo công thức: 

X = N × F 

34 















Trong đó: 

• N là thể <strong>tích</strong> thuốc thử Karl Fischer đã dùng cho lần chuẩn độ sau khi cho chế 

phẩm (tính bằng ml); 

• F là hệ số đương lượng nước của thuốc thử Karl Fischer (tính bằng mg/ml). 

‣ Phương pháp định lượng gián tiếp: 

Dung dịch nước chuẩn: Pha loãng 2 ml nước tinh khiết với methanol khan (TT) 

hoặc dung môi thích hợp thành 1000 ml. Lấy chính xác 25,0 ml dung dịch này cho vào 

cốc định lượng và chuẩn độ bằng thuốc thử Karl Fischer vừa mới xác định độ chuẩn. 

Tính hàm lượng nước W (tính bằng mg/ml) của dung dịch nước chuẩn theo công thức: 

Trong đó: 

W = V × F/25 

• V là thể <strong>tích</strong> thuốc thử Karl Fischer đã dùng (ml); 

• F là hệ số đương lượng nước của thuốc thử Karl Fischer (tính bằng mg/ml). 

Tiến hành: Nếu không có chỉ dẫn gì khác trong chuyên luận riêng, cho một 

methanol khan (TT), hoặc dung môi được chỉ dẫn trong chuyên luận riêng vào cốc định 

lượng vừa đủ ngập điện cực, chuẩn độ bằng thuốc thử Karl Fischer đến điểm dừng. Cho 

nhanh một lượng chế phẩm đã chỉ dẫn trong chuyên luận riêng vào cốc, đóng nút ngay, 

thêm tiếp một lượng chính xác thuốc thử Karl Fischer vào cốc sao cho thừa khoảng 1 

ml, hoặc theo một thể <strong>tích</strong> đã chỉ dẫn trong chuyên luận riêng. Đóng nút để yên 1 phút, 

tránh ánh sáng, thỉnh thoảng khuấy. Chuẩn độ phần thuốc thử Karl Fischer thừa bằng 

dung dịch nước chuẩn vừa mới pha ở trên. Tính hàm lượng nước A (tính bằng mg) có 

trong chế phẩm theo công thức: 

Trong đó: 

A = F × V1 - W × V2 

• F là đương lượng nước của thuốc thử Karl Fischer (tính bằng mg/ml); 


• V1 là thể <strong>tích</strong> thuốc thử Karl Fischer đã thêm vào (ml); 

• V2 là thể <strong>tích</strong> dung dịch nước chuẩn đã dùng (ml); 

• W là hàm lượng nước của dung dịch nước chuẩn ở trên (tính bằng mg/ml) [5]. 





35 











Định lượng nước bằng Kark Fischer đã được ứng <strong>dụng</strong> trong <strong>các</strong> chuyên luận 

nguyên liệu hóa dược của trong Dược điển Việt Nam V để xác định lượng nước trong 

<strong>các</strong> chế phẩm.Ví dụ như Acid folic (từ 5,0% đến 8,5%; dùng 0,150 g chế phẩm), 

Aminophylin (không quá 1,5% với dạng khan và 3,0% - 8,0% với dạng ngậm nước; 

dùng 0,50 g chế phẩm), Amlodipin besilat (không quá 0,5%; dùng 1,000 g chế phẩm),… 

d. Phương pháp chuẩn độ đo điện <strong>tích</strong> 

Theo Dược điển Việt Nam V- PL10.3: 

Nguyên tắc: Tương tự phương pháp định lượng nước bằng thuốc thử Karl Fischer, 

tuy nhiên iod được tạo ra bằng <strong>các</strong>h oxy hóa ion iodid tại buồng phản ứng điện hóa. Iod 

tạo thành ở anod phản ứng ngay với nước và lưu huỳnh dioxyd có trong buồng phản 

ứng. Hàm lượng nước trong chế phẩm tỷ lệ thuận với lượng điện <strong>tích</strong> tăng thêm cho đến 

khi kết thúc chuẩn độ. Điểm kết thúc đạt được khi toàn bộ nước phản ứng hết và iod dư 

xuất hiện. 1 mol iod tương ứng với 1 mol nước, 10,71℃ điện <strong>tích</strong> tương ứng với 1mg 

nước. Độ ẩm bị loại khỏi hệ thống bằng quy trình trước điện <strong>phân</strong>. Độ đúng và độ chính 

xác chủ yếu phụ thuộc vào mức độ loại bỏ được độ ẩm của môi trường ra khỏi hệ thống. 

Phương pháp chỉ áp <strong>dụng</strong> được với những mẫu có hàm lượng nước nhỏ, khoảng 

từ 10 µg đến 10mg nước [5]. 

e. Kỹ <strong>thuật</strong> sắc ký khí (GC) 

Trong sắc ký khí, pha động là một chất khí thường là khí trơ. Mẫu <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> được 

đưa vào đầu cột và quá trình rửa giải được thực hiện nhờ dòng khí trơ qua cột sắc ký. 

Trong GC, pha động không tương tác với chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> mà chỉ làm chức năng vận 

chuyển chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> qua cột. 

Trong sác ký khí - lỏng (GLC), chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> chỉ có thể di chuyển theo pha động 

qua cột khi nó ở thể khí. Vì vậy <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> GC được dùng để tách <strong>các</strong> chất tan bền với 

nhiệt. Quá trình tách phụ thuộc vào tính bay hơi của <strong>các</strong> chất tan – tức là điểm sôi của 

chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong>. Do áp suất hơi phụ thuộc vào tính bay hơi của chất tan nên quá trình rửa 


giải theo thứ tự điểm sôi tăng dần. Pha động đưa chất tan ra khỏi cột đến detector. Nhiệt 

độ cột dao động trong khoảng 50 – 350 ℃ đảm bảo chất tan bay hơi và đẩy nhanh quá 

trình rửa giải [3]. 





36 











dư [65]. 

Ứng <strong>dụng</strong>: Sắc ký khí là <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> phổ biến nhất để xác định dung môi tồn 

Ví dụ <strong>về</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> xác định độ tinh khiết gián tiếp bằng phương pháp cân bằng 

khối lượng: Trong nghiên cứu của tác giả Hui Gong đã <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> phương pháp cân bằng 

khối lượng để xác định độ tinh khiết của ứng viên chất chuẩn acid folic (xác định tạp 

liên <strong>quan</strong> bằng HPLC/DAD, xác định dung môi bay hơi bằng GC, hàm lượng nước bằng 

Karl Fischer và xác định tro bằng TGA) [33]; trong một nghiên cứu của tác giả Ningbo 

Gong cũng đã ứng <strong>dụng</strong> phương pháp cân bằng khối lượng trong phát triển chất chuẩn 

diosgenin [60]. 

3.2.2. Kỹ <strong>thuật</strong> xác định độ tinh khiết trực tiếp 

chính. 

Với <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> xác định độ tinh khiết trực tiếp thì % độ tinh khiết = % hoạt chất 

Các phương pháp điển hình cho <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> này như: chuẩn độ, <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> phản ứng 

có hệ số tỷ lượng đã biết, <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> độ hòa tan, quét nhiệt vi sai… Tuy nhiên, <strong>các</strong> phương 

pháp này chỉ đóng vai trò hỗ trợ để xác nhận lại giá trị độ tinh khiết thu được sau khi 

định lượng bằng <strong>các</strong> phương pháp khác [14], [20], [83]. 

