Manual de laboratorio

MANUAL DE PRÁCTICAS
LABORATORIO DE BIOLOGIA DE
PROCARIONTES
Academia de Biología de Procariontes
Facultad de Ciencias
UNAM

Colaboradores
Aldo Valera
Valeria Souza
René Cerritos
Antonio Cruz
Edén Rodriguez
Eduardo Rodriguez
Ana Patricia García
Arístides Sampieri
Lourdes Lloret
Luciana Raggi

Presentación
En este curso teórico-práctico tendrás la posibilidad de conocer, analizar y estudiar el entorno natural
del cual formamos parte. Las prácticas del laboratorio de "Biología de Procariontes" pretenden que los
alumnos de nuevo ingreso a la carrera de Biología aprecien la gran diversidad bacteriana, su ubicuidad,
y los procesos básicos de su biología.
En términos generales, los objetivos que se persiguen son:
1. Que el alumno reconozca las principales características distintivas de los organismos procariontes.
2. Que adquiera la habilidad de aislar y determinar bacterias de diferentes ambientes(suelo, agua, aire,
alimentos, etc.).
3. Que se analicen, discutan y comparen los procesos básicos de la dinámica poblacional en bacterias.
4. Que se establezcan las bases de la diversidad genética bacteriana y ls posibles relaciones entre
grupos bacterianos conocidos.
Para cubrir los objetivos que se plantean, se desarrollarán sesiones en campo y de laboratorio, lo cual
permitirá reafirmar los conocimientos e inquietudes surgidos en el curso teórico. Las prácticas se
encuentran seriadas por lo tanto, será indispensable que sean le´ˆas con atenció antes de iniciar el curso
y previo a la práctica.
Evocamos la participación activa y dinámica tanto de profesores como de alumnos, ya que
frecuentemente se tendrá que disponer de tiempo extraclase para alcanzar los objetivos planteados.

Indice
PRACTICA 1 - EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS DE LABORATORIO
PRACTICA 2 - OBSERVACION DE BACTERIAS Y TINCION DE GRAM
PRACTICA 3 - LAS BACTERIAS Y SU AMBIENTE
PRACTICA 4 - MEDIOS SELECTIVOS EN BACTERIOLOGIA
PRACTICA 5 - BIOTIPOS
PRACTICA 6 - PARAMETROS CINETICOS
PRACTICA 7 - MUTACION, ADAPTACION Y REPARACION
PRACTICA 8 - SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIOTICOS Y EXTRACTOS NATURALES
PRACTICA 9 - FILOGENIA DE PROCARIONTES
PRACTICA 10 - MINIPREPARACIÓN DE DNA GENÓMICO DE PROCARIONTES
PRACTICA EXTRA - AISLAMIENTO DE RIZOBIOS
ANEXO 1 - FORMULARIO DE MEDIOS Y SOLUCIONES
ANEXO 2 - SINOPSIS DE GENEROS BACTERIANOS SUGERIDOS A ESTUDIARSE
ANEXO 3 - ALMACENAMIENTO DE CEPAS PURAS

PRACTICA. 1
EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS DE LABORATORIO
Todo laboratorio de microbiología está acondicionado con equipo, materiales y reactivos
diversos, que son indispensables para el estudio de los microorganismos de interés. En las
diferentes prácticas, estos materiales serán puestas a tu disposición, con el propósito de que
desarrolles la habilidad necesaria que te permita adentrarte en el conocimiento de las bacterias.
En esta práctica también podrás elaborar algunos medios nutritivos, utilizando para su
preparación algunos aparatos y reactivos que serán de uso común en tu laboratorio.
Nota: Antes de iniciar tu práctica lee cuidadosamente cada una da las partes de su
desarrollo, si tienes dudas coméntalas con tu profesor. Revisa que todo el material requerido esté
listo.
Objetivos
1. Conocer el equipo comúnmente empleado en el laboratorio y su forma adecuada de utilizarlo.
2. Elaborar un medio nutritivo, considerando las normas básicas de nutrición y esterilidad
indispensables en bacteriología .
Material
Para conocer el laboratorio, el profesor pondrá a disposición diferentes aparatos,
utensilios y reactivos, explicando su función y manejo. Es importante que expongas tus inquietudes
al respecto, en particular aquellas relacionadas con las medidas de seguridad.
Se recomienda que en esta práctica se elaboren las varillas triangulares que serán
utilizadas en las siguiente práctica. La varilla de cristal será aportada por el equipo de trabajo.
Para la preparación de los medios:
• 4 matraces con capacidad de 1lt.
• 50 cajas de Petri.
• Balanza
1

Primera parte
• Autoclave.
• Alcohol.
• Algodón.
• Papel aluminio.
• Pipetas estériles.
• Cinta masking-tape.
• Marcadores indelebles.
• Campana de flujo laminar.
• Reactivos necesarios para la elaboración de
• los medios nutritivos TG y PY.
Conoce el laboratorio de Biología de Procariontes
El profesor colocará en algunas mesas de trabajo diferentes utensilios de uso frecuente
(cristalería en general, asas, cajas de Petri, etc.), así como también aparatos que puedan ser
fácilmente transportados (vórtex, parrillas, potenciómetro, etc.). Analiza este material y comenta
con tu profesor y compañeros los usos y la forma como se emplea dichos accesorios.
Posteriormente tu asesor guiará una visita por el laboratorio, haciendo comentarios del
uso y manejo de los aparatos que se muestran, respondiendo a las preguntas que surjan al
respecto.
Un aspecto importante de tu desempeño en este laboratorio es la seguridad, en
cualquier actividad que desarrolles debes tener presente que:
1. En el laboratorio se manejan microorganismos que pueden ser riesgosos para tu salud,
por lo tanto, es conveniente que utilices bata, guantes y cubre boca, cuando sea
pertinente.
2. Con frecuencia se trabaja con reactivos químicos peligrosos, por lo tanto lee siempre
las indicaciones de manejo.
2

3. El equipo puede ser delicado y costoso; es conveniente que dentro del laboratorio te
concentres en las actividades de la práctica evitando así distracciones que puedan
provocar un accidente.
4. Es fácil contaminar tus cultivos con microorganismos no deseados, en todo momento
ten presente las normas de esterilidad.
Recuerda que es responsabilidad de todos cuidar el ambiente. Por ningún motivo
deseches reactivos tóxicos al drenaje; organízate con tu profesor y compañeros sobre este
aspecto.
Notas importantes:
1. Recomendamos que el grupo se organice por equipos.
2. Cada equipo debe elegir el o los género de bacterias con los cuales desea trabajar durante el
curso, el profesores te dará mas información al respecto y en la practica 3 encontrarás un
cuadro con los géneros bacterianos que se proponen trabajar
Segunda parte
Elabora un medio de cultivo.
Los medios deberán ser preparados correctamente, ya que estos serán utilizados en
prácticas posteriores; lee cuidadosamente las indicaciones de su preparación, que encontrarás
disponible en el anexo 1.
Los medios a preparar son los siguientes:
Nombre del medio de cultivo
TG
(triptona glucosa)
Cantidad
requerida por grupo
1 lt
PY 250ml
3

(peptona extrac. de levadura)
Nota: las cantidades pueden variar según el número de equipos.
Para la elaboración de cualquiera de estos medios y en general siempre que se requiera
elaborar alguno, el procedimiento propuesto es el siguiente; analiza brevemente cada paso antes
de iniciar la actividad:
1. Lee perfectamente la fórmula de elaboración (reactivos y cantidades requeridas, anexo 1).
2. Sigue paso a paso la manera de preparar el medio. En algunas ocasiones la preparación del
medio requiere mezclar por separado algunos ingredientes y después de ser esterilizados juntar
los componentes.
3. Toma las cantidades exactas de los ingredientes, en peso o volumen.
4. Disuelve perfectamente los ingredientes calentando el medio en una parrilla, este proceso se
facilita con el uso de una pastilla magnética. Si el medio nutritivo a preparar se requiere en
estado líquido, en este paso es conveniente repartirlo en los recipientes donde se hará el
cultivo (tubos de ensaye o matraces).
5. Tapa los recipientes con algodón, gasa o papel aluminio y esteriliza el medio por 15min, si
requieres de otro material como pipetas, probetas, etc. también cúbrelos antes de esterilizar.
6. Una vez que el medio fue esterilizado, viértelo en cajas de Petri (la cantidad de medio por caja
no debe rebasar las 3/4 partes de su capacidad, 30ml más o menos). Para evitar que se forme
humedad en la superficie del medio, deja las cajas parcialmente abiertas hasta que solidifiquen.
Es indispensable que realices esta operación en la campana de flujo laminar, o en tu mesa
utilizando varios mecheros encendidos.
7. Finalmente rotula con alguna clave sencilla cada uno de los medios con el fin de que estos sean
identificados con facilidad y evitar confusiones. Recomendamos poner la marca en el costado
de la caja utilizando un marcador indeleble.
8. Los medios ya elaborados son muy susceptibles de contaminación o deshidratación, por lo
tanto es indispensable que estos sean almacenados en un lugar limpio, libre de humedad y
fuera de la incidencia directa de los rayos solares. Algunos medios requieren condiciones
especiales para su almacenamiento, cuando sea este el caso, se hará la aclaración en las
indicaciones de su preparación, descritas en el apéndice de este manual.
4

Reporte
1. Elabora un listado del material que conociste o manejaste en el laboratorio describiendo
brevemente el uso del mismo.
2. Comenta las dificultades que se presentaron en la elaboración de los medios.
3. Mediante revisión bibliográfica, da respuesta a las siguientes preguntas:
1. ¿Por qué es importante esterilizar el material cuando se trabaja con microorganismos?
2. ¿Cuáles son los métodos de esterilización mas frecuentes?
3. ¿Qué es un medio de cultivo y cuáles deben ser sus características básicas?
5

PRACTICA 2
OBSERVACION DE BACTERIAS
Y
TINCION DE GRAM
En la naturaleza los organismos presentan características que nos son útiles para su
identificación, dichas características pueden ser morfológicas, fisiológicas o ecológicas. Las
bacterias, han sido agrupadas con base en su morfología, su respuesta a ciertos compuestos
químicos y actualmente con base en sus características genéticas.
En esta práctica tendrás la oportunidad de observar bacterias vivas y distinguir algunas de
sus características morfológicas, así como también corroborar la respuesta a la tinción de Gram;
técnica que ha sido utilizada para clasificar a las bacterias en Gram positivas o Gram negativas.
Primera parte
Observación de Microorganismos.
Objetivos:
1. Observar bacterias en preparaciones húmedas a partir de diversos cultivos.
2. Distinguir los diferentes tipos de movimiento en bacterias: mov. real, mov. Browniano, mov. de
corriente, etc.
Material:
• Microscopio de campo claro
• Vaselina sólida
• Aceite de inmersión
• Cubreobjetos
• Portaobjetos
• Asas microbiológicas
• Mechero
6

• Cultivo líquido de bacterias móviles
• Cultivo líquido de bacterias no móviles
Procedimiento:
Preparación de la muestra húmeda:
1. Coloca un poco de vaselina sobre la palma de tu mano. Raspa una pequeña cantidad de
vaselina sólida sobre los cuatro bordes de una de las caras de un cubreobjetos. No toques las
caras del cubreobjetos.
2. Coloca el cubreobjetos sobre la mesa con la cara que tiene la vaselina hacia arriba.
3. Con el asa microbiológica previamente flameada, toma una muestra de uno de los cultivos
líquidos de bacterias y coloca la gota sobre el cubreobjetos. Flamea nuevamente el asa.
4. Coloca un portaobjetos sobre el cubreobjetos y presiona suavemente de forma que ambos se
adhieran. Invierte la preparación y asegúrate que la vaselina haya formado un sello homogéneo
alrededor de la muestra.
5. Coloca la preparación al microscopio e intenta observar con el objetivo 40X y posteriormente
con el de 100X.
6. Observa la morfología, el tamaño y el movimiento de las bacterias. Toma nota de tus
observaciones.
Segunda parte
Tinción de Gram.
Objetivos:
1. Desarrollar la tinción de Gram
2. Identificar las diferencias estructurales de la pared celular de las bacterias Gram positivas y
Gram negativas
3. Distinguir la morfología y agrupaciones bacterianas.
Material
7

TINCION DE GRAM
La tinción de Gram es un método que nos servirá para la observación de bacterias. Gracias a las
diferencias estructurales de la pared celular de las bacterias, con esta tinción se logran identificar dos
grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas. Para esto es necesario un microscopio de campo
claro, aceite de inmersión, cubreobjetos, portaobjetos, asas microbiológicas, mechero de Bunsen,
micropipetas, cultivos bacterianos (muestras de los medios selectivos). Los reactivos necesarios para
realizar la tinción son el colorante primario (cristal violeta al 1% en solución), solución alcalinizante,
lugol, agente decolorante (alcohol al 95%), colorante de contraste (safranina al 1% en solución).
Material:
· Microscopio de campo claro
· Aceite de inmersión
· Portaobjetos
· Cubreobjetos
· Asas microbiológicas
· Mechero
· Cultivos bacterianos
· Reactivos para tinción de Gram:
- Colorante primario (cristal violeta al 1% en solución).
- Solución alcalinizante (opcional).
- Lugol.
- Agente decolorante (alcohol al 95%).
- Colorante de contraste (safranina al 1% en solución).
Método:
Para poder observar, primero se preparan frotis fijos de cada uno de los cultivos
bacterianos a observarse, para esto se I. esteriliza un asa bacteriológica y posteriormente se toma una
pequeña muestra de los medios selectivos y se coloca en los portaobjetos limpios (foto I); II. se flamean
los frotis para secar la muestra y fijarla (evitando que se queme o humée), III. se cubren los frotis con
una o dos gotas de la solución primaria junto con una o dos gotas de solución alcalinizante dejando
actuar la mezcla por un periodo de 20 a 25 segundos, IV. se lavan los frotis con agua corriente,
tratando de que el chorro de agua no sea violento y deslave el frotis. V. se retira el exceso de agua y

posteriormente se les agrega dos gotas de lugol, VI. se repite el paso anterior con el agente decolorante
alcohol-cetona por un tiempo de 15 seg, VII. a continuación la safranina con un tiempo de 25 seg.
Finalmente se retira el exceso de agua y se deja secar la muestra. Se cubre la muestra con un
cubreobjetos y sobre éste se coloca una gota de aceite de inmersión, para poder enfocarlo al
microscopio, primero con un aumento de 10x hasta 100x y observar las bacterias identificadas.
Ejemplos de tinción de Gram:
I. Esterilización del asa y preparación del frotis.
II. Se fija el frotis con calor
IV. Se lava el frotis
Bácilos Gram + (coloración violeta) Cocos Gram - (coloración rosacea)

Actividades:
1. Determina si tus cultivos y los que el profesor provee son Gram - o Gram +
2. Investiga qué condiciones de las bacterias podrían afectar la tinción.
3. Enlista cinco géneros de bacterias Gram negativas y cinco Gram positivas.
4. Menciona la utilidad taxonómica de la tinción de Gram.

