Ver/Abrir - Repositorio Digital - Instituto Politécnico Nacional

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INSTITUTO POLITÉCNICO
NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E
INVESTIGACIÓN
Efecto condroprotector de un menisco de
bioingeniería en un modelo animal de osteoartritis.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRÍA EN CIENCIAS
CIENCIAS DE LA SALUD
Área Investigación Clínica
PRESENTA:
Dr. Carlos Javier Pineda Villaseñor
Director de Tesis: Dra. María Elena Sánchez Mendoza
.
1

III

Noviembre de 2011
Este trabajo fue realizado en el Instituto Nacional de Rehabilitación (INR) de la
Ciudad de México en donde colaboran el Bioterio, el laboratorio de Ingeniería de
Tejidos, Patología, Ultrasonido y el Servicio de Ortopedia del Deporte y
Artroscopía.y en las instalaciones del Centro de Enseñanza, Investigación y
Extensión en Producción Ovina (CEIEPO) de la facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia de la UNAM, Tres Marías, estado de Morelos.
Este proyecto contó con financiamiento por parte del Fondo Sectorial de
Investigación en Salud y Seguridad Social SSA/IMSS/ISSSTE-CONACyT Registro
115511.
IV

INDICE
Glosario ............................................................................................................... V
Abreviaturas .................................................................................................... V
Términos ......................................................................................................... V
Relación de figuras y tablas ............................................................................... VIII
Resumen ............................................................................................................. IX
Abstract ............................................................................................................... XI
1. Introducción ..................................................................................................... 1
2. Antecedentes .................................................................................................. 4
2.1 Patogénesis del daño articular en la osteoartritis ..................................... 6
2.2 Anatomía y fisiología de los meniscos ..................................................... 6
2.3 Morfología de los meniscos ..................................................................... 9
2.4 Trasplante de menisco ............................................................................ 10
2.5 Ingeniería de tejidos ................................................................................ 11
3. Justificación .................................................................................................... 13
4. Hipótesis......................................................................................................... 15
5. Objetivos ........................................................................................................ 16
5.1. Objetivo General .................................................................................... 16
5.2. Objetivos Particulares ............................................................................ 16
6. Material y Métodos ......................................................................................... 18
6.1 Tipo de estudio ....................................................................................... 18
6.2 Variables de estudio ............................................................................... 18
6.3 Protocolo quirúrgico y manejo de las especies 19
6.4 Métodos de laboratorio 20
6.4.1 Cultivo de células de menisco 20
6.4.2 Pasaje celular de menisco 22
6.4.3 Construcción del menisco de bioingeniería 22
6.5 Procedimiento anestésico 22
6.6 Procedimientos quirúrgicos 23
V

6.6.1 Técnica quirúrgica del trasplante de menisco 23
6.7 Histología 25
6.8 Ultrasonido 25
6.9 Microscopía electrónica 26
6.10 Cálculo tamaño muestral 26
6.11 Análisis estadístico 27
7. Resultados 28
7.1 Población de estudio .................................................................................... 28
7.2 Microscopía electrónica ................................................................................ 28
7.3 Evaluación cartílago articular ....................................................................... 29
7.3.1 Evaluación macroscópica .......................................................................... 29
7.3.2 Evaluación histológica ............................................................................... 31
7.4 Evaluación ultrasonográfica ......................................................................... 33
7.5 Eventos adversos ......................................................................................... 34
8. Discusión ........................................................................................................ 35
9. Conclusiones .................................................................................................. 39
10. Perspectivas ................................................................................................. 40
11. Bibliografía ................................................................................................... 42
12. Anexos ......................................................................................................... 49
VI