3.2.2.1. Kỹ <strong>thuật</strong> quét nhiệt vi sai (DSC) 

Nguyên lý: Dựa trên hiện tượng trong <strong>các</strong> hệ eutectic nhiệt nóng chảy của <strong>các</strong> 

tinh thể bị giảm dưới ảnh hưởng của tạp chất. Khi đó độ tinh khiết được xác định dựa 

trên phương trình cơ bản của định luật Van Hoff: 

1/Fs = [H0/R] × [T0-Ts]/ T0 2 × [1/X2] 

Trong đó: Fs là <strong>phân</strong> số mẫu tan chảy tại thời điểm Ts, T0 là điểm nóng chảy của 

chất tinh khiết, Ts là nhiệt độ mẫu ở trạng thái cân bằng tức thời và nhiệt độ nóng chảy 

(°K), X2 là <strong>phân</strong> số mol của tạp chất trong mẫu, H0 là nhiệt độ nóng chảy của chất tinh 

khiết (J/g) và R là hằng số khí (J/mol) 8,314 [15], [68]. 

Yêu cầu: Nguyên liệu thiết lập chất chuẩn phải có độ tinh khiết cao > 95% và tốt 


nhất nên > 97% [62]. 

Chuẩn bị mẫu: 

• Sử <strong>dụng</strong> một lớp mẫu mỏng để giảm thiểu gradient nhiệt độ trong mẫu; 





37 











• Mẫu phải được <strong>phân</strong> bố đồng đều trên đĩa cân để đảm bảo tiếp xúc tốt với đáy 

đĩa cân; 

• Mẫu nên được dàn phẳng để đảm bảo <strong>các</strong> đặc tính truyền nhiệt giữa mẫu và 

cảm biến; 

• Mẫu nên được tiếp xúc với nắp đĩa cân để tăng nhiệt nhanh và tiếp xúc nhiệt 

tốt. 

Tác giả Paul Gabbott khuyến cáo lượng mẫu thường từ 1 mg – 3 mg [62]. 

DSC là <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> không phải <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> đến chất đối chiếu, vì vậy có giá 

trị tham khảo tốt bên cạnh giá trị ấn định của chất chuẩn thiết lập được khi <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> <strong>kỹ</strong> 

<strong>thuật</strong> định lượng bằng HPLC. Phương pháp này được khuyên <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> trong nghiên cứu 

thiết lập chất chuẩn đối chiếu. Theo Ph.Eur trong chuyên luận chung, độ tinh khiết của 

chất chuẩn gốc được xác định giá trị ấn định bằng <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> sắc ký hoặc phổ cần được 

xác minh độc lập bằng <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> DSC [26], [58]. 

Một số ví dụ ứng <strong>dụng</strong> DSC trong xác định độ tinh khiết chất chuẩn: trong một 

nghiên cứu của tác giả Kestens V. đã áp <strong>dụng</strong> phương pháp DSC để xác định độ tinh 

khiết của <strong>các</strong> hợp chất hydrocarbon thơm đa vòng (2 chất chuẩn được chọn là 6- 

methylchrysen và benzo[α] pyren) và hai lô khác của chất chuẩn chloramphenicol có độ 

tinh khiết cao [49]; tác giả Haifeng Wang cũng đã xác định độ tinh khiết của nhôm 8- 

hydroxyquiolin bằng <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> DSC [30], hay nghiên cứu xác định độ tinh khiết đa hình 

của chất chuẩn nateglinid bằng <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> DSC của tác giả Bruni G. [16], nghiên cứu phát 

triển ứng viên chất chuẩn gốc natri diclofenac bằng <strong>các</strong>h <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> 1 H qNMR để 

xác định độ tinh khiết và xác nhận lại dữ liệu bằng <strong>các</strong>h <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> phương pháp cân bằng 

khối lượng của tác giả Raquel Nogueira [63]. 

3.2.2.2. Kỹ <strong>thuật</strong> phổ cộng hưởng từ hạt nhân định lượng (qNMR) 

Phổ NMR định lượng <strong>các</strong> tạp chất dựa trên sự tuyến tính giữa cường độ của một 

cộng hưởng nhất định với số hạt nhân tham gia cộng hưởng đó. 

Có hai <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> định lượng là: 


– Định lượng tương đối: Việc xác định tỉ lệ <strong>các</strong> thành phần trong hỗn hợp dựa trên sự 

so sánh cường độ tương đối giữa <strong>các</strong> cộng hưởng xuất hiện trên phổ đồ, giống như 

<strong>các</strong>h tính trong phương pháp chuẩn hóa diện <strong>tích</strong>. Có thể không cần <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> đến chất 

chuẩn nội tuy nhiên cần phải chứng minh không có sự chồng chéo giữa <strong>các</strong> tín hiệu 

38 















với nhau. Khi tạp có cấu trúc hoặc khối lượng <strong>phân</strong> tử chưa xác định thì việc bổ sung 

một lượng chính xác chất chuẩn sẽ cho phép tạo đường chuẩn để xác định. 

– Định lượng tuyệt đối: Cần dùng chất chuẩn nội. Khối lượng chất được xác định như 

sau [14], [27]: 

Trong đó: 

• mA là khối lượng của chất cần <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> (A). 

• mB là khối lượng đã biết của một chất (B) được thêm vào dung dịch theo tiêu 

chuẩn cường độ, có hàm lượng phần trăm (PB) đã biết. 

• MA, MB là <strong>phân</strong> tử khối của chất A và B. 

• NA, NB là số hạt nhân tạo ra tín hiệu <strong>quan</strong> tâm trong A và B. 

• IA, IB là cường độ tín hiệu của A và B. 

Trong qNMR, số lượng điểm dữ liệu thu được phải đủ lớn để mô tả hình dạng 

của tín hiệu một <strong>các</strong>h chính xác. Lý tưởng nhất là hơn 10 điểm phải ở trên một nửa chiều 

cao đỉnh [27], [29], [77]. 

Vậy ưu điểm của phương pháp là: không <strong>phân</strong> hủy mẫu và cần ít thời gian. Tín 

hiệu cộng hưởng tỉ lệ với số hạt nhân cộng hưởng tại tần số đó cho phép xác định tỉ lệ 

tương đối giữa <strong>các</strong> thành phần trong hỗn hợp. Nếu có chất đối chiếu có thể xác định 

được nồng độ <strong>các</strong> chất [3]. 

Ví dụ: ứng <strong>dụng</strong> qNMR trong nghiên cứu acetanilid (được thiết lập và được <strong>sử</strong> 

<strong>dụng</strong> là một chất chuẩn gốc) [76]. 

3.2.3. Kết hợp cả 2 <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> xác định độ tinh khiết trực tiếp và gián tiếp 

Cách tiếp cận này có thể cung cấp một sự đánh giá chéo <strong>các</strong> kết quả thu được từ 

hai <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> xác định độ tinh khiết trực tiếp và gián tiếp. Nếu kết quả khác biệt nhau 

nhiều, cần tiến hành đánh giá lại để tìm nguyên nhân. Điều này đảm bảo rằng tất cả <strong>các</strong> 


tạp chất đã được <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> hợp lý trong quá trình đánh giá. 