PRACTICA 3
LAS BACTERIAS Y SU AMBIENTE
Las bacterias son organismos adaptados a una gama diversa de ambientes, en su medio,
desempeñan un papel importante en la dinámica de los procesos biológicos. La mayoría de las
especies conocidas viven libremente en el suelo o en el agua; algunas se asocian de manera
benéfica o parásita con plantas, animales y otros microorganismos.
El hombre aprovecha los beneficios de algunos grupos bacterianos, por ejemplo: en la
agricultura son importantes los géneros como Rhizobium, Azospirillum, Agrobacterium, etc.,
en la industria de productos lácteos, los Lactobacillus y Streptococcus, en la industria
farmacéutica Streptomyces, Bacillus y de forma significativa, en la investigación destacan los
géneros Escherichia, Pseudomonas, Vibrio, entre otros.
En el campo de la salud, algunas especies patógenas como Escherichia coli, Salmonella
anticholeraesuis, Streptococcus pneumoniae, Shigella dysenteriae, etc. son la causa de un
alto índice de mortalidad infantil, por ello existe especial interés en estudiarlas y combatirlas
adecuadamente.
En la presente práctica, tendrás la oportunidad de ir en busca de bacterias a su ambiente
natural, colectarlas y propagarlas en medios artificiales (cultivos). Este material biológico
conformará el objeto de estudio de todas las prácticas de laboratorio en este curso, por ello es
importante que seas cuidadoso en tu trabajo.
Nota:
1. Esta práctica implica salir de colecta al campo y una vez colectadas las muestras es necesario
acudir al laboratorio donde se procesarán; es requisito indispensable disponer del tiempo
suficiente.
2. Recomendamos que las muestras a se colecten con base en los objetivos planteados en tu
proyecto de investigación. Ello te evitará realizar doble trabajo.
3. Antes de iniciar tu práctica lee cuidadosamente cada una da las partes de su desarrollo, si
tienes dudas coméntalas con tu profesor. Revisa que todo el material requerido esté listo.
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Objetivos
Distinguir en campo los diferentes ambientes donde las bacterias son capaces de vivir.
Reconocer el papel ecológico que desempeñan las bacterias dentro de los ecosistemas naturales.
Desarrollar la técnica de diluciones y sembrado de bacterias.
Material requerido:
En el campo:
Por persona:
Por grupo:
En el laboratorio:
• Libreta de campo
• Bolsas de plástico de 15 por 20 cm.
• Frascos limpios.
• Cotonetes.
• Tubos de ensaye limpios (para colecta de nódulos).
• Tubos con solución salina al 0.8% (para colecta de heces fecales).
• Marcador de tinta indeleble.
• Espátulas limpias.
• Pala de jardinería pequeña.
Para 3 de los equipos (aquellos que trabajarán con Pseudomonas, entéricas coliformes y
entéricas no coliformes)
• Cajas de Petri con medio de cultivo TG.
• Gradilla con tubos de ensaye, cada uno con exactamente 9.9ml de solución
salina al 0.8% (ver anexo 1).
• Micropipetas manuales con puntas estériles.
• Perlas de vidrio estériles.
• Vórtex.
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Para 1 equipo (Quien trabajará con el género Rhizobium)
• Cajas de Petri con medio PY
• Pinzas de disección.
• Asas bacteriológicas
• 50ml de solución de hipoclorito al 15%
• Agua destilada
• Recipiente con alcohol etílico
• Mecheros
Para 1 equipo (Quien trabajará con bacterias lácticas):
Por grupo:
Primera parte
Colecta en campo:
• Cajas de Petri con medio TG.
• Perlas de vidrio estériles.
• Micropipetas manuales con puntas estériles.
• Matraces con 9ml de agua destilada cada uno
• Gradilla con tubos de ensaye, cada uno con exactamente 9.9ml de solución
salina al 0.8%.
• Leche búlgara, yoghurt casero, mantequilla natural o leche cortada (este
material podrá ser aportado por el equipo de trabajo, es suficiente con 10ml. de
cada muestra)
• Campana de flujo laminar Perfectamente limpia.
• Incubadora a 35°C.
• Incubadora a 30°C.
• Agua destilada.
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Se propone que la práctica de campo se lleve a cabo en dos ambientes naturales de la
reserva ecológica de Ciudad Universitaria. El grupo dividido en equipos de trabajo y habiendo
elegido uno de los grupos de bacterias propuestos en el cuadro 1 llevará un registro detallado de
los diferentes análisis o pruebas que se realicen durante el curso. Cuando el profesor lo considere
pertinente, el grupo dedicará una sesión para exponer los resultados preliminares y finalmente el
curso culminará con la exposición de resultados obtenidos, para cada grupo de bacterias, en
forma de un proyecto (comenta con tu profesor los detalles de tal proyecto).
Una vez en el sitio de colecta el profesor dará una breve charla referente a los diferentes
ambientes donde habitan las bacterias, su importancia ecológica y económica de las mismas.
Posteriormente, cada equipo tomará muestras de suelo, agua, heces fecales, nódulos de
leguminosas, etc. según sea el género de bacterias elegido. Tu profesor podrá asesorarte al
respecto.
Procedimiento de colecta
Las muestras de agua, suelo, hojas u otros materiales orgánicos se tomaran directamente
del medio. Cada muestra se conservará en recipientes cerrados hasta el momento de su manejo
en el laboratorio.
Las muestras fecales, se colectarán con un cotonete el cual se introducirá posteriormente
en un tubo conteniendo 10ml de solución salina al 0.8%.
Cuadro 1. Géneros bacterianos sugeridos como material biológico de estudio en el curso práctico de
Biología de Procariontes.
Género
propuesto
Rhizobium
Pseudomonas
Características
sobresaliente
Fijan nitrógeno
atmosférico.
Móviles, algunas veces parásitos en
mamíferos.
Se encuentran
en:
Simbiosis con leguminosas
Suelo y agua
principalmente
13

Lactobacillus
Streptococcus
Escherichia
Salmonella
Shigella
Klebsiella
Proteus
Vibrio
Producen ac. láctico
por fermentación.
Bacterias entéricas coliformes
generalmente patógenas
de vertebrados.
Bacterias entéricas no coliformes,
móviles,
algunas muy patógenas de
vertebrados.
En el anexo 2 se presenta una breve diagnosis de estos géneros.
Productos lácteos
Principalmente en tracto
digestivo de vertebrados.
También en suelo y
agua estancada.
Principalmente en tracto
digestivo de vertebrados.
También en suelo y
agua estancada.
Los nódulos de leguminosas, se obtienen de las raíces de estas plantas. Con la ayuda de
una pala extrae la mayor cantidad de raíces, cuidando no dañarlas demasiado, elimina el exceso
de suelo y localiza los nódulos (estructuras semiesféricas adheridas a las raíces) y deposita éstos
en un tubo de ensaye limpio.
Rotula cada muestra indicando el sitio de muestreo y el número de muestra. En tu libreta
de campo haz las anotaciones que consideres pertinentes como: fecha de colecta, lugar de
colecta, propósito de la colecta, características generales de los puntos de muestreo y
comentarios generales.
Segunda parte
Diluciones y cultivo de bacterias:
En esta segunda parte de la práctica harás diluciones y cultivarás bacterias, con ello
podrás estimar la densidad de bacterias por unidad de muestra y aislar colonias puras, que
fungirán como candidatas para ser identificadas como el grupo de bacterias que tu buscas. Por
esta razón serán empleados medios nutritivos de propagación que permitan obtener la mayor
14

diversidad de clonas (TG y PY, en este caso) y a partir de ellas obtener los géneros esperados
(tabla 1, anexo 2).
Preparación de diluciones (ver fig. 1)
(todo el procedimiento se realiza en la campana de flujo laminar)
Procedimiento para agua.
1. En una gradilla, coloca 5 tubos de ensaye y adiciona exactamente 9.9ml de solución salina al
0.8%. Enumera los tubos del 1 al 5.
2. Toma 100 microlitros de agua colectada y viértelos en el tubo No.1 así tendrás en él una
dilución 1:100 respecto del original, agita este tubo en el vórtex, toma 100 microlitros y
agrégalos en el tubo No.2; ahora tienes una dilución de 1:10,000 con respecto al original;
repite esta operación hasta el tubo No.5, el cual estará a una dilución de 1 x 10 -10 respecto al
original.
3. En una caja de medio TG (preparadas en la práctica 1) inocula 100 microlitros del tubo No.3
(dilución 1x10 6 ). En otras cajas de medio, repite la operación para las diluciones de los tubos
4 y 5.
4. Rotula cada caja de cultivo indicando el factor de dilución, el tipo de muestra a que
corresponde, equipo y grupo.
5. En cada caja agrega de 10 a 12 perlas de vidrio, ciérralas y colócalas una sobre otra. Agita las
cajas de forma rotatoria hasta que el inóculo se distribuya perfectamente sobre el medio (por
lo regular es suficiente con 5 minutos). Elimina las perlas de vidrio en un baso de precipitados
que contenga alcohol al 70%.
6. Incuba a 36°C durante 40-48hrs.
Nota: Si es posible, se recomienda inocular 3 cajas de cada dilución a partir de la dilución del
tubo 3. Sin embargo, cuando se desea obtener colonias de bacterias de aguas potables, es
recomendable hacer cultivos a partir de la primera dilución.
Procedimiento para suelo:
1. En una gradilla, coloca 6 tubos de ensaye y adiciona exactamente 9.9ml de solución salina al
0.8%. (ver anexo 1). Enumera los tubos del 1 al 5.
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2. Toma 1 gr de suelo y dilúyelo en 10ml de agua destilada en el tubo restante.
3. Sigue el mismo procedimiento descrito para las diluciones de agua.
4. Rotula tus medios como se indicó anteriormente.
5. Incuba a 36°C durante 40-48hrs.
Procedimiento para excretas:
1. En una gradilla, coloca 5 tubos de ensaye y adiciona exactamente 9.9ml de solución salina al
0.8%. (ver anexo 1). Enumera los tubos del 1 al 5.
2. Agita la muestra y toma 100 microlitros que se verterán en el tubo 1.
3. Proseguir de forma semejante a lo descrito para el agua.
4. Rotula tus medios como se indicó anteriormente.
5. Incuba a 36°C durante 40-48hrs.
Procedimiento para hojas o partes vegetales:
1. En un vaso de precipitados enjuaga por varias veces con 10ml de agua destilada y estéril una a
una las hojas o partes vegetales, tomando éstas con unas pinzas de disección.
2. En una gradilla, coloca 5 tubos de ensaye y adiciona exactamente 9.9ml de solución salina al
0.8%. (ver anexo 1). Enumera los tubos del 1 al 5.
3. Proseguir de forma semejante a lo descrito para el agua.
4. Rotula tus cultivos como se indicó anteriormente.
5. Incuba a 36°C durante 40-48hrs.
Procedimiento para muestras lácticas:
1. Diluye en un matraz estéril 1ml de producto lácteo (yoghurt, leche, etc.) en 9ml de solución
salina al 0.8%.
2. Incuba a 30°C durante 1hr con el fin de activar el inóculo.
3. Sigue el mismo procedimiento descrito para las diluciones de agua.
4. Rotula tus cultivos como se indicó anteriormente.
5. Incuba a 30°C durante 40-48hrs.
16

Fig. 1 Diluciones
Agua
Suelo
Hojas
1g en 10ml
de agua
En 10ml
de agua
.1ml
.1ml
.1ml
Procedimiento para los nódulos (fig. 2)
.1ml .1ml .1ml .1ml
1 2 3
4 5
10 -2 10 -4
medio sólido TG
10
.1ml .1ml
-6 10-8 .1ml
medio sólido TG medio sólido TG
1. Lava perfectamente los nódulos con agua estéril de dos a tres ocasiones, agitándolos en el
vórtex. Deshecha el agua sucia.
2. Agrega 5ml de hipoclorito al 15% y deja reposar durante 5min.
3. Retira la solución de hipoclorito y enjuaga nuevamente con agua estéril. Dos ocasiones.
Fig. 2. Tratamiento de nódulos
10 -10
17

Exprimir con pinzas
de disección
medio sólido PY
4. Toma un nódulo con la pinza clínica y exprímelo en una caja de medio PY, observarás que el
contenido del nódulo es de color rojizo, ahí se encuentran las bacterias del género
Rhizobium.. Con una asa flameada esparce la muestra de manera suave, dibujando un
estriado, tal como se muestra en la fig. 2. Repite este paso hasta completar los nódulos que
requieras por planta. Antes de tomar cada nódulo flamea las pinzas clínicas introduciendo
éstas en alcohol y posteriormente pásalas por la flama. Ten cuidado de no regresar las pinzas
al alcohol tan pronto las hayas pasado por la flama ya que se puede ocasionar un incendio.
5. Rotula tus cultivos como se indicó anteriormente.
6. Incuba a 30°C durante 40-48hrs.
Nota: si deseas conocer el número aproximado de bacterias por nódulo, sólo basta que exprimas
perfectamente un nódulo en 1ml de agua destilada y estéril, sigue con el procedimiento descrito
para el caso de la dilución de agua.
Todos los cultivos que obtengas de estas siembras, son cultivos mixtos, ya que en ellos
crecerán varios tipos de bacterias, entre las cuales es posible que se encuentren los géneros que
buscas. Es posible que los cultivos se contamine fácilmente, para evitarlo te recomendamos cerrar
las cajas de Petri con una cinta maskin-tape, en la cual puedes anotar algunos datos que
identifiquen el origen de dicho cultivo y el equipo responsable del mismo. Conserva dichos
cultivos en refrigeración.
18