I GLOSARIO
I.I ABREVIATURAS
• CEIEPO Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en
Producción Ovina de la facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia de la UNAM
• DE Desviación Estándar
• DNA Ácido desoxiribonucleico
• DMEM Medio de cultivo [Dulbecos Modified Eagle Medium]
• IL1 Interleucina 1
• INR Instituto Nacional de Rehabilitación
• HE Hematoxicilina y eosina
• LCA Ligamento cruzado anterior
• nm Nanómetro
• OA Osteoartritis
• OARSI Osteoarthritis research society international
• PACS Picture Archiving and Communication System
• PGA Ácido poliglicólico
• US Ultrasonido musculoesquelético
• VMO Vasto medial oblicuo
I.2 TÉRMINOS
• Artrofibrosis: presencia de material fibrocicactricial distribuido en las
estructuras articulares, resultado de una intervención quirúrgica.
• Babilla: En los cuadrúpedos, conjunto de músculos y tendones que articulan
el fémur con la tibia y la rótula.
• Biomecánica: Ciencia que investiga las fuerzas internas y externas que
actúan sobre los cuerpos vivientes, considerando las propiedades y
VII

supuestos mecánicos del aparato locomotor, que a su vez depende
funcionalmente de las condiciones biológicas de los mismos.
• Etiología: Estudio de las causas de las enfermedades.
• Incidencia: La incidencia es el número de casos nuevos de una
enfermedad en una población determinada y en un periodo
determinado.
• Menisco: Estructuras fibrocartilaginosas en forma de letra “C” que se
encuentran en la rodilla y tienen funciones de estabilidad, distribución de
energía de la articulación. Normalmente existen dos meniscos uno medial y
otro lateral en cada rodilla.
• Menisco de Bioingeniería: Constructo formado por un polímero de ácido
PGA y recubierto con una malla bioabsorbible de celulosa y fibrocondrocitos
autólogos de menisco.
• Meniscectomía: Evento quirúrgico en donde se reseca quirúrgicamente la
totalidad del menisco.
• Meniscectomía artroscópica: Intervención quirúrgica que consiste en la
introducción por punción dentro de la articulación de un sistema de lentes
conectados a una pantalla que permite la visualización de las estructuras
intraarticulares. Por otro acceso se introducen los instrumentos que
permiten la extirpación y regularización de los meniscos.
• Osteoartritis (OA): También conocida como artrosis u osteoartrosis; es una
enfermedad articular crónica, ocasionada básicamente por el deterioro del
cartílago hialino e hiperreactividad de los osteoblastos del hueso
subcondral. A pesar de que es considerada una enfermedad articular
VIII

degenerativa, es debida a un proceso dinámico que refleja un desbalance
entre la formación y la destrucción del cartílago articular, asociado a una
hiperplasia del hueso subcondral.
• Osteoblastos: son células del hueso, sintetizadoras de la matriz ósea
por lo que están involucradas en el desarrollo y el crecimiento de los
huesos.
• Trasplante de Menisco: Traslado de la estructura fibrocartilaginosa en forma
de “C” del compartimento lateral de la rodilla a uno deficiente en especies
homólogas.
• Ultrasonido: Método de diagnóstico por imágenes que emplea haces
sonoros cuya frecuencia se ubica por arriba del espectro audible por el oído
humano (> 20,00 Hz) y evalúa las estructuras musculoesqueléticas de
acuerdo a su particular impedancia acústica.
IX

II. RELACIÓN DE FIGURAS Y TABLAS
Tabla 1. Clasificación de Kelly para la evaluación de cambios macroscópicos del
cartílago (Pág. 49).
Tabla 2. Clasificación de OARSI de osteofitos (Pág. 49).
Tabla 3. Calificación histológica modificada de Mankin (Pág. 50).
Tabla 4. Variables dependientes (Pág. 51).
Tabla 5. Flujograma metodológico (Pág. 52).
Tabla 6. Descripción de los sujetos de estudio (Pág. 53).
Tabla 7. Microscopía Electrónica (Pág. 53).
Tabla 8. Evaluación macroscópica cartílago y osteofitos (OARSI) (Pág. 54).
Tabla 9. Evaluación ultrasonográfica (Pág. 55 ).
Figura 1. Evaluación por Microscopía Electrónica (Pág. 29).
Figura 2. Evaluación Macroscópica del cartílago articular (Pág. 30).
Figura 3. Evaluación histológica del daño del cartílago articular (Pág. 32).
Gráfica 1. Evaluación histológica del daño del cartílago articular (Pág. 33).
X