39 








CHƯƠNG 4. TÌNH HÌNH THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GỐC TRÊN THẾ GIỚI 

VÀ Ở VIỆT NAM 




4.1. Tình hình thiết lập chất chuẩn gốc trên thế giới 

Trên thế giới có <strong>các</strong> trung tâm thiết lập chất chuẩn gốc lớn như Hội đồng Dược 

điển quốc tế, Hội đồng Dược điển Mỹ, Hội đồng Dược điển Châu Âu,… và một số công 

ty Dược phẩm lớn khác như Merk, LGC standards,… 

Một trong những trung tâm thiết lập chất chuẩn lớn trên thế giới là Trung tâm 

thiết lập chất chuẩn của WHO. Theo báo cáo số 32 của WHO trong loạt báo cáo <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> 

832, năm 2005, WHO đã thiết lập thêm bốn chất chuẩn gốc mới là Didanosin, Didanosin 

cho sự phù hợp hệ thống, Efavirenz, Nevirapin [86]. Theo báo cáo năm 2014, Ban ICRS 

đã xét <strong>các</strong> báo cáo thiết lập và giám sát ICRS dẫn đến thông qua <strong>các</strong> chất chuẩn gốc mới 

(Biperiden HCl ICRS 1, Clofazimine ICRS 1, Cytarabine ICRS 1, Dextromethorphan, 

Hydrobromide ICRS 1, Gallamine triethiodide ICRS 1, Glibenclamide ICRS 1, 

Quinidine sulfate ICRS 1, Salbutamol sulfate ICRS 1, Vimolol maleate ICRS 1, 

Valproic acid ICRS 1, Verapamil HCl ICRS 1) [84]. Một ví dụ <strong>về</strong> thiết lâp chất chuẩn 

Indinavir năm 2005 của WHO xem phụ lục 3. 

Hội đồng Dược điển Châu Âu cung cấp chất chuẩn Dược điển Châu Âu cho tất 

cả <strong>các</strong> phép thử và phép định lượng trong <strong>các</strong> chuyên luận được đề cập trong Dược điển 

Châu Âu, ngoài ra còn tham gia chương trình hợp tác phát triển CCĐC của Trung tâm 

hợp tác <strong>về</strong> chất chuẩn gốc của WHO [26]. Từ 16/04/2010, EDQM chịu trách nhiệm thiết 

lập, lưu trữ và <strong>phân</strong> phối <strong>các</strong> ICRS của WHO từ Apoteket AB (trung tâm cộng tác WHO 

trước đây <strong>về</strong> ICRS) [23]. Trong năm 2015, EDQM đã triển khai 26 dự án trong <strong>các</strong> lĩnh 

vực như khác nhau dẫn đến việc thiết lập 5 chất chuẩn gốc mới; 8 dự án tiến hành để 

thiết lập <strong>các</strong> lô thay thế cho chác chất chuẩn gốc trước đó; 5 dự án tiến hành để xây dựng 

<strong>các</strong> CCĐC cho <strong>các</strong> chuyên khảo mới hoặc <strong>các</strong> yêu cầu mới trong <strong>các</strong> chuyên khảo đã 

có. Cũng trong năm 2015, Ban ICRS đã thông qua 5 báo cáo thiết lập được đưa ra bởi 

PTN của EDQM (Abacavir sulfate ICRS 2; Paracetamol ICRS 3; Artemether ICRS 2, 


Rifampicin ICRS 3 và Stavudine impurity F ICRS 1). Vào cuối năm 2015, đã có 2.708 

CCĐC trong Ph.Eur [24]. Trong năm 2016, EDQM đã thiết lập được 4 chất chuẩn gốc, 

tiến hành 7 dự án nhằm thiết lập <strong>các</strong> lô thay thế cho <strong>các</strong> CCĐC hiện hành và 8 dự án để 

40 















xây dựng <strong>các</strong> chất chuẩn cho <strong>các</strong> chuyên luận mới hoặc <strong>các</strong> yêu cầu mới trong chuyên 

luận hiện hành [25]. Hiện tại theo danh sách cập nhật tháng 05/2018, EDQM cung cấp 

hơn 2.800 CCĐC và giá của <strong>các</strong> chất chuẩn dao động trong khoảng 79-1000 € [23]. 

Hội đồng Dược điển Mỹ cung cấp CCĐC Dược điển Mỹ cho tất cả <strong>các</strong> dược chất, 

tá dược, tạp chất, sản phẩm <strong>phân</strong> hủy và thực phẩm chức năng có đề cập trong <strong>các</strong> 

chuyên luận của Dược điển Mỹ. Việc thiết lập USPR được thực hiện bởi ít nhất 3 PTN 

đáp ứng tiêu chuẩn [80]. Lịch <strong>sử</strong> phát triển <strong>về</strong> thiết lập chất chuẩn gốc của USP từ năm 

1936 danh sách chất chuẩn gốc chỉ có 6 chất nhưng đến năm 2013 đã phát triển mạnh 

và danh sách chất chuẩn gốc lên tới hơn 3000 chất chuẩn với hơn 400 chất chuẩn mới 

trong <strong>các</strong> giai đoạn khác nhau của phát triển thuốc mới [79]. Hiện nay USP đang cung 

cấp hơn 3.500 CCĐC của hợp chất thuốc, tá dược, tạp chất, sản phẩm <strong>phân</strong> huỷ, thực 

phẩm chức năng,… Giá của <strong>các</strong> CCĐC này dao động từ 125,00 - 2.875,00 $ theo thống 

kê cập nhật vào tháng 05/2018 [74]. 

Bên cạnh <strong>các</strong> hội đồng dược điển cung cấp <strong>các</strong> chất chuẩn gốc thì <strong>các</strong> trung tâm 

nghiên cứu và <strong>các</strong> nhà phát minh thuốc mới cũng đã nghiên cứu và công bố <strong>các</strong> kết quả 

của mình, ví dụ như thiết lập chất chuẩn gốc Glibenclamid [51], Itraconazol [18],… và 

một số nghiên cứu của <strong>các</strong> tác giả [48], [58] (Xem phần phụ lục 4,5,6). 

4.2. Tình hình thiết lập chất chuẩn gốc tại Việt Nam 

Hiện nay ở Việt Nam chưa có báo cáo <strong>về</strong> hoạt động thiết lập chất chuẩn gốc mà 

chủ yếu chỉ có hoạt động thiết lập chất chuẩn thứ cấp. Hai đơn vị cung cấp chất chuẩn 

chính thức là Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương (48 Hai Bà Trưng, Hoàn Kiếm, Hà 

Nội) và Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP.HCM (200 Cô Bắc, Quận 1, TP.HCM) [5]. 

Năm 2008 - 2010, VKNTTƯ đã phối hợp với <strong>các</strong> cơ sở nghiên cứu trong nước 

như Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Dược liệu,… thực hiện đề tài nghiên cứu cấp 

Nhà nước thiết lập 10 chất chuẩn đối chiếu quốc gia có nguồn gốc dược liệu và thành 

phẩm thuốc có nguồn gốc dược liệu [1]. 


Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương hiện cung cấp 10 chất chuẩn thứ cấp từ 

dược liệu bên cạnh hàng trăm chất chuẩn tân dược. Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. HCM 

cung cấp 213 chất chuẩn tân dược và 18 chất chuẩn từ dược liệu (8/2013) [9], [10]. 





41 











Kết quả dự án cấp Sở (Sở KH&CN TP.HCM): “Điều chế chất chuẩn đối chiếu 

phục vụ kiểm nghiệm dược liệu và đông dược” (2008-2012) 

- Đã chiết xuất, <strong>phân</strong> lập, điều chế được 10 hợp chất tinh khiết từ dược liệu gồm acid 

oleanolic, asiaticosid, berberin chlorid, curcumin I, damnacanthal, diosgenin, 

hesperidin, ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rg1 và majonosid-R2 đạt yêu cầu số lượng 

và chất lượng dự án đã đặt ra. 