Reporte de resultados
I. Elabora un cuadro de densidades, donde registrarás el número de bacterias calculado por
unidad de muestra. Complementa dicho cuadro con datos informativos del origen y naturaleza
de la muestra (comenta tus resultados obtenidos con otros equipos).
II. Conteo de bacterias:
1. Cuenta el número de colonias en cada caja (se considera que cada colonia es formada
originalmente por una sola bacteria).
2. Divide dicho número por el factor de la dilución del cultivo.
3. Si tienes mas de una caja con la misma disolución y para la misma muestra, promedia los
resultados.
III. Organízate con tu grupo y lleguen a conclusiones generales de lo observado. Coméntalo con
tu profesor.
IV. Elabora un reporte general de actividades tanto de la práctica de campo como de laboratorio.
VI. Busca información respecto al género que en tu equipo será manejado y compártelo con tus
compañeros de grupo.
PRACTICA 4
MEDIOS SELECTIVOS EN BACTEROLOGIA
Uno de los problemas básicos que se presenta en el estudio de los microorganismos, es la
imposibilidad de trabajar con individuos aislados, por consiguiente, se ha tenido que buscar la
manera de lograr, bajo condiciones controladas, el desarrollo de colonias puras del organismo
que se desea estudiar. A dichas colonias se les da el nombre común de colonia. Los individuos
que la conforman son el resultado de la reproducción clonal que estos microorganismos presentan
y por lo tanto son idénticos genética y fenotípicamente.
Para lograr el establecimiento, desarrollo y posterior aislamiento de las bacterias en
condiciones de laboratorio, se han diseñado diversos medios nutritivos, los cuales son una
mezcla de compuestos orgánicos e inorgánicos que cumplen con los requerimientos
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indispensables para el buen desarrollo de las bacterias. Así, un medio nutritivo adecuado debe
satisfacer las siguientes necesidades:
• Fuente de carbono.
• Fuente de nitrógeno.
• Factores de crecimiento.
Además de los requerimientos anteriores, tanto la temperatura, el pH y la adecuada
esterilización de los medios, son factores que determinan el éxito del cultivo de bacterias.
En términos bacteriológicos, llamamos cultivo al crecimiento bacteriano en un medio
nutritivo y dependiendo del número de diferentes bacterias cultivadas en un mismo recipiente
tenemos:
a) Cultivos puros o axénicos, sólo un tipo de bacterias.
b) Cultivos mixtos, varios tipos de bacterias creciendo juntas.
c) Cultivos bimembres, dos diferentes tipos de bacterias.
En la presente práctica, manejarás algunos medios selectivos. Estos medios, a diferencia
de los medios ricos o de propagación como el TG o PY, inhiben el crecimiento de ciertos grupos
bacterianos y permiten el desarrollo de otros, esto te permitirá lograr una primera selección de las
colonias obtenidas en tus cultivos mixtos, obtenidos en la práctica pasada.
Objetivos
1. Obtener cultivos “puros” a partir de cultivos “ mixtos “.
2. Practicar una nueva técnica en el sembrado de bacterias.
Material requerido
Por grupo:
• 1ó 2 cajas de medio TJA.
• 1ó 2 cajas de medio EMB.
• 1ó 2 cajas de medio PYnal.
• 1ó 2 cajas de medio Lb.
• 1ó 2 cajas de medio TCBS agar.
• 1ó 2 cajas de medio PA.
20

Metodología
• 1ó 2 cajas de medio MacConkey.
• Cultivos mixtos de la práctica anterior.
• Campana de flujo laminar.
• Incubadora a 30°C.
• Incubadora a 36°C.
• Alcohol.
• Asas bacteriológicas.
• Tubo de ensaye estéril.
• Marcador indeleble.
• Cinta masking-tape.
A partir de los cultivos mixtos, obtenidos en la práctica anterior, recupera en medios
selectivos algunas de las colonias con el fin de obtener cepas puras de un determinado género,
aquel que deseas analizar durante el curso.
Como se muestra en la tabla 1 de la práctica 2, un mismo género de bacterias puede
estar presente en diferentes ambientes, por lo tanto, tienes la posibilidad de buscar el género de tu
interés en aquellos cultivos mixtos que te brinden tal posibilidad.
En el siguiente recuadro se presentan los géneros bacterianos sugeridos y se indica el
medio selectivo con el cual podrás identificar colonias puras del género de bacteria que buscas.
Género
propuesto:
Medio
selectivo:
PYnal
21

Rhizobium Lb
Pseudomonas
Lactobacillus
Streptococcus
Escherichia
Salmonella
Shigella
Klebsiella
Proteus
Vibrio
PA
PA
TJA
MacConkey
Verde brillante
MacConkey
EMB
TCBS
Nota: El procedimiento a seguir para todos los equipos es básicamente el mismo, la diferencia radica en la
procedencia de las colonias y el medio selectivo a utilizar. Revisa el anexo 1 y 2 para consultar cual es la
naturaleza de los medios a utilizar . En el anexo 2 encontrarás información referente a los géneros bacterianos
que en ellos se desarrollan, además se presentan los resultados esperados con tales medios.
Aislamiento de colonias
1. Solicita a tu asesor los medios selectivos que requieres para diferenciar el género bacteriano
de tu interés.
2. Con la ayuda de un marcador indeleble traza en la cara posterior de cada caja de cultivo el
número máximo de divisiones posibles (regularmente hasta 16), enumera cada una de estas, tal
como se muestra en la fig 1.
3. Utiliza una asa bacteriológica previamente flameada y toma con ella una de las colonias que se
encuentren aisladas en el cultivo mixto e inocula con ésta el o los medios selectivos que usarás
para su identificación. "Siembra" tal inoculo en la primera división de la caja de cultivo y
registra en tu libreta el número de la división en el cuál fue colocada dicha colonia así como su
procedencia, prueba que se le realiza y las características de la colonia, tales como: forma,
color y textura.
22

4. Repite este procedimiento para 10 o 15 colonias candidatas al género de tu interés. Ten
cuidado de que los inóculos que siembras en los medios selectivos no se toquen entre sí, ya
que ello ocasiona confusión de los resultados y perdida de tiempo.
Nota: Cuando el medio selectivo es de color obscuro te será difícil observar el trazado de las
divisiones, en tal caso forma pequeños círculos en la superficie del medio con la ayuda de un
tubo de ensaye perfectamente estéril, como se muestra en la fig. 2.
Fig.1. Técnica de aislamiento de colonias.
cultivo mixto
5
6 7
cultivo selectivo
Fig. 2. División del área superficial en medios selectivos cuando éstos son de color obscuro.
8
23

4
1
2
3
medio selectivo
En algunas ocasiones la superficie del medio presenta una película de agua, lo que puede
provocar que las colonias se mezclen por movimiento propio, para impedirlo debes permitir que
tal película se evapore antes de realizar la siembra. Ello se logra abriendo por algún tiempo la caja
de cultivo en la campana de flujo laminar.
siguiente:
Rotula tus medios e incúbalos a la temperatura adecuada tal como se indica en el cuadro
Organismo Temp. de Incubación
Rhizobium a 30°C durante 72hrs.
Lactobacillus y Estreptococcus a 36°C durante 48hrs.
Pseudomonas a 36°C durante 72hrs.
Entéricas a 36°C durante 30hrs.
Una vez crecidos los cultivos, identifica cada colonia con base en las indicaciones
descritas para el género de tu interés (ver anexo 2). Es suficiente con cinco aislados (cultivo
puro) de cada género que buscas, si ya los tienes identificados puedes eliminar los cultivos mixtos
que conservas en refrigeración.
24

Ten cuidado de no contaminar los cultivos al momento de identificarlos, si requieres abrir
las cajas hazlo en la campana de flujo laminar ya que estos cultivos te serán útiles en la siguiente
práctica.
Nota: Conserva tus cultivos cerrados y en refrigeración hasta la siguiente práctica.
Reporte
1. Una vez identificadas las cepas, elabora un cuadro de síntesis con la información recabada
hasta este momento para dichos aislados.
2. Realiza una revisión bibliográfica sobre los géneros bacterianos que se pretende aislar.
3. Escribe brevemente sobre la importancia de los medios de cultivo artificial en bacteriología.
4 Propón un método sencillo para identificar y clasificar bacterias.
25

PRACTICA 5
BIOTIPOS
Las bacterias son uno de los grupos más complejos y diversos que se conocen dentro del
mundo viviente, actualmente se reconocen más de 19 diferentes grupos taxonómicos bacterianos
y dentro de cada uno se reúnen varios linajes relacionados que comparten una serie de atributos
similares. A diferencia de los organismos superiores las bacterias no pueden ser identificadas por
sus caracteres morfo-anatómicos externos, debido a su tamaño y a su simplicidad estructural,
regularmente se emplean para su identificación, criterios basados en sus aspectos fisiológicos,
metabólicos o ecológicos.
Desde luego, los mecanismos de identificación bacteriana se siguen desarrollando,
actualmente las investigaciones se enfocan al análisis del genoma, considerando éste una fuerte
herramienta en la clasificación de organismo.
En la presente práctica concluirás la identificación de los géneros mediante la realización
de pruebas bioquímicas. Estas pruebas generarán un patrón de biotipos diversos, según sea la
capacidad que presenten las diferentes bacterias para degradar compuestos orgánicos y
convertirlos en parte de su alimento.
Para estas pruebas utilizaremos medios mínimos enriquecidos con un azúcar en particular,
los cuales se describen en el anexo 1.
Objetivos
1. Determinar grupos bacterianos por pruebas bioquímicas.
2. Cultivar en medios de propagación cepas puras ya identificadas.
3. Conservación de cepas puras.
4. Practicar una nueva técnica de sembrado de bacterias.
Material
Por grupo:
• Cultivos desarrollados en medios selectivos.
26

• De 1 a 2 cajas de cada uno de los siguientes medios mínimos:
• Medio mínimo de citrato.
• De lactosa.
• De arabinosa.
• De sucrosa.
• De rhamnosa.
• De dulcitol.
• De salicina.
• De rafinosa.
• De 30 a 40 tubos de TSI
• Mecheros
• Alcohol
Metodología
• Incubadoras
• Asas bacteriológicas
• Microtubos con 1ml de medio UL estériles (preparados por el profesor previamente).
Pruebas de biotipo:
1. De tus cultivos selectivos, escoge 5 colonias que muestren las características mas semejantes a
lo esperado para ese género en particular.
2. Mediante la técnica de sembrado usada en la práctica anterior (ver fig 1 de la practica 4),
siembra, con el asa bacteriológica, cada aislado en los siguientes medios:
1. TSI
2. Medio mínimos para la prueba de citratos
3. Medios mínimos de:
• lactosa • dulcitol
• sacarosa • salicin
• arabinosa • rafinosa
27

• ramnosa
Observaciones importantes:
• Para obtener los resultados de esta prueba es suficiente con inocular solo una pequeñísima
cantidad de cada aislado en cada uno de los diferentes medios mínimos, así, por cada asada
que tomes del cultivo en los medios selectivos será suficiente para inocular de 3 a 4 medios
mínimos. Trata de que en estos la "película" de bacterias inoculadas sea uniforme y no forme
cúmulos de bacterias, ello ocasionaría que las bacterias se consuman entre ellas y eso dará
resultados erróneos.
• Es importante que el asa sea esterilizada en el mechero cada vez que se inocula un aislado.
• No gastes material innecesariamente, una caja de cultivo de medio mínimo es suficiente para
analizar de 16 a 32 aislados diferentes.
• Cada aislado debe ser inoculado en la misma división en cada medio mínimo y ser registrado
con dicho número en tu libreta de notas.
• Los cultivos en TSI se realizarán en tubos de ensaye, colocando un aislado en cada tubo.
Cada tubo deberá titularse con el número de división que corresponde a dicho aislado en los
medios mínimos.
• Al momento de efectuar la resiembra toma nota de las características que presentan las cepas
elegidas en los medios selectivos y registra el número de división en la cual se encontraban.
Fig. 1. Sembrado múltiple de cepas en medios mínimos y TSI, para probar biotipos.
5
6 7 8
cultivo selectivo
3
4 5
6
medio mínimo
de lactosa
7
2
3 4
5
6
2
3 4
5
6
2
3 4
5
7
7
medio mínimo
de sacarosa
medio mínimo
de arabinosa
6
medio mínimo
de rafinosa
7
medio TSI
28

3. Una vez sembrados los aislados, incuba los cultivos a las temperaturas adecuadas.
4. Pasado el tiempo de incubación analiza tus cepas de la siguiente forma:
1. En los medios mínimos registra si la cepa consume el medio de forma:
• Excelente = +
• Regular = +/-
• Nulo = -
2. En el medio TSI, registra si tus cepas:
• Producen gas (se aprecia en el medio burbujas de gas que dividen la columna de
medio).
• Acidifican el medio (el medio cambia de color de ámbar por amarillo).
• Producen ácido sulfídrico (el medio se tiñe de negro).
Para algunos géneros ya se conoce la respuesta a las pruebas anteriores, este es el caso
de las bacterias entéricas. En la tabla 1 y 2 se muestran tales resultados. Si el género de tu interés
se encuentra en dicha información, coteja los resultados para cada aislado con los de las tablas;
de esta forma podrás ubicar a tu aislado en el género adecuado.
Tabla 1. Biotipos esperados en medio mínimo de azúcar para algunos géneros conocidos de
bacterias.
Géneros Probados
Escherichia
(después de 18 a 24hrs. de incubación a 36°C)
Lact.
+
Saca.
-
Arab.
+
Rham
Dulci.
Sali.
Rafi.
Salmonella - - + + - - - +
Shigella + ó - + ó - + + ó - - - - -
Klebsiella + + + + + + + +
+
+
-
-
Citra
-
29

Proteus - + - - - - - -
Pseudomonas - - + ? ? ? ? +
+ = Consume + ó - = Puede ser cualquiera de las respuestas
- = No Consume ? = No existe información
Tabla 2. Biotipos esperados en medio TSI para algunos géneros conocidos de bacterias.
(después de 18 a 24 hrs. de incubación a 36°C)
Géneros Probados Crecimiento Superficie Fondo Gas H2S
Escherichia Bueno Amarillo Amarillo + -
Salmonella Bueno Rojo Amarillo - +
Shigella Bueno Rojo Amarillo - -
Klebsiella Bueno Amarillo Rojo + -
Proteus Bueno Amarillo Amarillo + +
Pseudomonas Bueno Rojo Rojo - -
Para los géneros no presentes en la tabla1 y 2, deberá registrarse el perfil biotípico de la
cepa y en caso de que alguna se comporte de manera muy diferente a lo común en ese género,
desecha la cepa y si es necesario repite la prueba para otras cepas.
Almacenamiento de cepas puras:
Una vez que tengas perfectamente identificadas a 5 cepas de cada género, almacénalas
para su posterior uso; el procedimiento es el siguiente:
1. Cultiva las 5 cepas identificadas para un género en el medio de propagación indicado (TG o
PY, según sea el caso). Para este fin, la forma de plaquear las cepas se ilustra en la fig. 2.
2. Ya que las cepas hayan crecido, toma con el asa cierta cantidad de bacterias y deposítalas en
1ml de medio líquido UL (ver anexo 3), vortexea, etiqueta a cada muestra y guárdalas en el
congelador.
Fig. 3. Plaqueo con asa de cepas puras en medios de propagación (TG o PY, según sea el caso).
30

