MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Para la determinación de la ...

Servicio Antimicrobianos - INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
Ajuste de la concentración de cationes
a) La solución madre de MgCl2 para realizar el ajuste debe contener 10 mg/ml de
Mg ++ .(Disuelva 8,36 g de MgCl2 .6H2O en 100 ml de agua desionizada).
b) La solución madre de CaCl2 para realizar el ajuste debe contener 10 mg/ml de Ca ++
(Disuelva 3,68 g de CaCl2 .2 H2O en 100 ml de agua desionizada).
Las soluciones madres deben ser esterilizadas por filtración a través de membranas y
conservadas a 4ºC.
c) El caldo MH se debe preparar según las directivas del fabricante, autoclavar y, antes
de suplementar con los cationes, enfriar una noche a 4ºC o en baño de hielo (si se
necesita utilizar el mismo día). Los medios comerciales contienen pequeñas cantidades
de calcio y magnesio, por lo tanto dichas cantidades se deben tener en cuenta en el
momento de realizar los cálculos para suplementar el medio MH.
d) Agregando 0,1 ml de cada solución madre a 1 litro de caldo MH se incrementa en 1
mg/l la concentración de Ca ++ y Mg ++ . A este medio se lo denomina caldo Müeller
Hinton suplementado con calcio y magnesio (CAMHB). Si el caldo MH provisto por el
fabricante contiene las concentraciones correctas de calcio y magnesio (20-25 mg/l de
Ca ++ y 10-12.5 mg/l de Mg ++ ), no es necesaria la suplementación.
4) Las características de cada lote de medio se evalúan utilizando cepas patrones de control de
calidad (ver 12.3). Si al realizar las pruebas de sensibilidad con un lote nuevo de caldo MH, no
se obtienen las CIMs esperadas para las cepas patrones, deben controlarse, tanto el contenido
de cationes divalentes, como otras posibles variables de la prueba.
5) Para determinar si el medio es adecuado para probar la sensibilidad a sulfonamidas y
trimetoprima, se debe realizar la CIM de estas drogas frente a Enterococcus faecalis ATCC®
29212. El punto final debe ser fácil de leer (> 80 % de reducción en el desarrollo comparado
con el control). El medio se considera adecuado si el valor de la CIM es < 0.5/9.5 µg/ml.
7.2. Preparación y almacenamiento de las diluciones
7.2.1. Método de Macrodilución en caldo
1) La prueba se realiza en tubo de hemólisis (13 x 100 mm) estériles
2) Para cada microorganismo ensayado se debe dejar, como control, un tubo que contenga
caldo sin antibiótico.
3) Los tubos deben estar tapados con algodón ó tapas de plástico ó metal.
4) Preparar las sucesivas diluciones al medio del antibiótico en caldo (ver esquema en Tabla
6) El volumen final mínimo, requerido en cada tubo, es de 1 ml. Para medir todos los
diluyentes y para agregar la solución de antibiótico al primer tubo se puede utilizar la misma
pipeta. Para llevar a cabo cada dilución del rango se debe utilizar una nueva pipeta. Se
debe tener en cuenta que con el agregado de la suspensión bacteriana, las concentraciones
de antibiótico en cada tubo se diluirán al medio; por lo tanto dichas concentraciones deben
ser preparadas al doble de la concentración final deseada.
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