- Đã thẩm định 10 chất chuẩn này theo đầy đủ <strong>các</strong> tiêu chí của chất chuẩn gốc theo 

TCCS và đang tiến tới đăng kí chất chuẩn quốc gia. 

- Đã xây dựng thiết lập quy trình điều chế ổn định, kinh tế, có tính lặp lại cao cho 10 

chất chuẩn [10]. 






42 








KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 




1.1. Kết luận 

Bài tổng <strong>quan</strong> trên đây đã đưa ra cho chúng ta những hiểu biết cơ bản nhất <strong>về</strong> 

thiết lập chất chuẩn gốc như: 

1. Hệ thống được <strong>các</strong> khái niệm cơ bản nhất <strong>về</strong> chất chuẩn gốc và <strong>các</strong> bước trong 

quy trình thiết lập chất chuẩn gốc; 

2. Hệ thống hóa được <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> xây dựng được bộ dữ liệu để nhận dạng chất 

chuẩn gốc; 

3. Hệ thống được <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> xác định độ tinh khiết của một chất chuẩn gốc theo 

cả hai phương pháp trực tiếp và gián tiếp. 

Chất chuẩn có vai trò <strong>quan</strong> trọng trong kiểm tra chất lượng ngành Dược. Công 

tác thiết lập chất chuẩn gốc là rất cần thiết khi nghiên cứu phát triển thuốc mới (đặc biệt 

là trong xu hướng nghiên cứu phát triển thuốc mới nguồn gốc Dược liệu như hiện nay), 

trong trường hợp không có chất chuẩn gốc hoặc không tìm được chất chuẩn để nối. 

Nhìn chung, công tác thiết lập chất chuẩn gốc ở nước ta còn khá hạn chế, vì vậy 

việc thiết lập chất chuẩn gốc sẽ giúp chúng ta giảm được sự phụ thuộc vào <strong>các</strong> nguồn 

chuẩn gốc từ nước ngoài cũng như giảm được giá thành của chất chuẩn gốc. 

1.2. Đề xuất 

Khóa luận này đã cho chúng ta một cái nhìn tổng quát <strong>về</strong> thiết lập chất chuẩn gốc. 

Việc thiết lập chất chuẩn gốc còn mới và đang bắt đầu được <strong>quan</strong> tâm ở nước ta trong 

nghiên cứu và phát triển thuốc mới. Hiện nay, còn rất ít nghiên cứu <strong>về</strong> việc thiết lập chất 

chuẩn gốc. Bên cạnh những kết quả thu được, để hoàn thiện cũng như nâng cao tính ứng 

<strong>dụng</strong> thực tế, tôi xin đưa ra một số đề xuất để tiếp tục phát triển công tác thiết lập chất 


chuẩn gốc nói chung và ứng <strong>dụng</strong> chúng trong ngành Dược nói riêng như sau: 

‣ Tăng cường học hỏi, nghiên cứu và thực nghiệm trong công tác thiết lập chất 

chuẩn gốc tại Việt Nam, bên cạnh đó hợp tác quốc tế với <strong>các</strong> trung tâm thiết 





43 











lập chất chuẩn gốc của quốc tế, Mỹ, Châu Âu,… để nâng cao trình độ trong 

công tác thiết lập chất chuẩn gốc; 

‣ Phối hợp với <strong>các</strong> đơn vị nghiên cứu phát triển thuốc mới, Viện kiểm nghiệm 

thuốc Trung Ương và Viện kiểm nghiệm thuốc TP.HCM để đẩy mạnh việc 

thiết lập chất chuẩn gốc tại Việt Nam theo đúng hướng dẫn chung của WHO; 

‣ Đặc biệt <strong>quan</strong> tâm đến một hướng đi rất đáng chú ý và tiềm năng ở nước ta đó 

là thiết lập chất chuẩn gốc có nguồn gốc từ Dược liệu. 






44 











Tiếng Việt 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 

1. Bộ Khoa học và Công nghệ (2010), Nghiên cứu chiết tách, tinh chế một số hợp 

chất tự nhiên đặc trưng từ dược liệu để làm chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm dược liệu, 

mã đề tài: KC.10.16/06.10. 

2. Bộ môn hóa <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> và độc chất (2004), Kiểm nghiệm thuốc, Trường đại học 

Dược Hà Nội, tr.72-79. 

3. Bộ môn hóa <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> và độc chất (2012), Hóa <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> II, Trường đại học Dược 

Hà Nội, Hà Nội, tr.43-69, 84-90, 98-106,107-121,123-213,215-235. 

4. GS. Nguyễn Văn Đàn, DS. Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu 

hóa học cây thuốc, Nhà xuất bản y học, TP HCM, tr.75-196. 

5. Hội đồng Dược điển Việt Nam (2017), Dược điển Việt Nam V, Bộ Y tế. 

6. Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở <strong>các</strong> phương pháp phổ ứng <strong>dụng</strong> trong hóa 

học, Nhà xuất bản khoa học và <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong>, Hà Nội, tr.14-62,72-141,185-358,426-536. 

7. Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Võ Ngọc Trái, et al. (2014), "Phân lập và thiết lập chất 

đối chiếu Isoquercitrin", Nghiên cứu y học, 18(2), tr.2-7. 

8. PGS.TS. Trịnh Thị Thủy (2012), Ứng <strong>dụng</strong> <strong>các</strong> phương pháp phổ trong <strong>phân</strong> 

<strong>tích</strong> cấu trúc <strong>các</strong> hợp chất- Chương trình phát triển nguồn nhân lực y tế, Trường Đại 

học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr.1-25. 

9. Trung tâm Thông tin Khoa học & Công nghệ TP.HCM (2013), "Phân <strong>tích</strong> xu 

hướng nghiên cứu điều chế và thiết lập chất chuẩn để phục vụ công tác nghiên cứu và 

kiểm nghiệm trên cơ sở số liệu sáng chế quốc tế". 

10. Trung tâm Thông tin Khoa học và công nghệ TP.HCM, GS.TS. Nguyễn Minh 

Đức (2013), Điều chế và thiết lập chất chuẩn từ thiên nhiên để phục vụ công tác nghiên 

cứu, kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hóa Dược liệu, Đông dược, Sở khoa học và công nghệ 

TP HCM,Trung tâm Thông tin Khoa học và Công nghệ, TP HCM, tr.4-43. 

Tiếng Anh 

11. Altria K.D. (1996), "Determination of drug-related impurities by capillary 


electrophoresis", Journal of Chromatography A, 735(1-2), pp.43-56. 

12. BIPM, IEC, et al. (2012), JCGM 200:2012 International vocabulary of 

metrology – Basic and general concepts and associated terms (VIM) pp.50. 















13. Blessy M, Ruchi D. Patel, et al. (2014), "Development of forced degradation and 

stability indicating studies of drugs-A review", Journal of Pharmaceutical Analysis, 

4(3), pp.159-165. 

14. British Pharmacopoeia Commission (2014), The British pharmacopoeia 

Stationery Office Books (TSO). 

15. Brown M. E. (1979), "Determination of purity by differential scanning 

calorimetry (DSC)", Journal of Chemical Education 56(5), pp.310-313. 

16. Bruni G., Berbenni V., et al. (2011), "Determination of the nateglinide 

polymorphic purity through DSC", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 

54(5), pp.1196-1199. 

17. Charde M.S., Kumar Jitendra, et al. (2013), "Review: Development of forced 

degradation studies of drugs", International Journal of Advances in Pharmaceutics, 

2(3), pp.1-5. 