Reporte
1
5
2
4
3
1. Haz un informe general de actividades y comparte tus resultados con otros equipos de trabajo.
2. Investiga que otras pruebas bioquímicas se pueden realizar en la identificación de bacterias.
3. Con las cepas puras ya identificadas y guardadas en medio UL, elabora un cepario común
para el grupo. En él anota las observaciones pertinentes de cada uno de los aislados.
4. Investiga que se entiende por serotipo.
PRACTICA 6
PARAMETROS CINETICOS
En condiciones óptimas, el número de bacterias en un cultivo sincrónico se duplica cada
cierto periodo de tiempo de manera continua, en el caso de Escherichia coli , este periodo dura
20 minutos aproximadamente. Las bacterias y otros microorganismos en cultivo se multiplican
constantemente hasta agotar los recursos presentes en el medio y el tamaño de la población
cambia a lo largo del tiempo pasando por la siguientes fases:
• Fase lag
• Fase exponencial
• Fase estacionaria
• Fase de muerte
En cada una de estas, la biomasa del cultivo aumenta o disminuye a consecuencia de
crecimiento o disminución del número de microorganismos en la población.
31

PRACTICA 6
PARAMETROS CINETICOS
En condiciones óptimas, el número de bacterias en un cultivo sincrónico se duplica cada
cierto periodo de tiempo de manera continua, en el caso de Escherichia coli, este periodo
dura 20 minutos aproximadamente. Las bacterias y otros microrganismos en cultivo se
multiplican constantemente hasta agotar los recursos presentes en el medio y el tamaño de
la población cambia a lo largo del tiempo pasando por las siguientes fases:
Fase Lag
(latencia): período de
adaptación, aumento de tamaño
individual; poco crecimiento
Fase Exponencial:
máximo
crecimiento. Alta actividad
fisiológica.
Fase Estacionaria:
tasa de
crecimiento igual a tasa de muerte
(falta de nutrientes y desechos
metabólicos).
Fase de muerte:
acumulación de
metabolitos inhibidores y ausencia
de nutrientes.
En cada una de estas, la biomasa del cultivo aumenta o disminuye a consecuencia de
crecimiento o disminución del número de microrganismos en la población. El aumento del
número de individuos durante el crecimiento bacteriano, provoca una modificación en las
condiciones de su ambiente, algunas de las cuales se pueden registrar como cambios en:
concentración de azúcares, concentración de productos metabólicos, oxígeno, pH, entre
otras. Ahora bien, las modificaciones del medio influyen a su vez en el crecimiento de la
población.
Cada género, tanto en condiciones naturales como en los cultivos de laboratorio, presenta
una cinética de crecimiento particular; en esta práctica se pretende que analice, observe y
calcule algunos de los parámetros de crecimiento de un aislado bacteriano y comparar estos
con la cinética de crecimiento de otros.

Nota: Antes de iniciar tu práctica lee cuidadosamente cada una da las partes de su
desarrollo, si tienes dudas coméntalas con tu profesor. Revisa que todo el material
requerido esté listo.
Objetivos
1. Reconocer los parámetros de una cinética de crecimiento bacteriano.
2. Estimar el tiempo generacional de un aislado bacteriano.
Material
Por grupo:
· Incubadora de movimiento a 35ºC o
30ºC.
· Una incubadora fija a 35ºC o 30ºC.
· Espectrofotómetro.
· Potenciómetro.
· Micropipetas de 0.2 ml y de 1.0 ml
· Puntas estériles.
· Pipetas de cristal de 5ml estériles.
· Campana de flujo laminar.
· Mecheros.
· Asas bacteriológicas.
· Vórtex.
· Perlas de cristal estériles.
· Alcohol.
· Gradilla.
Metodología
· 100ml de solución de glicerol al
20%.
· Medios de cultivo de propagación
· Cultivo de cepa a probar (una por
equipo)
· microtubos de 2ml.
Por equipo:
· Gradilla con 4 tubos de ensaye
conteniendo exactamente 9.9ml de
agua estéril.
· Cajas de Petri con medio nutritivo de
propagación (el adecuado al aislado
que se esta analizando).
Cada equipo de trabajo analizará la cinética de crecimiento de un aislado. El procedimiento
es el siguiente:
Primera parte

Cultivo de bacterias:
El profesor entregara a cada equipo 5 ml de un cultivo overnight de E. coli.
1. Tener preparados matraces estériles con 50 ml de medio de propagación líquido;
enumera los matraces.
2. Tomar una asada de un cultivo previo del aislado a probar e inocular el matraz 1.
Incubar con agitación a 37ºC durante una hora.
3. Repetir el procedimiento del paso dos para el matraz 2, incubar a 30º C durante una
hora
4. Repetir el procedimiento para el matraz tres (un matraz de contiene medio de
cultivo con pH de 5.0). Incubar con agitación a 37ºC durante una hora.
5. Tomar una muestra cada hora de cada uno de los matraces.
Segunda parte
Medición de densidad óptica:
Cada equipo analizará la cinética de crecimiento del aislado en estudio mediante la lectura
de la densidad óptica y el recuento bacteriano. El procedimiento a realizar es el siguiente:
1. Mide la absorbancia (densidad óptica) a 540nm de cada muestra, registra en tu
libreta las diferentes lecturas.
2. Prepara una serie de cuatro tubos de ensaye estériles, cada uno conteniendo
exactamente 9.9 ml de agua estéril y enumera los tubos del 1 al 4. Realiza
diluciones seriales de cada uno de los matraces.
3. A partir de la dilución 1x10 4 en adelante toma 0.1ml y realiza un cultivo de
bacterias tal como se realizó en la practica 3. Inocula de 1 o 2 cajas de medios de
cultivo sólido de propagación. Incubar 24h a 37º C. No olvides etiquetar las cajas
con los datos pertinentes (factor de dilución, nombre y género del aislado, equipo de
trabajo, fecha de inoculación, etc).
4. Ya crecidas las colonias calcula la densidad de bacterias para cada ml de cultivo
Reporte
original de la muestra (sigue la metodología propuesta en la práctica 3) y por regla
de tres, con base en el resultado y a su densidad óptica, calcula la densidad de
bacterias para todas las muestras obtenidas.
1. Anota las observaciones que consideres importantes durante el desarrollo de la
práctica; realiza una revisión bibliográfica sobre el tema y elabora un reporte de la
misma.
2. Construye las siguientes gráficas

a) densidad óptica contra tiempo
b) No de bacterias contra tiempo.
c) pH contra tiempo.
d) número de bacterias contra pH.
Actividad
1. De la siguiente grafica ¿qué nombre recibe la fase marcada con cada número?
2. ¿En qué fase las bacterias se dividen a ritmo constante?
3. ¿Cómo se llama la fase en la que el crecimiento exponencial se para?
BIBLIOGRAFIA
Madigan, M. T., Martinko, J. M., y Parker, J. Brock Biología de los Microorganismos.
10ª edición. Prentice-Hall. Madrid, 2003.

PRACTICA 7
MUTACION, ADAPTACION Y REPARACION
La mutación es la fuerza primaria de la evolución ya que es a través de ella que se genera
la variación genética. Sin variación genética las poblaciones son incapaces de adaptarse a los
cambios ambientales y por lo tanto es más probable que se extingan. Sin embargo, la mutación
implica cambios en el material hereditario y esto es en la mayor parte de los casos deletéreo para
el organismo. ¿Como balancear ambas fuerzas? La mayor parte de los organismos han logrado
mantener tasas de mutación bastante bajas (aproximadamente 1x10 9 por genoma por
generación) reparando eficientemente la mayor parte de las mutaciones y manteniendo un sistema
de replicación a prueba de errores. Sin embargo, hay ocasiones en que el ADN es dañado en
ambas hebras y no tiene una plantilla de donde copiar el pedazo faltante, cuando esto sucede,
existe un sistema de reparación de emergencia denominado SOS, el cual toma un pedazo de
ADN lo copia y lo inserta en el sitio roto. Esto es una medida de emergencia que es, por
necesidad, mutagénica pero que puede salvaguardar al genoma de su muerte y puede ayudar al
organismo a colonizar un nuevo ambiente. Existen sustancias mutagénicas, como el ácido
nalidíxico que pueden romper las dos hebras de ADN en la mayor parte de las bacterias además,
estas sustancias impiden que el ADN puede ser desenrollado; a consecuencia de esto se
despierta el mecanismo de respuesta SOS.
En esta práctica podrás estimar la tasa de mutación de algunas cepas bacterianas.
Nota: Antes de iniciar tu práctica lee cuidadosamente cada una da las partes de su
desarrollo, si tienes dudas coméntalas con tu profesor. Revisa que todo el material requerido esté
listo.
Objetivos
1. Determinar la tasa de mutación normal de cepas bacterianas.
2. Discutir como la mutación y la presión de selección hacen que algunas bacterias adquieran la
capacidad de invadir un nuevo ambiente.
37

Material
Por grupo:
Por equipo:
• Cultivos densos de cepas puras a estudiar (1 cultivo puro por equipo, preparado
previamente por el profesor).
• Campana de flujo laminar.
• Micropipetas de 1ml con puntas estériles.
• Varillas triangulares.
• Asas bacteriológicas.
• Alcohol.
Metodología
Para los equipos que estudian bacterias entéricas o lácticas:
• 3 medios de propagación TG enriquecidos con ácido nalidíxico al 0.05% (antibiótico).
• Cultivo denso de cepa a estudiar (cultivada previamente por el profesor).
Para los equipos que estudian rizobios o pseudomonas:
• 3 medios de propagación PY enriquecidos con clorafenicol al 0.05% (antibiótico).
• Cultivo denso de cepa a estudiar (cultivada previamente por el profesor)
El profesor dará una breve charla del efecto del ac. nalidíxico y del cloranfenicol
(antibióticos) en las bacterias, considerando que las concentraciones usadas no son totalmente
letales.
Primera parte (a realizar por el profesor).
Preparación de cultivo denso de bacterias:
Se recomienda que este cultivo sea fresco, por lo tanto será conveniente prepararlo un día
antes de la práctica.
1. Tomar unas asadas de la cepa a analizar por equipo (crecida previamente en medio de
propagación sólido) y sembrar en 10 ml de medio nutritivo líquido de propagación (ver anexo
1).
38

2. Incubar en agitación durante el tiempo necesario y a la temperatura adecuada con el fin de
obtener la más alta densidad de bacterias en el cultivo ( en el caso de bacterias entéricas y
lácticas, 10hrs son suficiente. En el caso de rizobios o pseudomonas será necesario incubar
por 18 hrs.). Al termino de este tiempo, la densidad de bacterias por ml en dichos cultivos
estará cercano a 1X10 9 bacterias.
3. Si considera necesario compruebe la densidad óptica por espectrofotometría, tomando como
referencia los resultados obtenidos en la practica anterior.
Segunda parte ( a realizar por los alumnos)
Determionación de las tasas de mutación:
1. Pide a tu profesor el cultivo denso de bacterias a estudiar, que tendrá una densidad de 1x10 9
bacterias por ml de cultivo.
2. Inocula el medio enriquecido con antibiótico con 1 ml de tu cultivo y espárcelo
homogéneamente con ayuda de un asa triangular. Antes de cerrar la caja de cultivo espera
hasta que el inóculo se haya secado; posteriormente etiqueta tu caja e incuba a la temperatura
y tiempo adecuado para que se desarrollen colonias visibles.
3. Realiza el paso anterior en 2 cultivos más.
4. Ya incubadas los cultivos determina el número de colonias desarrolladas en promedio, lo cual
indicará el número de bacterias que adquirieron las mutaciones necesarias para tolerar el
efecto del antibiótico.
Reporte
• Compara tus resultados con los obtenidos en otros equipos y discute el experimento.
• Con base en tus resultados obtenidos y teniendo en cuenta que el inoculo inicial contenía un
número aproximado de 1x10 9 células, calcula la proporción de mutantes bajo estas
condiciones.
39

• Investiga bibliográficamente la tasa de mutación real en bacterias y otros organismos.
Observaciones importantes: En la siguiente práctica se analizaran genéticamente algunas de las
cepas aisladas en cada equipo, para lo cual se requiere tener cultivos frescos de las mismas.
Comenta tal necesidad con tu profesor y organiza la preparación de dichos cultivos.
40

PRACTICA 8
SUSCEPTIBILIDAD MICROBIANA A ANTIBIÓTICOS Y EXTRACTOS
NATURALES
OBJETIVOS
Objetivo general
Que el alumno conozca los métodos utilizados para determinar la susceptibilidad de las
bacterias a diferentes antibióticos. Cualitativo, comparando los halos de inhibición;
cuantitativo, determinando la concentración mínima inhibitoria por macro-dilución en caldo.
Objetivos particulares
Parte I
- Que el alumno determine de manera cualitativa, la sensibilidad a diferentes
antibióticos sintéticos y naturales en las bacterias aisladas durante el curso.
Parte II
- Que el alumno determine la concentración mínima inhibitoria (CMI) para ampicilina,
para uno de los asilados bacterianos que resulten resistentes a dicho antibiótico en la
prueba de sensi-discos.
- Que el alumno correlacione el mecanismo de acción de los antibióticos y las
características de los microorganismos con su resistencia o sensibilidad a estos.
Que el alumno discuta la importancia de sus resultados de acuerdo al origen de las bacterias
aisladas durante el curso.
INTRODUCCIÓN.
El objetivo de ésta práctica es conocer algunas técnicas para determinar la susceptibilidad de
las bacterias a los antibióticos. Pero antes de continuar ¿sabes qué es un antibiótico?
Escribe tus ideas generales en el siguiente recuadro.
Actividad 1.
Retroalimentación.
Los antibióticos son compuestos químicos producidos natural o sintéticamente, que inhiben
o matan a los microorganismos; se clasifican y agrupan en diferentes familias de acuerdo al
sitio de acción sobre el microorganismo, algunos actúan impidiendo o modificando la síntesis
de la membrana o pared celular, otros impiden la replicación del ADN, la transcripción o
biosíntesis de proteínas y otros modifican el metabolismo.
Actividad 2.
Instrucción al alumno: Haz clic sobre cada mecanismo de acción (recuadro verde) para
conocer los antibióticos que los llevan a cabo.