18. Christian Zeine, LGC Standards GmbH (2013), Primary/secondary standards in 

pharmaceutical QC, LGC standards, pp.1-40. 

19. Chung Chow Chan, Herman Lam, et al. (2004), Analytical Method Validation 

and Instrument Performance Verification- Chapter 3: Method Validation for HPLC 

Analysis of Related Substances in Pharmaceutical Drug Products, pp.27-48. 

20. Committee on Asean reference substance (2005), Guidelines for the 

establishment, handling, storage and use of Asean reference substances, Thailand, pp.2- 

12. 

21. David C.Browne (2009), "Reference Standard Material Qualification", 

Pharmaceutical Technology,, 33(4), pp.1-6. 

22. David Kealey, P J Haines (2002), Instant Notes in Analytical Chemistry, pp.270- 

282, 302-304. 

23. EDQM Council of Europe (2018), from 

https://www.edqm.eu/en/news/reference-standards. 

24. European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare (EDQM) 


(2015), Annual Report, Council of Europe EDQM, pp.1-44. 


(2016), Annual Report, Council of Europe EDQM, pp.1-43. 
















(2017), European Pharmacopoeia 9 th Edition. 

27. European Federation of National Associations of Measurement Testing and 

Analytical Laboratories (2014), Guide to NMR Method Development and Validation- 

Part I: Identification and Quantification, pp.1-18. 

28. European Medicines Agency (2016), ICH guideline Q3C (R6) on impurities: 

guideline for residual solvents, pp.7-17. 

29. Frank Malz (2003), Quantitative NMR-Spektroskopie als Referenzverfahren in 

der analytischen Chemie, Dissertation, pp.5-115. 

30. Haifeng Wang, Jia Li, et al. (2009), "Purity determination of 8-hydroxyquioline 

aluminum by differential scanning calorimetry", Synthetic Metals, 159(1-2), pp.162- 

165. 

31. Harry G. Brittain (2009), Polymorphism in Pharmaceutical Solids, Drugs and the 

pharmaceutical sciences, pp.318-480. 

32. Harry G. Brittain, Susan J. Bogdanowich, et al. (1991), "Physical 

Characterization of Pharmaceutical Solids", Pharmaceutical Research, 8(8), pp.963- 

973. 

33. Hui Gong, Ting Huang, et al. (2012), "Purity determination and uncertainty 

evaluation of folic acid by mass balance method", Talanta, 101, pp.96-103. 

34. ICH (2000), Q6A Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for 

New Drug Substances and New Drug Products: Chemical Substances, pp.1-31. 

35. ICH (2015), Q3D Elemental Impurities-Guidance for Industry, pp.5-13. 

36. ICH (2016), Impurities: Guideline for Residual Solvents Q3C(R6), pp.1-34. 

37. ICH (2016), Q7 Good Manufacturing Practice Guidance for Active 

Pharmaceutical Ingredients FDA, pp.1-52. 

38. ICH Expert Working Group (2006), Impurities in new drug products Q3B(R2), 

pp.6. 

39. ICH guideline (2006), impurities in new drug substances Q3A(R2), pp.1-11. 


40. International Laboratory Accreditation Cooperation (ILAC) G9 (2005), 

Guidelines for the selection and use of reference materials, pp.4-15. 















41. International Laboratory Accreditation Cooperation (ILAC) G12 (2000), 

Guidelines for the requirements for the competence of reference materials producers, 

pp.6-7. 

42. International Organization for Standardization 13528 (2005), Statistical methods 

for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons. 

43. International Organization for Standardization (2015), ISO Guide 30:2015 

Reference materials - Selected terms and definitions. 

44. International Organization for Standardization (2017), ISO Guide 35: Reference 

materials -Guidance for characterization and assessment of homogeneity and stability. 

45. ISO/REMCO (2005), Committee on reference materials, pp.10. 

46. John G.Dorsey, William T.Cooper, et al. (1998), "Liquid Chromatography: 

Theory and Methodology", Analytical chemistry, pp.591-644. 

47. Jouyban1 Abolghasem, Kenndler Ernst (2008), "Impurity analysis of 

pharmaceuticals using capillary electromigration methods", electrophoresis, 29(17), 

pp.3531-3551. 

48. Kang Ma, Haifeng Wang, et al. (2009), "Purity determination and uncertainty 

evaluation of theophylline by mass balance method, high performance liquid 

chromatography and differential scanning calorimetry", Analytica Chimica Acta, 

650(2), pp.227-233. 

49. Kestens V., Zeleny R., et al. (2011), "Differential scanning calorimetry method 

for purity determination: A case study on polycyclic aromatic hydrocarbons and 

chloramphenicol", Thermochimica Acta, 524, pp.1-6. 

50. Kishore Kumar Hotha, Satti Phani Kumar Reddy, et al. (2013), "Forced 

degradation studies: practical approach-overview of regulatory guidance and literature 

for the drug products and drug substances", International research journal of pharmacy, 

4(5), pp.78-84. 

51. LGC Standards (2014), Pharmaceutical impurities and primary reference 

standards 2014, pp.1/10-10/10. 


52. Li Y.M., Schepdael A. Van, et al. (1998), "Development and validation of 

amoxicillin determination by micellar electrokinetic capillary chromatography", 

Journal of Chromatography A, 812(1-2), pp.227-236. 















53. Lommen A., Schilt R., et al. (2002), "Application of 1D 1 H NMR for fast nontargeted 

screening and compositional analysis of steroid cocktails and veterinary drug 

formulations administered to livestock", Journal of Pharmaceutical and Biomedical 

Analysis, 28, pp.87-96. 

54. Lurie Ira S., Anex Deon S., et al. (2001), "Profiling of impurities in heroin by 

capillary electrochromatography and laser-induced fluorescence detection", Journal of 

Chromatography A, 924(1-2), pp.421-427. 

55. Man He, Lijin Huang, et al. (2017), "Advanced functional materials in solid 

phase extraction for ICP-MS determination of trace elements and their species - A 

review", Analytica Chimica Acta, 973, pp.1-24. 

56. Marcinkowska M, Barałkiewicz D (2016), "Multielemental speciation analysis 

by advanced hyphenated technique - HPLC/ICP-MS: A review", Talanta, 161, pp.177- 

204. 

57. Marta Zalewska, Karol Wilk, et al. (2013), "Capillary electrophoresis application 

in the analysis of the anti-cancer drugs impurities", Polish Pharmaceutical Society, 

pp.171-180. 

58. Mathkar S., Kumar S., et al. (2009), "The use of differential scanning calorimetry 

for the purity verification of pharmaceutical reference standards", Journal of 

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 49, pp.627-631. 

59. May W., Parris R., et al. (2000), Definitions of Terms and Modes Used at NIST 

for Value-Assignment of Reference Materials for Chemical Measurements, National 

Institute of Standards and Technology (NIST), pp.1-12. 

60. Ningbo Gong, Baoxi Zhang, et al. (2014), "Development of a new certified 

reference material of diosgenin using mass balance approach and Coulometric titration 

method", Steroids, 92, pp.25-31. 

61. Organization World Health (2012), 2.3 Sulfated ASH. 

62. Paul Gabbott, Perkin Elmer, et al. (2014), "Practical Purity Determination by 

DSC", Thermal Analysis, pp.1-5. 


63. Raquel Nogueira, Bruno C.Garrido, et al. (2013), "Development of a new sodium 

diclofenac certified reference material using the mass balance approach and 1 H qNMR 

to determine the certified property value", European Journal of Pharmaceutical 

Sciences, 48(3), pp.502-513. 