La idea es colocar esta imagen y la información de recuadros verdes en ventanas emergentes
que se puedan desplegar cuando el alumno haga clic sobre cada uno, y solo dejar la primer
línea de cada antibiótico, por ejemplo: “Inhibe la síntesis de pared celular”, para que cuando
el alumno haga clic, se vea la lista de antibióticos: D-clicloserina, vancomicina..etc.
Figura 1A. Mecanismos de acción de los antibióticos. Modificada de Pratt C. and Cornely K.
(2004) Essential Biochemistry. Ana Patricia García García, México.
Información que continúa después de la actividad 2.
La sensibilidad de los microorganismos a los antibióticos depende de las características del
microorganismo y del mecanismo de acción del antibiótico. Un antibiótico que actúa tanto en
bacterias Gram positivas como Gram negativas se denomina antibiótico de amplio espectro.
La resistencia es la capacidad natural o adquirida de los microorganismos de sobrevivir en
presencia de ciertos antibióticos. Algunas bacterias que inicialmente eran sensibles a uno o
más antibióticos desarrollan resistencia mediante diversos mecanismos (resistencia
adquirida).
Actividad 3.
Instrucción al alumno: Haz clic sobre cada número (colocar solo números de la imagen de
abajo) para conocer los tipos de mecanismos que tienen algunas bacterias para resistir la
acción de algún antibiótico.
La idea es colocar esta imagen pero solo con los números, para que el alumno pueda hacer
clic sobre ellos y que se vea la frase completa.

Figura 1B. Mecanismos de resistencia bacteriana. Modificada de Pratt C. and Cornely K.
(2004) Essential Biochemistry. Ana Patricia García García, México.
Información que continúa después de la actividad 3.
De acuerdo con tus conocimientos previos ¿Cómo consideras que se podría determinar la
susceptibilidad de una bacteria a un antibiótico específico?
Actividad 4.
Retroalimentación.
Existen métodos cuantitativos y cualitativos para determinar la susceptibilidad a
antibióticos. Los métodos cuantitativos consisten en inocular a los microorganismos en
tubos o pozos con caldo y diluciones seriadas del antibiótico (macro y micro-dilución
respectivamente), éstos se usan para conocer la concentración mínima inhibitoria (CIM),
conocida como la concentración mínima que es capaz de inhibir el crecimiento del
microorganismo en un periodo de tiempo, así como la concentración bactericida mínima
(CBM) que es la concentración de antibiótico capaz de eliminar el 99.9% de la población
bacteriana en determinado tiempo. Para los métodos cualitativos se emplean discos de
difusión, éstos están indicados para microorganismos de crecimiento rápido. La técnica
consiste en depositar discos de papel impregnados con diferentes antibióticos en una placa de
agar inoculada previamente con una suspensión bacteriana; una vez que el papel se humedece,
el antibiótico difunde hacia el agar, después de 24 ó 48 horas se realiza la medición de los
halos de inhibición de crecimiento bacteriano, los métodos cualitativos permiten determinar si
los organismos son sensibles o resistentes al antibiótico. El CLSI, es un organismo

internacional encargado de proveer pruebas y lineamientos estándar para el desarrollo de
pruebas que tienen que ver con la salud.
¿Cuáles consideras que son las aplicaciones de estas pruebas de sensibilidad
microbiana? Selecciona las opciones que consideres correctas.
Actividad 5.
a) aquellos microorganismos que contribuyen a procesos infecciosos y cuya sensibilidad
no puede ser predicha por su identificación bacteriológica
b) en infecciones crónicas o cuadros clínicos de repetición
c) para seleccionar el antimicrobiano más adecuado para algunos pacientes.
Retroalimentación al acierto (a, b y c).
Efectivamente todas las opciones son aplicaciones de las pruebas de sensibilidad. ¡Bien!
Retroalimentación al error (si no seleccionan ninguna opción).
Todas las opciones hacen referencia a aplicaciones de éste tipo de técnicas microbiológicas,
selecciona las que te hagan falta.
Retroalimentación general.
Para conocer mejor las técnica cualitativas y cuantitativas, te invitamos a continuar con esta
lección.
Para llevar a cabo esta práctica se requiere el siguiente material y reactivos:
Actividad 6. Colocar estas listas en ventanas emergentes, para que cuando el alumno haga
clic se despliegue toda la información
MATERIAL (Parte I)
Material por equipo Reactivos por equipo
*3 tubos de ensayo estériles, 5mL **2 sensi-discos con Polimixina B (300 µg)
*3 hisopos estériles **2 sensi-discos con Gentamicina (10 µg)
*frasco con agua estéril, 100 mL aprox. **2 sensi-discos con Ampicilina B (10 µg)
*2 vasos de precipitados estériles, 100mL **2 sensi-discos con Ciprofloxacina (5 µg)
*10 círculos de papel filtro, estériles **2 sensi-discos con Vancomicina (30 µg)
*12 cajas petri de plástico tamaño estándar, **2 aislados de bacterias crecidas en placa y
con agar LB, estériles
por estría
*5 mL de solución salina (NaCl 0.85%) en 2 plantas medicinales, 5 g aprox.
un tubo de 10 mL, estéril
1 probeta 100 mL
1 pinza de disección
1 asa bacteriológica
1 micropipeta de 1 mL
*Puntas para micropipeta de 1mL, estériles
1 mechero
1 tripie
1 lamina de asbesto
*2 bacterias crecidas en placa, por estría
cruzada, para tener colonias bien aisladas

1 vernier o regla
Material por grupo Equipo por grupo
**Estándar de Mc Farland 0.5 Autoclave
**Bacteria de referencia crecida en placa Incubadora a 35°C
(Escherichia coli ATCC 25922)
Balanza
Vortex
* Material preparado y esterilizado con anticipación, una práctica antes.
MATERIAL (Parte II)
**Material proporcionado por el profesor
Material por equipo
*30 mL de caldo LB en matraz, estéril
*9 tubos de ensayo con tapa de algodón
estériles, 5 mL
1 gradilla
Algodón
1 Micropipeta de 1 mL
*Puntas para micropipeta estériles
***1 jeringa para insulina
1 asa bacteriológica
2 mecheros
1 tripie
1 lamina de asbesto
*1 bacteria crecida en placa, por estría
cruzada, para tener colonias bien aisladas
Material por grupo Equipo por grupo
**Bacteria de referencia crecida en placa Autoclave
(Escherichia coli ATCC 25922)
Incubadora a 35°C
**6 mL de stock de LB suplementado con Balanza
256 g/mL de ampicilina.
Vortex
* Material preparado y esterilizado con anticipación, una sesión antes.
**Material proporcionado por el profesor
***Material proporcionado por el alumno
PROCEDIMIENTO
Si tienes el material anterior es necesario llevar a cabo el siguiente procedimiento:
Actividad 7. Haz clic para observar lo referente al Material previo:
Por grupo, preparar 1.5 L de medio LB agar (aproximadamente para 60 cajas Petri),
considerando que hay 5 equipos por grupo y cada equipo necesita 12 cajas.
Por equipo, preparar y esterilizar 30 mL de caldo LB en matraz de 250 mL, 10 mL de
solución salina (NaCl 0.85%) en tubo de 10mL, 12 tubos de ensayo de 5 mL con tapa
de algodón, frasco con 100 mL agua desionizada estéril, 2 vasos de precipitados
100mL y 10 círculos de papel filtro (5mm de diámetro aprox.) envueltos en papel
filtro, puntas para micropipetas de 1mL.

Elaboración de sensidiscos impregnados con infusiones de plantas medicinales.
Pesar 5g de cada planta medicinal (puede variar a consideración del profesor)
Calentar 40mL de agua en vaso de precipitados 250mL, ambos previamente
estériles
Cuando hierva el agua colocar 5g de la planta medicinal y dejar hervir 2 min
Dejar reposar 5 min y pasar la infusión a otro vaso de precipitados 100mL,
previamente estériles
Colocar círculos de papel filtro previamente estériles y dejar impregnar 10 min
Sacar y mantener tapado en caja de petri estéril
Intercambiar discos de diferentes antibióticos entre otros equipos, para que
cada equipo tenga 2 sensidiscos de 10 plantas medicinales.
A cada profesor se le proporcionarán 10 sensi-discos de cada antibiótico mencionado
en la sección de material (Parte I), para repartir 2 a cada equipo (contemplando que
son 5 equipos) y 6 mL del stock de LB suplementado con 256 g/mL de ampicilina.
En el laboratorio habrá 3 mL del estándar de Mc Farland 0.5 y el cultivo de E. coli en
tubo TSA inclinado (almacenamiento a mediano plazo) como cepa de referencia, para
que cada profesor lo incube 35 – 37 0 C / 24h, previo al desarrollo de la práctica.
Actividad 8. Haz clic para observar lo referente a la Parte I
Determinación de susceptibilidad a antibióticos con sensidiscos (Figura 2)
1. Colocar en campana de flujo o entre dos mecheros, 1.5 mL de solución salina (NaCl
0.85%) en cada tubo de ensaye, con micropipeta y puntas estériles, repartir 2 tubos por
equipo más un tubo para el control que realizará el profesor.
2. A partir de un cultivo en placa (en TSA o LB), tomar con un asa bacteriológica 1 ó 2
colonias bien aisladas (por estría cruzada), de la cepa a analizar y disolver en el tubo
de ensaye con solución salina. Mezclar en vortex
3. Ajustar su densidad con el estándar de McFarland 0.5. La suspensión ajustada del
inóculo, no debe permanecer más de 15 a 20 min. antes de proceder a sembrarla en la
placa de agar LB. Realizar el procedimiento para cada bacteria asilada durante el
curso, máximo 2 por equipo y una bacteria tipo (Escherichia coli) como control
positivo.
4. Para inocular la placa, utilizar un hisopo estéril, el cual se sumerge en la suspensión
bacteriana, quitar el exceso de inóculo presionando el hisopo contra las paredes del
tubo, descargar el inóculo en la caja de agar LB en tres direcciones (estría cerrada)
para producir un crecimiento confluente de las bacterias. Dejar secar unos 5 min la
placa antes de depositar los sensi-discos.
5. Para cada una de las bacterias aisladas a analizar depositar los sensi-discos como se
indica en la figura 3 con ayuda de las pinzas estériles en campana de flujo o entre
mecheros y apretarlas ligeramente contra el agar. Esperar de 5 a 10 min, invertir la
placa e incubarla a 35 0 C durante 18-24 h.

6. Pasado el tiempo de incubación, con ayuda de un vernier, medir los diámetros de los
halos de inhibición.
7. Tomar fotografías de los halos de inhibición en todos los antibióticos y reportar los
resultados en tablas.
8. Comparar los resultados obtenidos con la tabla de referencia de sensibilidad para
Escherichia coli (Tabla 2) y analizar la presencia de algún aislado resistente a
ampicilina.
9. Resembrar aislados resistentes a ampicilina para determinar la concentración mínima
inhibitoria (CMI) como lo indica la siguiente parte del protocolo.
10. Esterilizar todo el material utilizado, posteriormente lavar el material de vidrio
reutilizable y desechar los cultivos en la basura ya estériles.
¡¡¡RECUERDA debemos evitar la diseminación de las bacterias dentro y fuera del laboratorio
y mantener un ambiente aséptico en nuestro lugar de trabajo!!!!!
Figura 2.- Procedimiento para evaluar la susceptibildad a antibióticos con el método de
sensidiscos.

Figura 3.- Secuencia de sensidiscos de antibióticos comerciales y extractos naturales que se
usaran para cada cepa bacteriana. Abreviaturas: PB: polimixina B, Vn: vancomicina, Cp:
ciprofloxacino, Gn: gentamicina, Am: ampicilina. Los sensidiscos de infusiones de plantas
medicinales, si son 2 plantas por equipo, pueden intercambiar entre los 5 equipos y probar
hasta 10 plantas por cada equipo.
Actividad 9. Haz clic para observar lo referente a la Parte II
Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de ampicilina para
E. coli y aislados resistentes de cada equipo, de acuerdo a los resultados de la
prueba de sensidiscos.
1.- El profesor recibirá 6 mL de un stock de caldo LB suplementado con 256 g/mL
ampicilina estéril, a partir del cual se realizaran las diluciones seriadas.
2.- Realizar las siguientes diluciones seriadas 1:2 del stock de ampicilina por equipo:
a) Colocar 1 mL de caldo LB en cada tubo y enumerarlos del 1 al 9.
b) Colocar 1 mL del stock de ampicilina en el tubo 1 y homogeneizar
c) Tomar 1 mL del tubo 1, colocarlo en el tubo 2 y homogeneizar. Repetir este
procedimiento hasta el tubo 8. En este punto el tubo 1 tendrá la mayor concentración de
antibiótico y el 8 la menor concentración (ver tabla 1 y figura 4). Después de
homogeneizar el tubo 8 eliminar 1 mL de la mezcla, para finalmente tener 1 mL en cada
tubo.
Nota: El tubo 9 no tendrá antibiótico, este será el tubo control para observar el
crecimiento bacteriano.
No tubo Concentración
final de antibiótico
Stock 256 µg/mL
1 128 µg/mL

2 64 µg/mL
3 32 µg/mL
4 16 µg/mL
5 8 µg/mL
6 4 µg/mL
7 2 µg/mL
8 1 µg/mL
9 Sin antibiótico
Tabla 1. Concentración final de ampicilina en los tubos de dilución seriada para
determinación de la CMI.
3.- Preparar el inóculo tomando con un asa bacteriológica 1 ó 2 colonias bien aisladas de
cultivo en placa de E. coli y resuspender en 1 mL de caldo LB. Ajustar la densidad con
estándar de McFarland 0.5. La suspensión ajustada del inóculo, no debe permanecer más
de 15 a 20 minutos.
4.- Con ayuda de una jeringa para insulina adicionar 0.1 mL del inóculo a cada tubo y
homogeneizar.
5.- Tapar los tubos e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas.
6.- Pasado el tiempo de incubación comparar el crecimiento bacteriano de los tubos de LB
con ampicilina (tubos 1 al 8), con respecto al tubo control (tubo 9) y determinar la
concentración de antibiótico a la cual se inhibió el crecimiento bacteriano, esta
corresponde a la CMI.
8.- Comparar los resultados obtenidos con una tabla de CMI para Escherichia coli (Tabla
2).

Figura 4.- Procedimiento para determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de
ampicilina por el método de macro-dilución en caldo.
Tabla 2. Valores de referencia de sensibilidad a distintos antibióticos

Actividad 10. Para conocer los resultados de un grupo de estudiantes de la facultad de
ciencias, quienes llevaron a cabo esta práctica, haz clic en “ver reporte”.
Durante el semestre 2013-1 se realizó una práctica de campo al centro vacacional del IMSS,
en Oaxtepec, Morelos. Se tomaron muestras de suelo y agua del manantial termal que se
ubica dentro de dicho complejo turístico, a partir del cual se aislaron, bacterias heterótrofas y
autótrofas (cianobacterias). Dentro de las bacterias heterótrofas se obtuvieron 3 tipos de
cultivos axénicos identificados fenotípicamente como Aeromomas spp., Pseudomonas spp. y
Escherichia coli, a los cuales se les determinó la sensibilidad a extractos naturales de plantas
medicinales y a antibióticos.
Figura 5. Esquema de las pruebas de sensibilidad a extractos naturales de plantas medicinales
y antibióticos.
Tabla de resultados:
Tabla 3. Sensibilidad de Aeromonas spp. a extractos naturales de plantas medicinales y a
antibióticos.
Plantas medicinales Diámetros de los halos de inhibición (mm)
Aeromonas spp. Pseudomonas spp. Escherichia coli
Ajo 20 23 15
Hierbabuena 6 7 --
Gordolobo -- -- --
Tabaco 8 -- --
Bugambilia -- 3 --
Antibióticos
Ampicilina 8 27 20
Ciprofloxacino 14 25 28
Gentamicina 17 21 20
Polimixina B 25 23 27
Imágenes de los resultados.
Figura 6. Sensibilidad de Pseudomonas spp. a ciprofloxacino, con halo de inhibición de 27
mm de diámetro.

Figura 7. Resistencia de Aeromonas spp. a ciprofloxacino, con halo de inhibición de 14 mm
de diámetro.
Discusión y conclusión de resultados
La aplicación de métodos cualitativos mediante el uso de discos de difusión, nos permitió
determinar la resistencia de Aeromonas spp. a antibióticos como ampicilina, que es de la
familia de las penicilinas, y ciprofloxacino, que es de la familia de las quinolonas, lo cual
resulta de gran importancia dado que este asilado se obtuvo del agua del manantial termal de
Oaxtepec, por lo que se recomienda continuar con monitoreos periódicos para confirmar la
presencia de esta bacteria heterótrofa resistente.
Actividad 11. Cuestionario
Bibliografía
1. ¿A qué antibiótico, utilizado en ésta práctica, es sensible E. coli?
2. ¿A qué familias de antibióticos pertenecen los utilizados en ésta práctica?
3. ¿Cuál es el mecanismo de acción de los antibióticos utilizados en ésta práctica?
Madigan, Michael T. Martinko, Jhon M (2006). Brock. Biología de los microorganismos (10ª
Ed.). Pearson-Prentice Hall.
CLSI. (2010). Performance standars for antimicrobial susceptibility testing (Vol. 30 No.1).
USA:CDC

PRACTICA 9
FILOGENIA DE PROCARIONTES
La clasificación de los seres vivos es una de las tareas primordiales de la Biología,
actualmente, esta actividad pretende no solo ordenar de manera lógica a los organismos, si no
entender su relación evolutiva, es decir, conocer su filogenia. Para cumplir este objetivo, existen
diferentes corrientes y métodos* que pretenden llegar a un resultado que refleje la filogenia de un
grupo taxonómico, sin embargo, todos ellos parten de un mismo principio, “el análisis de los
caracteres”.
La identificación de caracteres o características es una tarea relativamente fácil,
independientemente concepto y valor de los mismos, que depende de la escuela de clasificación
y método que se elija, por lo cual, el alumno podrá reconocer una serie de caracteres que
observara desde el inicio del curso y a lo largo de las prácticas. Esta información será analizada
en esta práctica utilizando los métodos “clásicos” de clasificación, UPGMA y máxima Parsimonia.
Objetivos
• Identificar los caracteres observados para las bacterias de cada género, registrados a lo largo
del curso.
• Utilizar dichos caracteres para generar una matriz de similitud entre los diferentes organismos
y establecer un diagrama de relación por UPGMA.
• Que el alumno reconozca los principales grupos obtenidos así como su relación filogenética y
su relación entre los diferentes géneros analizados en el curso.
*Los problemas de clasificación y las escuelas filogenéticas serán abordados en semestres
posteriores.
Material
Por grupo:
51

Metodología
Primera parte:
• Un equipo de computo con el programa instalado ETDIV y ETCLUS (Whittam
1990)
• Características observadas durante el curso para las diferentes cepas.
Durante el curso de prácticas, los estudiantes debieron observar, identificar y colectar la
información de los diferentes géneros de bacterias tales como:
• Morfología de la colonia
• Tamaño, forma y pigmentos de la colonia
• Biotipos
• Respuesta a la tinción Gram
• Morfología de la célula (cocos, bacilos, micelos etc).
• Tipo de respiración (aerobios, anaerobios o facultativos, fermentativa u oxidativa)
• Perfiles electroforéticos
Para la recopilación de la información de los caracteres registrados se utilizará la
construcción de una matriz de datos la cuál se codificará con datos DOBLE ESTADO
(presencia, ausencia o estados excluyentes)
Ejemplo1:
1. Pigmentos en la colonia
2. Forma de la colonia
3. Gram
• Presente = 1
• Ausente = 0
• Circular = 1
• No circular = 0
52

4. Síntesis de sacarosa
• Positivo = 1
• Negativo = 0
• Presente = 1
• Ausente = 0
Con esto se proceder a la construcción de una matriz básica de datos, en la cuál se
registrarán los valores obtenidos para cada una de las cepas analizadas.
Ejemplo 2:
Cepa
(OTU)*
CARACTERES
1 2 3 4 5
Rhizobium 1 1 0 0 1 0
Rhizobium 2 1 0 1 1 0
Rhizobium 3 0 1 0 1 1
Pseudomona 1 1 0 1 0 1
Etc..
*OTU: Unidad taxonómica operacional .
Al tener la matriz básica de datos se puede proceder a la construcción de la matriz de
similitud para lo cuál usaremos el coeficiente de similitud más sencillo:
a +d/ a+b+c+d (Simple Matching Coeficcient, SNC) donde a es el número de veces que
se presenta 1-1 en ambos OTUS analizados; b, el número de veces que se presenta 1-0 en
ambos OTUS; c, el número de veces que se presenta 0-1 en ambos OTUS y d el número de
veces que se presenta 0-0.
Ejemplo 3.
Rhizobium 1 1 0 0 1 0
Rhizobium 2 1 0 1 1 0
SMC (Rhizobium 1, Rhizobium 2) = a+d/a+b+c+d = 2+2 / 2+0+1+2 = 0.8
53

Rhizobium 1 1 0 0 1 0
Rhizobium 3 0 1 0 1 1
SMC (Rhizobium1, Rhizobium 3) = a+d/a+b+c+d = 1+1/1+0+2+1 = 0.5
Como se puede observar el rango de valores de similitud en SMC va de 0 a 1.
Este procedimiento se realiza para cada par de cepas analizadas y los datos resultantes te
permitirán elaborar la matriz de similitud.
Ejemplo 4:
Rhizobium 1 1
Rhizobium 1 Rhizobium 2 Rhizobium 3 Pseudomona 1
Rhizobium 2 0.8 1
Rhizobium 3 0.5 0.25 1
Pseudomona 1 0.4 0.6 0.2 1
Por último se construirá un fenograma que esquematice la relación de similitud entre las
cepas analizadas
Ejemplo 5:
Primero se agrupan los OTUS con mayor similitud:
Rhizobium1
Rhizobium 2
54

En seguida se procede a la agrupación del siguiente OTUS la cual deberá presentar la
mayor similitud, respecto al OTU más similar de los ya agrupados.
Segunda parte:
Ejemplo 6:
Así hasta terminar con todos los OTUS.
Rhizobium 1
Rhizobium 2
Pseudomona 1
Con los datos de las tres isoenzimas ensayadas elabora una base de datos.
CARACTERES (Isoenzimas)
Rhizobium 1
Rhizobium 2
Pseudomona 1
Rhizobium 3
Cepas (OTU) IDH G6PDH1 G6PDH2 MDH
Rhizobium 1 1 3 0 1
Rhizobium 2 2 2 1 0
Rhizobium 3 2 1 0 0
55

Mediante el programa ETCLUS, elaborar el dendrograma de relaciones genéticas entre las
diferentes cepas analizadas.
Con esto terminan tus prácticas de biología de procariontes. Elabora el proyecto final y
presenta los resultados en un seminario con la participación de todos los equipos del grupo.
56

PRACTICA 10
MINIPREPARACIÓN DE DNA GENÓMICO DE PROCARIONTES
La extracción de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras
membranales que confinan al DNA y otras moléculas dentro del citoplasma esto
normalmente se consigue con detergentes iónicos y sales astringentes que desnaturalizan
las moléculas y permiten mantener en solución las moléculas de DNA. Por medio de
precipitaciones deferenciales se van eliminando las moléculas biológicas no deseadas y
finalmente la última precipitación se realiza con alcoholes para la precipitación de DNA en
forma de una sal. El DNA es lavado con una solución de alcohol y agua para remover las
sales añadidas en los procesos anteriores, después y por último la recuperación del DNA es
resuspendido en agua o algún Buffer conteniendo al DNA en estado puro.
De la gran mayoría de muestras biológicas que podemos utilizar para la extracción de
DNA, las suspensiones de procariontes (particularmente proteobacterias), son las más
sencillas de procesar ya que ofrecen menos resistencia a la lisis celular y proveen de mayor
cantidad de material biológico en un tiempo relativamente menor.
Los procariontes en cultivos líquidos saturados son lisadas y sus proteínas removidas con
digestión con proteinasa K. los remanentes de pared celular, polisacáridos y proteínas son
removidas con precipitación selectiva con CTAB, y el DNA de alto peso molecular se
encuentra en el sobrenadante y después se precipita con isopropanol.
Nota: El siguiente protocolo fue extraído de Current protocols in Molecular Biology,
Contributed by Kate Wilson Current Protocols in Molecular Biology (1997) 2.4.1-2.4.5
Materiales:
TE buffer
10% duodecil sulfato de sodio (SDS)

20 mg/ml de Proteinasa K (alicutada a -20°C)
5 M NaCl
CTAB/NaCl
24:1 cloroformo alcohol isoamilico
25:24:1 fenol/cloroformo isoamilico
Isopropanol
70% alcohol etanol
Procedimiento:
1. inocular 5 ml de cultivo con una colonia de bacterias. Crecer en condiciones apropiadas
para cada cepa hasta que el cultivo este saturado.
2. centrifugar 1.5 ml del cultivo en micro centrifuga por 2 min. O hasta que se forme un
botón compacto de células. Descartar el sobrenadante.
3. resuspender el botón en 567 µl de buffer TE por repetición de pipeteo. Añadir 30 µl de
SDS al 10% y 3 l de Proteinasa K para dar una concentración final de 100 µg /ml de
proteinasa K en 0.5% de SDS. Mezclar e incubar 1 hr a 37°C.
La solución se puede hacer viscosa debido a que el detergente lisa la pared celular y no
puede requerir un tratamiento previo con lisozima.
4. añadir 100 µl de NaCl 5M y mezclar suavemente.
Este paso es muy importante donde el DNA y el CTAB pueden precipitar si la
concentración de sal es menor a 0.5 M a temperatura ambiente (Murray and Thompso1980)
la idea aquí es remover los restos celulares. Proteínas desnaturalizadas y polisacáridos
complejos del CTAB, el cual retiene al DNA en solución.
5. añadir 80 µl de la solución de CTAB/NaCl mezclar suavemente e incubar 10 min a 65°C.
6. Añadir un volumen (aprox. 0.7-0.8 ml) de fenol/cloroformo/isoamilico, mezclar
ligeramente y centrifugar de 4 a 5 min en microfuga.
Esta extracción remueve el complejo CTAB-Proteína/polisacáridos. Se puede observar una
interface blanca después de la centrifugación.

7. colocar la fase acuosa (sobrenadante viscoso) a un tubo nuevo sin llevarse la interface.
Añadir un volumen de cloroformo isoamilico mezclar por inversión y centrifugar 5 min.
Con algunas bacterias la interface formada después de la extracción con cloroformo no es
compacta por lo que debe retirarse con pipeta antes de retirar el sobrenadante.
8. transferir el sobrenadante a otro tubo nuevo. Añadir 0.6 volumenes de isopropanol para
precipitar los ácidos nucléicos. Agitar por inversión hasta observar precipitados de DNA
(para mejores resultados dejar que se precipite mayor cantidad de DNA guardando el tubo
a -20°C mínimo por 2 Horas). Centrifugar por 10 min a 14000 rpm en frio
Lavar el precipitado con etanol al 70% y recentrifugar por 5 min. Retirar con cuidado el
sobrenadante y dar un pequeño ¨spin¨. Secar en un liofilizador.
9. Disolver el botón en 100µl de buffer TE.
10. Guardar el DNA a -20°C. Para corroborar los resultados, observar el DNA cromosomal
en un gel de agarosa al 8%.
TE (pH 8.0) Tris 10 mM, EDTA 1 mM
Volumen 1L 500 ml 100ml 50 ml 25ml
Tris 1 M 10 ml 5ml 1ml 0.5.ml 0.25ml
EDTA 500 mM 2ml 1ml 0.2ml 0.1ml
0.05ml
Buffer de corrida para electroforesis de DNA - TAE (50X)
Tris Borato TBE 5X
Volumen 1L 500 ml 100ml 50 ml 25ml
Tris base 54g 27g 5.4g 2.7g
Acido bórico 27.5g 2.75g
EDTA 0.5M 2ml 1ml 0.2ml 0.1ml 0.05ml