64. Roger L. Blaine, Ph.D.John E. Rose (2004), "Validation of Thermogravimetric 

Analysis Performance Using Mass Loss Reference Materials", TA Instruments, pp.1-9. 

65. Sandor Gorog (2000), Identification and Determination of Impurities in Drugs, 

Elsevier, pp.9-728. 

66. Satinder Ahuja, Karen Mills Alsante (2004), Handbook of Isolation and 

Characterization of Impurities in Pharmaceuticals, Separation Science and Technology, 

pp.1-25,27-37,75-88,89-117,119-143,249-299,301-339. 

67. Saudi Food & Drug Authority (2010), 

Policy Guidance for Pharmaceutical Reference Standard, pp.6-8. 

68. Sichina W.J., Manager National Marketing (2000), "Purity Measurements of 

Pharmaceuticals and Organics by DSC", Thermal Analysis, pp.1-4. 

69. Society of Japanese Pharmacopoeia (2011), Japanese Pharmacopoiea 16 th 

Edition. 

70. Stephen R Byrn , Ralph R Pfeiffer, et al. (1999), Solid-State Chemistry of Drugs- 

Chapter 8: Infrared Spectroscopy of Solids, Chapter 8, West Lafayette, pp.111-117. 

71. Stephen R Byrn , Ralph R Pfeiffer, et al. (1999), Solid-state chemistry of drugs - 

Chapter 4: Microscopy, West Lafayette, pp.69-78. 

72. Suryakanta Swain, Prafulla Kumar Sahu, et al. (2014), "An Overview of 

Pharmaceutical Impurities and Degradation Products", Pharmaceutical Regulatory 

Affairs, 4(1), pp.1. 

73. The Korean Food and Drug Administration (KFDA) (2012), Korean 

Pharmacopoiea X, pp.1607-1610,1619-1620,1653,1685,1688,1698,1706. 

74. The United States Pharmacopeial Convention (2018), "Reference Standards", 

from http://www.usp.org/reference-standards/reference-standards-catalog. 

75. Tina Zöllner, Michael Schwarz (2013), "Herbal Reference Standards: 

applications, definitions and regulatory requirements", pp.1-18. 

76. Torgny Rundlöf, Ian McEwena, et al. (2014), "Use and qualification of primary 

and secondary standards employed in <strong>quan</strong>titative 1 H NMR spectroscopy of 


pharmaceuticals", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 93, pp.111-117. 

77. Torsten Schoenberger (2012), "Determination of standard sample purity using 

the high-precision 1 H-NMR process", Anal Bional Chem, 403, pp.247-254. 















78. U.S Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, 

et al. (2017), Annex 1(R1) Residue on Ignition/Sulphated Ash. 

79. U.S. Pharmacopeial Convention (2013), USP Reference Standards, pp.1-32. 

80. United States Pharmacopeial Convention Inc (2017), USP 40-NF 35 The United 

States Pharmacopoeia and National Formulary 2017, Deutscher Apotheker Verlag. 

81. USP Council of Experts, USP Reference Standards Committee, et al. (2012), 

"Primary and Secondary Reference Materials for Procedures to Test the Quality of 

Medicines and Foods", Pharmaceutical Research, 29(4), pp.922-931. 

82. Veronika R.Meyer (2004), Practical High-Performance Liquid 

Chromatography, pp.4-319. 

83. WHO (2007), "General guidelines for the establishment, maintenance and 

distribution of chemical reference substances", WHO technical report series, annex 

3(943), pp.61-82. 

84. WHO (2014), WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical 

Preparations-Forty eighth report, pp.21-25. 

85. WHO (2017), The International Pharmacopoeia, Seventh Edition. 

86. WHO, V. Hjortsberg (2005), WHO Collaborating Center for Chemical 

Reference Substances-Report on the work in 2005 pp.1-96. 

87. Yiu-chung Yip, Siu-kay Wong, et al. (2011), "Assessment of the chemical and 

enantiomeric purity of organic reference materials", Trends in Analytical Chemistry, 

30(4), pp.628-640. 













PHỤ LỤC 




Phụ lục 1: Ví dụ <strong>về</strong> ứng <strong>dụng</strong> của CE trong <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> tạp chất liên <strong>quan</strong> của Amoxicillin. 

Phụ lục 2: Thiết lập chất chuẩn Indinavir theo hướng dẫn của WHO. 

Phụ lục 3: Thiết lập chất chuẩn gốc Glibenclamid. 

Phụ lục 4: Ví dụ <strong>về</strong> thiết lập 6 chất chuẩn gốc. 

Phụ lục 5: Xác định độ tinh khiết của chất chuẩn gốc Theophylin bằng phương pháp cân 

bằng khối lượng và DSC. 






PL-1 











Phụ lục 1: Ví dụ <strong>về</strong> ứng <strong>dụng</strong> của CE trong <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> tạp chất liên <strong>quan</strong> của 

Amoxicillin 

Ví dụ <strong>về</strong> Phương pháp MEKC đã được phát triển và phê chuẩn cho <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> 

amoxicillin và <strong>các</strong> tạp chất tiềm ẩn. Điều kiện: Hệ đệm chảy, natri dihydrogenphosphat 

70mM, SDS 125mM và acetonitrin 5%, điều chỉnh pH đến 6.0, chiều dài của mao quản 

silic nóng chảy không tráng 44cm (chiều dài hiệu <strong>dụng</strong> 36cm) × 50 µm I.D, điện áp 15 

kV, nhiệt độ 25℃, bước sóng phát hiện 230 nm. Phương pháp cho phép amoxicillin hoàn 

toàn tách khỏi <strong>các</strong> tạp chất tiềm ẩn của nó (Hình 3.1) 

Sự hấp thụ UV (0.1 

Thời gian di chuyển (phút) 

Hình 3.1 Hình ảnh <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> MEKC của một mẫu muối natri amoxicillin [52]. 






PL-2 








Phụ lục 2: Thiết lập chất chuẩn Indinavir theo hướng dẫn của WHO (2005) [86] 




Nguyên liệu: Khoảng 200 g mẫu (lô của nhà sản xuất số L-000735524-002L039) đã 

được nhận tại trung tâm WHO vào tháng 05/2005. Nguyên liệu được bảo quản trong 

bao bì kín ở + 5℃, tránh ánh sáng. 

Dữ liệu <strong>phân</strong> <strong>tích</strong>: 

- Mô tả: Bột màu trắng. 

- Bằng chứng <strong>về</strong> cấu trúc hóa học: 

• Phổ hồng ngoại: Một phổ hồng ngoại được đưa ra trong hình 4.1 dưới đây (số 

W105231). 

Hình 4.1 Phổ IR của 1,5 mg Indinavir số kiểm soát 105231 trong 300 mg kali 

bromid được ghi lại trên đĩa kali bromid 

• Phổ UV: Một phổ UV trong Methanol được ghi lại trên máy <strong>quan</strong>g phổ Varian 

Cary 5. Quang phổ thu được như hình 4.2. 

Một cực đại hấp thu UV được <strong>quan</strong> sát ở khoảng 260 nm; 

1% = 60 ở bước sóng 260 nm (n = 6, RSD = 0,7%); 

A 1cm 


Các tính toán được thực hiện tham chiếu với chất khô. 





PL-3 











- Phân <strong>tích</strong> 

Hình 4.2 Phổ UV của Indinavir số kiểm soát 105231, 101 µg/ml trong methanol 

• Phân <strong>tích</strong> nhiệt trọng lượng: Khi hợp chất được làm nóng đến nhiệt độ 105℃, 

<strong>quan</strong> sát thấy mất 2,9% (kl/kl) (n = 6, RSD = 4,1%). 