AISLAMIENTO DE rizobios A PARTIR DE NÓDULOS DE LEGUMINOSAS
Práctica realizada por Lourdes Lloret y Sánchez para el manual de la Asignatura de
Biología de Procariontes Primer semestre de la Licenciatura de Biología,
Facultad de Ciencias UNAM
lloretsl@yahoo.com.mx
I Introducción
La diazotrofía es un proceso procarionte
La fijación biológica del nitrógeno (diazotrofía) es un proceso muy antiguo que
probablemente se originó en el Eon arqueano bajo las condiciones anoxigénicas de la
atmósfera primitiva, y es exclusivo de procariontes. Dentro del dominio de Archeae
sólo ocurre en Euryarchaeota y en Bacteria esta presente en 6 Divisiones. Algunos de
estos linajes coevolucionaron conjuntamente con las angiospermas estableciendo las
bases moleculares de una relación planta-­‐bacteria de simbiosis mutualista. La fijación
de nitrógeno es un proceso de alto costo energético para la célula procarionte que
gasta 16 moléculas de APT y la enzima responsable es el complejo de la nitrogenasa
que se inhibe en contacto con el oxígeno de modo que dentro del nódulo de la raíz, el
bacteroide tiene las condiciones adecuadas para llevar a cabo este proceso.
Interacción planta-­‐bacteria
En el caso de los rizobios, el nitrógeno es fijado dentro de estructuras especializadas,
los nódulos, que se desarrollan en la raíz (fig.1) o raramente en el tallo de muchos
géneros dentro de la familia Leguminosae (las leguminsosas). Su organogénesis se
inicia con los factores de nodulación codificados en el genoma de la bacteria, en
plásmidos grandes o islas de simbiosis.
Los rizobios se encuentran en vida libre viviendo en el suelo pero cuando se
encuentran cerca de las raíz de una leguminosa hospedera los exudados de la raíz
contienen flavonoides que activación de la expresión de genes de nodulación por parte
de la bacteria que a su vez detonan en la corteza de la raíz
la formación de un hilo de infección por el que la bacteria
penetra a la raíz que finalmente forma una estructura
especializada llamada nódulo (figura 1) en donde el rizobio
se transforma a la forma de bacteroide. La interacción con la
planta puede ser específica o promiscua, es decir, un rizobio
es capaz de inducir la formación de nódulos en una sola
planta hospedera (específico) o en varias (promiscua) y
también por parte de la planta, existen hospederos
específicos o promiscuos.
Figura 1.
Nódulos de frijol
(Phaseolus vulgaris)
En el estado de bacteroide, el rizobio sufre una transformación y se enciende el
conjunto de genes para fijación de nitrógeno que consiste en la reducción de nitrógeno
molecular (N2) a amonio (NH4). En esta relación planta-­‐bacteria, la planta provee de
1
1

fuentes de carbono a la bacteria y la planta recibe nitrógeno en forma de amonio que
puede utilizar cuando este elemento escasea en el suelo. Los rizobios pueden ser
utilizados como bifertilizantes como ocurre en Brasil en donde es una practica agrícola
extensa para el cultivo del frijol de soya, inoculando Bradyrhizobium spp.
Para el caso de México en el área de investigación básica se tiene un avance
significativo. El primer genoma secuenciado en México fue la de la bacteria Rhizobium
etli, especie aislada del frijol (“etli” significa frijol en lengua Nahuatl). Adémas de R. etli,
otras especies del género Rhizobium descritas en México son R. huautlense R.
morelense, R. tropici y dentro del género Sinorhizobium, se han descrito S.
americanum, S. mexicanum y S. chiapanecum, especies que fueron aisladas en la
reserva de la Biosfera de la Sierra de Huautla en el Estado de Morelos y el Parque
Nacional del Cañón del Sumidero, en el Estado de Chiapas habitando los nódulos del
género Acacia.
Géneros de rizobios
Además de los géneros arriba mencionados, otras especies de rizobios han sido
descritas. La filogenia del gen rrs agrupa a los rizobios dentro de la división
Proteobacteria, mayoritariamente en la subdivisión α-­‐Proteobacteria con nueve
géneros: Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium, Sinorhizobium, Azorhizobium,
Methylobacterium, Devosia, Phyllobacterium y Shinella, y en la subdivisión β-­‐
Proteobacteria en dos géneros Burkholderia y Cupriavidus. En la figura 2 se muestra un
árbol filogenético construido con la secuencia de este gen incluyendo a todas las
especies de las que se ha aislado simbiontes de nódulos de en su mayoría de
respresentantes de la familia Leguminosae.
Figura 2. Representación de
un árbol filogenético sin raíz
de Proetobaceria en donde se
incluyen los nombres de los
géneros de α-­‐ y β-­‐
Proteobacteria que se han
encontrado en nódulos de
plantas. Adaptado de Moulin
et al 2001 y Masson et al.
2009.
2
2

II Objetivo
Aislamiento de rizobios en su medio ambiente natural mediante la búsqueda de raíces
con presencia de nódulos en ejemplares de plantas leguminosas.
III Procedimiento
1 Trabajo de Campo
Los nódulos de las leguminosas se encuentran tanto en plantas cultivadas como en
plantas silvestres de leguminosas productoras de nódulos. Para estudiar a los rizobios
hay que ubicar a su hospedero en campo y excavar sin perturbar la sobrevivencia de la
planta para llegar hasta la parte radicular para encontrar los nódulos. Se debe de
obtener una muestra tanto de la parte aérea como de la parte radicular. De la parte
aérea se toma una muestra de tallo hojas y flor que se meten dentro de una prensa de
papel y cartón para desecarlos y poder preservar este material en herbario. De la parte
radicular se toma un fragmento de raíz con nódulos y se mete dentro de una bolsa de
plástico debidamente etiquetada para transportarlos al laboratorio. Una vez en el
laboratorio, los nódulos se cortan de la raíz y deben ser desinfectados antes de
extraer a los rizobios que habitan dentro. Una vez desinfectados, los nódulos se
aprietan con unas pinzas estériles sobre una caja Petri con medio de cultivo YMA
adicionado con azul de bromotimol para sembrarlos con un asa bacteriológica e
incubarlos para obtener los aislamientos de cepas de rizobios.
En resumen estos son los pasos a seguir:
-­‐ Ubicación de ejemplares de la especie de leguminosa en campo
-­‐ Identificar hasta nivel de especie el ejemplar seleccionado de la planta leguminosa.
-­‐ Tomar una muestra de la parte aérea flor, tallo y hojas y colocarlo dentro de una
prensa construida con papel manila y cartón.
-­‐ Excavar hasta la zona de la raíz, teniendo cuidado de no lesionar la supervivencia del
ejemplar en campo.
-­‐ Extraer un fragmento pequeño de raíz que contenga nódulos radiculares. (Los
nódulos contienen a los simbiontes (figura 1).
-­‐ Enjuagar la raíz con agua y colocarla dentro de una bolsa de plástico.
-­‐ Etiquetar la bolsa con un plumón indeleble, escribiendo el nombre de la especie de la
planta hospedera, nombre del colector, fecha, ubicación del ejemplar.
-­‐ Trasladar el material colectado bien empacado y etiquetado al laboratorio para
proseguir con la desinfección y el aislamiento.
3
3

2 Trabajo en el Laboratorio
Una vez en el laboratorio extraer los nódulos de la raíz para lavarlos y desinfectarlos.
Posteriormente romperlos apretando con unas pinzas y estriar el contenido que es un
líquido lechoso que contiene a los rizobios, en una caja Petri con medio YMA y azul de
bromotimol. En la figura 3 se resumen los cuatro pasos para el tratamiento de los
nódulos y la siembra de los rizobios.
Después de sembrar los rizobios, meter a incubar a 29ºC y revisar la aparición de
colonias aisladas y el vire de color del medio diariamente por un lapso de entre 2 a 15
días. Reportar estos resultados en la tabla de resultados.
En resumen estos son los pasos a seguir:
Selección de nódulos y primer lavado con agua destilada
-­‐ Seleccionar los nódulos mas grandes y extraerlos cuidadosamente cortando por su
base con una tijera en una caja petri limpia conteniendo agua destilada estéril y lavar
agitando para desprender los restos de suelo.
Desinfección de nódulos.
-­‐ Eliminar el agua y agregar alcohol etílico 90% por 1 minuto.
-­‐ Pasar a otra caja petri conteniendo alcohol etílico al 70% y mantener por 1 min en
agitación.
-­‐ Pasar a otra caja petri conteniendo alcohol etílico al 50% y mantener por 1min en
agitación.
-­‐ Escurrir el alcohol y ahora, agregar solución de hipoclorito de sodio 25% por 3
minutos en agitación.
-­‐ Escurrir el cloralex (hipoclorito de sodio) en un recipiente aparte y lavar los nódulos 5
veces con agua destilada esterilizada hasta eliminar restos del cloro.
Precaución: Si los nódulos son muy pequeños, no aplicar los pasos de desinfección con
alcohol y reducir el tiempo de en hipoclorito de sodio a medio minuto.
Siembra de los rizobios
-­‐ Tomar el nódulo con una pinza estéril, oprimirlo y ahora colocar el jugo celular (del
nódulo exprimido) sobre una orilla del medio YMA.
-­‐ Estriar con una asa bacteriológica por agotamiento en estría sobre placas con YMA
-­‐ Incubar las placas 5 días entre 28ºC y 30ºC. Revisar el crecimiento desde el segundo
día y anotar en que día aparecen las colonias aisladas.
4
4

Figura 3. Procedimiento de desinfección nódulos y siembra de rizobios
IV Material
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Bolsas de plástico
Marcador indeleble
Pinzas y pala de jardín
Papel manila y cartón
Prensa
Cuerda
Tijeras
Toallas de papel
Raíces de frijol con nódulos
Agua destilada estéril
Alcohol etílico concentrado
Alcohol etílico al 70%
Hipoclorito de Sodio (cloralex) 25%
Pinzas estériles
Cajas Petri estériles vacías (3)
Cajas Petri con medio YMA (25) adicionado con azul de bromotimol pH=7
Asa bacteriológica
Mechero Bunsen
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V Soluciones y Medio de cultivo
Azul de bromotimol al 0.5%
Azul de bromotimol …………………………………. 0.5 g
Alcohol etílico …………………….…………………… 20 ml
NaOH 0.016N …………………………………………… 80 ml
Modo de prepararlo. Colocar el azul de bromotimol en un vaso de precipitado con el
alcohol, disolver con una barilla de vidrio.
Añadir la solución de NaOH 0.016N, mezclar y ajustar el pH entre 6.8 y 7
Hipoclorito de Sodio al 25%
Hipoclorito de Sodio (Cloralex) …………………. .. 250 ml
Agua destilada …….………………..……………………... 750 ml
Modo de prepararlo. Medir en una probeta 25 ml de Cloralex y completar el volumen
hasta 100 ml. Colocarlo en una botella de vidrio pyrex y esterilizar en autoclave.
Agua destilada estéril 1L
Colocar el agua destilada dentro de una botella de vidrio pyrex y esterilizar en
autoclave.
Medio YMA adicionado con azul de bromotimol
K2HPO4 0,5 g
MgSO4 x 7 H2O 0,2 g
NaCl 0,1 g
Manitol 10 g
Extracto de levadura 0,5 g
H2O destilada c.b.p. 1 L
4 ml de azul de bromotimol
Añadir el colorante azul de bromotimol antes de añadir el agar y ajustar el pH a 7 con
HCl (el pH=7 se alcanza cuando el color es verde)
Agar 15 g/L
Nota. Las cantidades anotadas para la preparación del medio YMA son para un litro de medio. Llevar
todo a la mitad para preparar solo medio litro de medio para llenar aproximadamente 25 cajas Petri.
6
6

VI Resultados
Reporta los datos de colecta y aislamiento en el laboratorio en la siguiente tabla de
resultados.
Núm. de
aislado
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Leguminosa
(nombre de la
especie)
Nódulo
núm.
Aparición de
colonia
aislada núm.
de días
Vire del
color del
medio
Reporta:
(nombre de la persona
que hace el reporte)
Observaciones. Anotar cualquier comentario que se considere relevante durante el
procedimiento y anotación de resultados.
VII Preguntas
Con las preguntas 1 a 3 construye una tabla para reportar tus resultados
1. ¿Cuantos días tardó en observase crecimiento?
2. Describe la morfología colonial de la bacteria aislada.
3 ¿Que color toma el medio después de que creció la bacteria? De acuerdo al color que
tomo el medio, ¿El crecimiento de la bacteria acidificó o alcalinizó el medio?
4. ¿El frijol es una leguminosa promiscua o no promiscua?
5. Si la bacteria que aislaste creció entre los primeros 5 días ¿que especie crees que
sea? ¿y si hubiera crecido después que especie podría ser?
4. Menciona el nombre del género de cuatro plantas de interés agrícola de la Familia
Leguminosae y su bacteria simbionte.
5. ¿Por que la fijación de nitrógeno ocurre dentro del nódulo de la planta y no afuera?
6. ¿Que procedimiento se tendría que hacer para comprobar que la bacteria que
aislaste es un rizobio que habita dentro del nódulo del que la aislaste y no un
contaminante?
7
7

Referencias
Spaink, Kondorosi, Hooykaas. The rhizobiaceae. Molecular biology of model plant-­‐
associated bacteria. Kluwer Academic Publishers.1998.
González V, et al. 2006. The partitioned Rhizobium etli genome: genetic and metabolic
redundancy in seven interacting replicons.
Proc Natl Acad Sci U S A. 103(10):3834-­‐9.
Lloret, L. y Martínez-­‐Romero, E.. 2005. Evolucion y filogenia de Rhizobium. Revista
Latinoamericana de Microbiolgía. 47 (1-­‐2): 43-­‐60.
Masson and Hurst. Manual of environmental microbiology manual of methods for
general bacteriology. American Society for Microbilogy. Ed. ASM Press.
Masson-­‐Boivin, C , E. Giraud, X. Perret, Jacques Batut. 2009. Establishing nitrogen-­‐
fixing symbiosis with legumes: how many rhizobium recipes? . Trends in Microbiology
17(10): 458–466.
Moulin, L. A. Munive, B. Dreyfus and C. Boivin-­‐Masson. 2001. Nodulation of legumes
by members of the β-­‐subclass of Proteobacteria. Nature 411, 948-­‐950.
Segovia, L., Young, J. P. W. & E. Martínez-­‐Romero. 1993. Reclassification of American
Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli type I strains as Rhizobium etli sp. nov. Int.
J. Syst. Bacteriol., 43:374-­‐377.
Somasegaran, P. and Hoben H.J 1994. Handbook for Rhizobia: Methods in Legume-­‐
Rhizobium Technology. Ed. Sprienger Verlag.
8
8

Reactivos para la tinción de Gram:
ANEXO 1
Formulario de los medios o soluciones
1. Colorante primario (cristal violeta al 1% en solución).
2. Solución alcalinizante.
3. Lugol.
7. Decolorante.
• .1gr/10 ml de agua destilada.
• Bicarbonato de sodio 1.25gr
• Agua destilada 100 ml.
4. Cristales de yodo 1gr.
5. Yoduro de potasio 2gr.
6. Agua destilada 100 ml.
• Alcohol etílico al 95%
8. Colorante de contraste (safranina al 1% en solución).
Agar TCBS
Modo de preparar:
• .1gr/10 ml de agua destilada.
Ingredientes para 1 litro
• Extracto de levadura……………5gr.
• NaCl…………………...............10gr.
• Peptona de proteasa………....10gr.
• Citrato Ferroso………...............1gr.
• Citrato de Sodio………………..10gr.
• Azul de bromthymol .........….0.04gr.
• Tiosulfato de Sodio………...….10gr.
• Azul de thymol......…………..0.04gr.
• Oxgall………………..………..….8gr.
• Agar……………..............….....15gr.
• Sacarosa……………...…………20gr.
pH final 8.6
57

1. Trabajar en campana de flujo laminar.
2. En un recipiente estéril diluir los ingredientes en 1lt. de agua estéril.
3. Hervir hasta disolver perfectamente (No autoclavear).
4. Vaciar en cajas de Petri estériles.
5. Conservar el medio preparado de 2 a 8°C
Agar TG
Modo de preparar:
Ingredientes para 1 litro.
• Triptona…………………............10gr.
• Extracto de levadura……………...1gr.
• NaCl………….............................1gr.
• Agar…………............................16gr.
• Glucosa.....................................10gr.
pH final 7.0
1. En 750ml de agua destilada diluir triptona, extracto de levadura, NaCl y agar.
2. En 250ml de agua destilada, diluir la glucosa.
3. Esterilizar ambas soluciones por 15 min.
4. Dejar enfriar (a 60 o C, aprox.) y mezclar las soluciones.
5. Vaciar en cajas de Petri estériles
Solución salina
Modo de preparar:
1. Diluir NaCl en 1lt. de agua destilada.
2. Esterilizar por 15 min.
Medios con antibiótico
Ingredientes para 1 litro
• NaCl........................................8.5gr.
• Agua destilada.............................1lt.
Estos medios se preparan utilizando como base un medio enriquecido.
Se prepara el medio nutritivo, puede ser TG o PY, se esteriliza y se deja enfriar ( 60ºC ) una vez tibio
se agrega el antibiótico que se desea probar en la concentración requerida:
• Clorafenicol al 0.05%.
58

• Acido nalidíxico al 0.05%.
Medio mínimo para prueba de citrato y azúcares
Ingredientes para 1 litro
• Fosfato de Potasio Dibásico.........................7 gr.
• Fosfato de Potasio Monobásico...................2 gr.
• Sulfato de Amonio.......................................1 gr.
• Citrato de Sodio........................................0.5 gr.
• Agar .........................................................16 gr.
• Diluir los compuestos en 750 ml de agua destilada (solución 1)
Para cada medio mínimo adicionar una de las siguientes azucares en las cantidades
marcadas par un litro de medio:
Modo de preparar:
• Glucosa..................................4gr.
• Lactosa..................................4gr.
• Rafinosa.................................2gr.
• Arabinosa...............................2gr.
• Dulcitol...................................3gr.
• Rhamnosa..............................2gr.
• Salicin.....................................2gr.
• Diluir en 250 ml de Agua destilada (solución 2).
1. Por separado esterilizar las diluciones 1y 2
2. Mezclar las diluciones 1 y 2 cuando estas estén a 60°C (más o menos)
3. Adicionar 1 ml de Sulfato de Magnesio al 5%
4. Adicionar 1 ml de Vitamina B1 al 2%
Agar PA
Preparación de la vitamina: (Tiamina )
• Disolver 0.2 gr de vitamina en 100 ml de agua destilada.
• Esterilizar por filtración.
Ingredientes para 1 litro
• Peptona…………………………… …20gr.
• Cloruro de Magnesio………………..1.4gr.
• Sulfato de Potasio………………....…10gr.
• Irgasan………………………..……..0.25gr.
• Agar…………………………...……..13.6gr.
59

Modo de preparar:
pH final 7.0
1. Disolver los ingredientes en 980 ml de agua destilada.
2. Agregar 20 ml de glicerol.
3. Esterilizar por 15 min.
4. Vaciar en cajas de Petri estériles.
5. Conservar el medio preparado de 2 a 8°C.
Agar TJA
Modo de preparar:
Ingredientes para 1litro
• Jugo de tomate……………………..…20gr.
• Peptona…………………………….....10gr.
• Leche peptonizada……………....…..10gr.
• Agar……………………………….....…20gr.
1. Diluir los ingredientes en 1 lt de agua destilada
2. Esterilizar por 15min
3. Vaciar en cajas de Petri estériles.
4. Conservar el medio preparado de 2 a 8°C
Agar MacConkey
Modo de preparar:
pH final 6.1
Ingredientes para 1litro
• Peptona de caseina...................................15gr.
• Lactosa.....................................................10gr.
• Sales biliares.............................................1.5gr.
• NaCl............................................................5gr.
• Agar.......................................................13.5gr.
• Rojo neutro..............................................0.03gr.
• Cristal violeta..........................................0.001gr.
pH final 7.1
1. Diluir los compuestos en 1 lt. de agua destilada
2. Esterilizar por 15 min.
3. Vaciar en cajas de Petri estériles
4. Conservar el medio preparado de 2 a 8°C
60

Agar Verde Brillante
Modo de preparar:
1. Diluir en 1 lt de agua destilada.
2. Esterilizar por 15 min.
Ingredientes para 1litro
• Peptona de caseina...................................10gr.
• Extracto de levadura....................................3gr.
• Lactosa.....................................................10gr.
• Sacarosa...................................................10gr.
• NaCl............................................................5gr.
• Agar..........................................................18gr.
• Verde brillante.........................................0.02gr.
• Rojo fenol................................................0.08gr.
3. Vaciar en cajas de Petri estériles.
4. Conservar el medio preparado de 2-8°C
Agar EMB
Modo de preparar:
pH final 6.9
Ingredientes para 1litro
• Peptona de caseina...................................10gr.
• Lactosa.......................................................5gr.
• Sacarosa.....................................................5gr.
• Fosfato de potasio dibásico..........................2gr.
• Agar.......................................................13.5gr.
• Eosin Y.....................................................0.4gr.
• Azul de metileno......................................0.07gr.
1. Diluir en 1lt de agua destilada o estéril.
2. Esterilizar por 15 min.
3. Vaciar en cajas de Petri.
4. Conservar el medio preparado de 2-8°C
pH final 7.2
61

Agar TSI
Modo de preparar:
1. Diluir en 1 lt de agua destilada.
2. Esterilizar por 15 min.
3. Vaciar en tubos de ensaye.
Ingredientes para 1litro
• Extracto de carne de res..............................3gr.
• Extracto de levadura....................................3gr.
• Peptona....................................................15gr.
• Dextrosa.....................................................1gr.
• Lactosa.....................................................10gr.
• Sacarosa...................................................10gr.
• Sulfato ferroso..........................................0.2gr.
• NaCl............................................................5gr.
• Thiosulfato de sodio..................................0.3gr.
• Agar...........................................................12gr.
• Rojo fenol..............................................0.024gr.
4. Dejar enfriar con los tubos inclinados.
5. Conservar a temperatura ambiente.
Agar PY y PYnal
Modo de preparar:
pH final 7.4
Ingredientes para 1litro:
• Peptona de Caseina…………………5gr.
• Extracto de Levadura………….........3gr.
• Agar..………………………………….15gr.
pH final 6.5
Para preparar PYnal agregar a lo anterior:
• Acido Nalidíxico…………………….60mg.
pH final 6.3
1. Diluir los ingredientes en 1 lt. de agua destilada
2. Esterilizar por 15 min.
62

3. Después de esterilizar, agregar 1 ml de CaCl por cada 100 ml de medio una vez que el medio
esté tibio. La solución de CaCl se prepara diluyendo 10.2gr. en 100 ml. de agua (esterilizar por 15
min.)
4. En el caso de PYnal agregar ácido nalidíxico.
5. Conservar el medio preparado de 2 a 15°C
16. LB
Modo de preparar:
Ingredientes para 1litro:
• Triptona de Caseina………………… 10gr.
• Extracto de levadura.........................5gr.
• Cloruro de Sodio ………………........10gr.
• Agar..…………………………………..15gr.
1. Diluir los ingredientes en 1 lt. de agua destilada.
2. Esterilizar por 15 min.
3. Conservar el medio preparado de 2 a 15°C
63

ANEXO 2
Sinopsis de los géneros bacterianos que se estudiarán durante el curso, así como los
resultados esperados en los medios de propagación y selectivos más usados para su
1. Escherichia,Salmonella y Shigella:
cultivo e identificación.
• Pertenecen al grupo de las bacterias entéricas coliformes.
• Quimioheterótrofas.
• Bacilares.
• Gram negativas.
• Escherichia y Salmonella son móviles por flagelos perítricos.
• Shigella no es móvil
• Aerobias facultativas.
Medio de propagación: TG o LB
• Habitan principalmente en el tracto digestivo de vertebrados, en agua y suelo.
• Pueden ser parásitas provocando graves enfermedades intestinales.
Medios selectivos: MacConkey, Verde Brillante y medios utilizados en pruebas bioquímicas
(medios mínimos + azúcar, TSI).
2. Vibrio, Klebsiella, Proteus:
• Pertenecen al grupo de las bacterias entéricas no coliformes.
• Quimioheterótrofas.
• Móviles por flagelos polares.
• Klebsiella no móviles.
• Proteus muy móviles por flagelos perítricos, por su gran movilidad en las
placas de cultivo forman círculos concéntricos de crecimiento, muy
característico de este grupo.
• Gram negativas.
• Bacilares.
• Anaerobios facultativos.
• Se desarrollan principalmente en aguas contaminadas, también en suelo.
64

Medio de propagación: TG y LB
• Klebsiella frecuentemente invade las vías respiratorias.
• Vibrio como parásito causan el cólera.
Medios selectivos: TCBS, MacConkey, EMB y medios utilizados en pruebas bioquímicas
(Medios mínimos + azúcar, TSI)
3. Pseudomonas:
• Quimioheterótrofas
• Aeróbicas
Medios de Propagación: TG
• Gram negativas
• Muy móviles por flagelos polares (1 a 3), algunas especies no móviles
• Para su estudio se han dividido en 4 subgrupos
a) Fluorescentes
b) Pseudomaleícas
c) Acidóvoras
d) Xantomonas
• Algunas producen pigmentos de color amarillo (Xantmonas).
• Habitan suelo y el agua.
• Pueden ser parásitos oportunistas de plantas y animales.
• Muy generalistas en la utilización de compuestos orgánicos como fuente de
energía y carbono.
Medio selectivo: Pseudomona agar y medios utilizados en pruebas de biotipos (Medios
mínimos + azúcar, TSI).
4. Rhizobium
• Quimioheterótrofas.
• Aeróbicas estrictas.
• Gram negativas.
• Bacilares.
• Móviles por flagelos subpolares.
65

Medio de propagación: PY
Medios selectivos: PYnal, LB y PA.
• Habitan libremente en los suelos, o bien forman asociaciones con
leguminosas, en las cuales provocan la formación de estructuras nodulares en
las raíces. En simbiosis fijan nitrógeno atmosférico en forma de compuestos
nitrogenados útiles para la planta.
7. Lactobacillus vulgaris y Streptococcus thermolabilis
• Quimioheterótrofas.
• Gram positivas.
• No móviles.
Medio de propagación :TG
Medio selectivo: TJA
• Fermentativas, producen ac. láctico como producto final.
• Anaerobios facultativas.
• Crecen preferentemente en medios ácidos.
• Habitan por lo general en los productos lácteos como el queso, mantequilla,
yoghurt, etc.
Resultados esperados en diferentes medios selectivos
Resultados esperados en medio MacConkey
Después de 18 a 24hrs. a 35°C
Organismo Crecimiento Coloración de las
colonias
Enterobacter Bien a Excelente De rosas a rojas
Escherichia Bien a Excelente De rosas a rojas
Proteus Bien a Excelente Tenues
Salmonella Bien a excelente Tenues
Shigella Pobre a bien Tenues
66

Resultados Esperados en medio Verde Brillante
Después de 18 a 24hr a 35°C
Organismo Crecimiento Coloración de
las colonias
Salmonella Bien Rosa pálido a Rojas
Escherichia Nada a poco Amarillo Verdosas
Resultados esperados en medio TCBS:
Después de 18 a 24hr. a 35°C
Organismo Crecimiento Coloración de las colonias
Vibrio cholera Bueno Amarillas
Vibrio fluviales Bueno Amarillas
Vibrio parahaemolyticus Bueno Azul
Vibrio vulnificus Bueno Amarillas a translúcidas
Resultados esperados en medio EMB
Después de 18 a 24 hrs a 35°C
Organismo Crecimiento Coloración de las colonias
Enterobacter Bien Rosas no brillosas
Klebsiella Bien brillante Verde metálico
Proteus Bien a Excelente Pálidas
Salmonella Bien a Excelente Pálidas
Resultados esperados en pseudomona agar:
Después de 18 a 48hr. a 35°C
67

Organismo Crecimiento Coloración de las colonias
Pseudomonas aeruginosa Bueno Verde o Azul Verde
Resultados esperados en PY y PYnal:
Después de 48 a 72hr. a 30°C
Organismo Crecimiento Coloración de las colonias
Rhizobium etli Excelente De translúcidas a blanco
Resultados esperados en LB:
Después de 48 a 72hr. a 30°C
Organismo Crecimiento
Rhizobium sp. Nulo
Resultados esperados TJA:
Después de 40 a 48hr. a 35°C
Organismo Crecimiento Coloración de las colonias
Lactobacillus sp Excelente blancas yesosas
Nota: Si se dificulta la observación de las colonias se recomienda espolvorear CaCO3 sobre el
cultivo, el ácido producido por las bacterias neutralizará el carbonato formándose un anillo
translucido en torno a la colonia, lo que permitirá su fácil observación.
ANEXO 3.
Almacenamiento de cepas puras
Las cepas puras que se obtengan de los cultivos será conveniente almacenarlas, con el fin
de disponer de ellas cuando así se requiera. En general las bacterias se conservan perfectamente a
una temperaturas de
68

-20°C, para ello las cepas son colectadas en medio UL contienen.
Modo de preparar:
Ingredientes para1 litro de UL
• Peptona…………………………………10gr.
• Glicerol…………………………………150ml
• Agua……………………………………850ml
1. Mezclar perfectamente los ingredientes.
2. Vaciar en microtubos de 1.5 de capacidad (aproximadamente 1 ml por tubo)
3. Esterilizar por 15 min.
4. Dejar enfriar antes de usarse.
La colecta de las cepas seleccionadas se realiza con una asa flameada, colectando una
buena cantidad de bacterias, se cierra bien el microtubo y se agita para homogeneizar la mezcla.
No olvide etiquetar uno a uno los microtubos, regularmente se utilizan números o letras a manera
de claves, las que se registran en una libreta de uso exclusivo para este fin.
Para iniciar un nuevo cultivo basta con tomar una asada de la cepa y sembrarlo en su particular
medio de propagación. Se debe tener cuidado de no contaminar el inóculo de bacterias.
69