• Nước: 2,9% (n = 3) được xác định bằng chuẩn độ Karl Fischer. 

• Dung môi tồn dư: <strong>Tổng</strong> hàm lượng < 0,1%. Không phát hiện thấy đỉnh nào. 

Phép thử bao gồm dung môi tồn dư nhóm 1, nhóm 2, nhóm 3 theo phương pháp 

trong Ph.Eur 5.0. 

Hệ thống A: Các dung dịch đối chiếu tương ứng với <strong>các</strong> nồng độ sau của dung 

môi tồn dư trong mẫu: Benzen (2 ppm), Carbontetrachlorid (4 ppm), 1,2- 

Dichloroethan (5 ppm), 1,1-Dichloroethen (8 ppm), 1,1,1-Trichloroethan (10 

ppm), Acetonitril (410 ppm), Chlorobenzen (360 ppm), Cyclohexan (3880 ppm), 

1,2-Dichloroethen (1870 ppm), Methylen chlorid (600 ppm), 1,4-Dioxan (380 

ppm), Methanol (3000 ppm), Methylcyclohexan (1180 ppm), 

Tetrahydrofuran (720 ppm), Toluen (890 ppm) và Xylen (2170 ppm). 

Hàm lượng dung môi tồn dư được kiểm tra bằng sắc ký khí với <strong>các</strong> điều kiện sau: 


- Thiết bị: GC Hewlett Packard 

6890; 

- Chương trình nhiệt độ: 40°C trong 20 

PL-4 

phút, 10°C/phút và giữ 240°C trong 

20 phút; 















- Cột: DB-624 (30 m x 0.32 

mm, phim 1.8 µm); 

- Tiêm mẫu: Đầu tiêm HP 7694; 

- Khí mang: Heli (2.2 ml/phút); - Nhiệt độ phun: 140℃; 

- Tách: 1:2; - Nhiệt độ lò HS: 105℃; 

- Detector: FID; - Thăng bằng vial: lắc chậm 60 phút; 

- Nhiệt độ đầu dò: 250℃; - Thể <strong>tích</strong> vòng lặp: pha khí 1,0 ml. 

- Độ tinh khiết: 

• Sắc ký lớp mỏng: 

Bản mỏng: Silica gel 60 F-254 TLC (Merck); 

Dung môi rửa giải: Dicloromethan: methanol: dung dịch amoni 25% (83: 15: 2) 

Mẫu: 450 µg indinavir hòa tan trong metanol. 

Hình ảnh: Quét ở 254 nm bằng máy quét CAMAG TLC 3 

Rf (indinavir) = 0,6 

Giới hạn định lượng khoảng 1 µg (0,2%), khi quét ở bước sóng 254 nm. 

• HPLC: 

Độ tinh khiết theo chuẩn hóa diện <strong>tích</strong>: 99,8% (n = 6, RSD = 0.04% đối với pic 

chính, RSD=25.8% được tính trên mức tạp chất). 14 tạp chất trên giới hạn định 

lượng được phát hiện. Sắc ký đồ thể hiện trong hình 4.3. 

Các điều kiện: 

Dung môi rứa giải: 

- A: Acetonitril: đệm phosphat pH 7.5: nước (30: 5: 65); 

- B: Acetonitril: đệm phosphat pH 7,5: nước (70: 5: 25) 

- 1,8 g dinatri hydrogen phosphat, dihydrat, hòa tan trong khoảng 50 ml nước. 

pH được điều chỉnh đến 7,5 với 1 M acid photphoric. Dung dịch được pha 

loãng thành 100,0 ml bằng nước và lọc. 






PL-5 








Thành phần dung 

môi rửa giải 

% A % B Thời gian Loại 

(phút) 

93 7 0 – 5 Đẳng dòng 




- Thời gian thu dữ liệu: 30 phút; 

93 → 20 7 →80 5 – 25 Tuyến tính 

20 80 25 – 30 Đẳng dòng 

20 →93 80 →7 30 – 35 Tuyến tính 

93 7 35 – 45 Tái cân bằng 

- Cột: Cột BDS Hypersil C18, 250 x 4.6 mm, 5µm; 

- Nhiệt độ cột: 40℃; 

- Detectỏ, bước sóng: Máy <strong>quan</strong>g phổ, 220 nm; 

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; 

- Nhiệt độ phun: 8℃; 

- Chuẩn bị mẫu: Indinavir được hòa tan trong pha động A và B (50:50) đến nồng 

độ 2,0 mg/ml. 20 ml (tương ứng 40 µg). 

- Tính ổn định của dung dịch mẫu: Mẫu được ổn định trong bóng tối ở 8℃ trong ít 

nhất 4 giờ; 

- Giới hạn phát hiện: 0,5 ng (0,001%) ở 220 nm; 

- Giới hạn định lượng: 2 ng (0,005%) ở 220 nm. 

- Detector mảng diod: Phổ của hầu hết <strong>các</strong> đỉnh tạp chất cũng như đỉnh chính tương 

tự với cực đại UV ở khoảng 260 nm và dưới 220 nm. 






PL-6 











Hình 4.3 Sắc ký đồ của Indinavir số 105231 được theo dõi ở bước sóng 220 nm 

Dữ liệu do nhà sản xuất cung cấp: 

- Đặc điểm: Bột màu trắng; 

- Nhận dạng phổ IR: Phù hợp; 

- Định lượng HPLC: 100,2%; 

- <strong>Tổng</strong> tạp (HPLC): 0,0%; 

- Nước (Karl Fischer): 2,9%; 

- Tạp chất (TLC): Điểm duy nhất; 

- Độ tinh khiết được gán giá trị 97,1% (nguyên trạng); 

- Tính ổn định: Không có nghiên cứu <strong>về</strong> độ ổn định đặc biệt nào được thực hiện. 

Thường xuyên kiểm tra lại ICRS này khi bảo quản ở trạng thái khô. 

Kết luận: Indinavir, số kiểm soát 105231 có thể được coi thích hợp như một chất chuẩn 

quốc tế cho mục đích dự định. 






PL-7 








Phụ lục 3: Thiết lập chất chuẩn gốc Glibenclamid [51] 




-Công thức <strong>phân</strong> tử Glibenclamid: 

C23H28ClN3O5S 

-Số mục lục: GCQUANT0008.00 

-Số lô: 25894 

-Điều kiện bảo quản: 15-25℃, trong 

bóng tối 

-Cảm <strong>quan</strong>: chất rắn màu trắng 

-Phân tử khối: 494,00 -Điểm nóng chảy: 172℃ 

-Số đăng ký: [10238-21-8] -Sự <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> nguyên trạng: 99,7% 

i. Bộ dữ liệu nhận dạng: 

Phổ 1 H-NMR (Điều kiện: 400 MHz, DMSO-d6) và Phổ 13 C-NMR (Điều kiện: 100 

MHz, DMSO-d6): Các tín hiệu của phổ NMR và biện giải phổ phù hơp với phổ của 

chất chuẩn đối chiếu Châu Âu Glibenclamid, G0325000, lô 3.0, Id00DQP3. 

Khối phổ: 

Phương pháp: 4,5 kV ESI, nhiệt độ bốc hơi : 200℃, đầu vào trực tiếp. 

Các tín hiệu của phổ MR và biện giải phổ phù hợp với phổ của chất chuẩn Châu Âu 

Glibenclamid, G0325000, lô 3.0, Id00DQP3. 

Phổ IR 

Phương pháp: Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier phản xạ suy giảm tổng thể (ATR- 

FTIR). 

Các tín hiệu của phổ MR và biện giải phổ phù hợp với phổ của chất chuẩn Châu Âu 

Glibenclamid, G0325000, lô 3.0, Id00DQP3. 


Điểm chảy: 

Phương pháp: phương pháp mao quản. 

Giá trị trung bình (n=3): 172℃. 

PL-8 















ii. 

iii. 

Độ tinh khiết: 

- Được xác định bằng HPLC. 

- Điều kiện HPLC: Cột (Pro C18 RS, 5 µm, 150 × 4,6 mm) 

- Điều kiện chạy sắc ký: 

• 1,0 ml/phút, 40℃; 

• 0 – 30 phút, Nước/Acetonitril: 55/45; 

• 30 – 35 phút, Nước/Acetonitril lên 30/70; 

• 35 – 40 phút, Nước/Acetonitril: 30/70; 

• 40 – 45 phút, Nước/Acetonitril lên 55/45; 

• 45 – 60 phút, Nước/Acetonitril 55/45 (v/v); 

• 0,1% H3PO4. 

- Detector: DAD, 230nm. 

- Tiêm mẫu: Tự động, 5 µl; 0,19764 mg/ml trong Methanol. 

Báo cáo phần trăm diện <strong>tích</strong>- sắp xếp theo tín hiệu: 

- Kết quả: 

Pic Thời gian lưu Diện <strong>tích</strong> % diện <strong>tích</strong> 

1 2,09 0,51 0,00 

2 3,83 23,83 0,13 

3 5,66 5,40 0,03 

4 7,66 5,90 0,03 

5 16,34 18008,72 99,80 

<strong>Tổng</strong> 18044,35 100,00 

• Trung bình: 99,80%; 

• Số kết quả: n = 6; 


• Độ lệch chuẩn: 0,01%. 

Mất khối lượng do làm khô: 

- Điều kiện: 105℃ trong 4 giờ; 

- Không phát hiện thấy một lượng đáng kể hàm lượng chất bay hơi (< 0,05%). 

PL-9 












iv. 

Tro sulfat: 




Kết quả: dưới giá trị chi tiết thiết lập là < 0,1%. 

v. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân định lượng (qNMR): 

- Dung môi DMSO-d6 với acid 3,5-Dinitrobenzoic làm chuẩn nội. 

- Kết quả: 

• Trung bình: 99,67%; 

• Số kết quả: n = 6; 

• Độ không đảm bảo đo: 0,40%. 

• Kết quả cối cùng: 

- Độ tinh khiết HPLC: 99,80%; 

- Mất khối lượng do làm khô: không phát hiện; 

- Tro sulfat: không phát hiện; 

- Phân <strong>tích</strong>: 

- qNMR: 99,67%; 

Phân <strong>tích</strong> được đánh giá là 99,7% nguyên trạng, độ không đảm bảo đo là 0,4%. 






PL-10 











Phụ lục 4: Thiết lập 6 chất chuẩn gốc 

Theo tác giả S.Mathkar, trong nghiên cứu thiết lập chất chuẩn trên 16 chất chuẩn 

(trong đó có 6 chất chuẩn gốc): 

balance): 

Độ tinh khiết chất chuẩn gốc được tính toán theo cân bằng khối lượng (mass 

= [Độ tinh khiết theo sắc ký × (100 – tạp chất vô cơ – dung môi tồn dư hoặc 

độ ẩm)/100]. 

Xác định độ tinh khiết bằng phương pháp cân bằng khối lượng (trong đó <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> 

<strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong>: cắn sau nung, Karl Fischer hoặc mất khối lượng do làm khô, TGA… thích 

hợp) và so sánh với xác định độ tinh khiết bằng DSC. Độ chênh lệch độ tinh khiết giữa 

độ tinh khiết DSC và độ tinh khiết đã xác nhận được tính toán <strong>sử</strong> <strong>dụng</strong> công thức sau: 

Độ chênh lệch độ tinh khiết = 

Kết quả được trình bày ở bảng 4.1. 

|Độ tinh khiết đã xác nhận – Độ tinh khiết DSC| 

PL-11 

Độ tinh khiết đã xác nhận 

× 100 

Bảng 4.1 So sánh kết quả độ tinh khiết thu được thông qua DSC với kết quả độ tinh 

Tên hợp chất 

Betamethason 

Dipropionat 

Propylparaben 

Ethinyl 

Estradiol 

Loratadin 

N-Methyl 

desloratadin 

khiết thu được thông qua sắc ký và <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> khác 

Loại chất 

chuẩn 

Chất chuẩn 










Độ tinh khiết 

được chứng 

nhận (%) 

Độ tinh khiết 

DSC (%) 

Độ chệnh lệch 

độ tinh khiết 

(%) 

99,2 99,2 0,0 

100,0 100,0 0,0 

100,0 99,9 0,1 


100,0 99,7 0,3 

98,0 99,8 1,8 















Tuy nhiên, kết quả DSC chỉ đáng tin cậy đối với <strong>các</strong> hợp chất có độ tinh khiết cao 

(≥ 98%), có <strong>các</strong> điểm nóng chảy rõ ràng và không có <strong>các</strong> điều kiện ảnh hưởng đến nhiệt 

độ nóng chảy của chúng. Hơn nữa, <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> DSC chỉ nên được thực hiện để xác minh 

độ tinh khiết của <strong>các</strong> CCĐC có độ tinh khiết đã được xác định bằng <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> <strong>phân</strong> 

<strong>tích</strong> khác được đề xuất trong Dược điển Châu Âu [26], [58]. 

Đối với chất chuẩn có độ tinh khiết lớn hơn hoặc bằng 98%, khác biệt phần trăm 

độ tinh khiết giữa độ tinh khiết đã được xác nhận và độ tinh khiết DSC là nhỏ hơn 2,0%. 

Đặc biệt, đối với chất chuẩn gốc có độ tinh khiết cao hơn, độ tinh khiết DSC khác biệt 

ít hơn 1,0% so với độ tinh khiết thu được thông qua sắc ký và <strong>các</strong> <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> 

khác [58]. 






PL-12 











Phụ lục 5: Xác định độ tinh khiết của chất chuẩn gốc Theophylin bằng 

phương pháp cân bằng khối lượng và DSC 

Theo tác giả Kang Ma, trong nghiên cứu xác định độ tinh khiết của theophylline 

theo phương pháp cân bằng khối lượng, HPLC và DSC: 

Độ tinh khiết = (100% - % tạp chất không bay hơi) × (100% - % tạp 

chất bay hơi - % nước - % tro) × 100% 

Trong đó: <strong>các</strong> tạp chất dễ bay hơi bao gồm dung môi tồn dư và hàm lượng của 

chúng được xác định bằng <strong>kỹ</strong> <strong>thuật</strong> TGA, hàm lượng nước được đo lường bằng chuẩn 

độ Karl Fischer, hàm lượng tro được xác định thông qua phương pháp mất khối lượng 

do làm khô; với tạp chất không bay hơi, mỗi loại được xác định và định lượng bằng 

phép đo khối phổ và sắc ký. kết quả độ tinh khiết của chất chuẩn đối chiếu theo phương 

pháp cân bằng khối lượng là 99,82 % và theo DSC là 99,79 % [48]. 






PL-13

Tổng quan về các kỹ thuật phân tích sử dụng trong thiết lập chất chuẩn gốc (primary standard)

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?