III. RESUMEN
Introducción. La meniscectomía es un factor conocido de riesgo para el
desarrollo de osteoartritis (OA) de la rodilla. En un esfuerzo por restablecer o
preservar la anatomía y función normal de la rodilla, se han empleado trasplantes
de menisco que mejoran la sintomatología de los pacientes, pero no han retrasado
la aparición de OA. La meniscectomía es el estándar para producir OA de la rodilla
en modelos animales. La ingeniería de tejidos es una estrategia que permite
formar tejido autólogo para restituir funciones biológicas perdidas. Objetivo. El
objetivo central de este trabajo fue construir un tejido similar al menisco utilizando
un polímero biodegragadable sembrado con fibrocondrocitos autólogos, que
reemplace al menisco nativo y prevenga el desarrollo de OA. Material y métodos
Se intervinieron quirúrgicamente 10 ovejas Sufolk, mayores de 6 años. Se
asignaron por sorteo simple a 4 grupos: las rodillas no operadas fueron tomadas
como control (grupo 1), el grupo de meniscectomía (grupo 2), un grupo de
trasplante de menisco (grupo 3), un grupo de menisco de bioingeniería (grupo 4).
Resultados. Los meniscos de bioingeniería presentaron mejores características
estructurales en la microscopía electrónica de transmisión que los trasplantes de
menisco y la meniscectomía. Encontramos fibrocondrocitos productores de matriz
extracelular y fibras de colágena inmadura en los meniscos de bioingenierías a
diferencia de los otros grupos experimentales.
Por otro lado, en ningún grupo experimental se demostró efecto condroprotector.
Se corroboró la permanencia en posición anatómica los meniscos implantados y
XI

trasplantados por US y evaluación directa. Dos sujetos de investigación
presentaron artrofibrosis, uno en el grupo de meniscectomía y otro del grupo de
menisco de bioingeniería. Conclusiones, se demostró la capacidad de formar
tejido similar al menisco usando una plataforma de fibrocondrocitos autólogos y
una matriz sintética biodegradable. Sin embargo, no previno el desarrollo de OA.
Palabras Clave: Osteoartritis, menisco de bioingeniería, condroprotección,
trasplante menisco.
XII

IV. ABSTRACT
Background. Meniscus injuries represent the most common cause of arthroscopic
surgery. Meniscectomy is a well-known risk factor for developing osteoarthritis
(OA) of the knee. Meniscus transplants improve patient’s symptoms, but up to day,
there is no evidence for delay the onset of knee OA. The main objective of this
work is to generate a bioengineered meniscus implant, based on cell cultures to
prevent the development of knee OA and to compare the efficacy and safety of
different surgical procedures (bioengineered meniscus implant and autologous
meniscus transplant) through the assessment of OA lesions, in a Sufolk sheep
model. Main results, suggest that there is no solid evidence for the prevention of
Knee OA with any of the procedures evaluated (meniscus transplant,
bioengineering meniscus implant). However, the tissue found in bioengineered
implants showed better ultrastructural features than that in autologous meniscus
transplants. Minor complications in different surgical techniques such as
arthrofibrosis, effusion and synovial hypertrophy were present, suggesting that
there is a need to refine the surgical technique and peri-and postoperative
management. Conclusion. There was no evidence of condroprotective effect of
any of the surgical procederes evaluated in this study. We were able to recover
meniscal tissue from our bioengineered implant.
XIII

1. INTRODUCCIÓN
Los meniscos son estructuras fibrocartilaginosas que juegan un importante papel
en la transmisión de cargas, estabilidad de la articulación y protección del cartílago
articular, también conocido como cartílago hialino. Las lesiones a los meniscos
frecuentemente son sintomáticas y resultan en una cirugía artroscópica para su
reparación.
Hoy en día, la cirugía conservadora dirigida a preservar la mayor cantidad menisco
es la conducta quirúrgica a seguir ya que se ha demostrado que la remoción de
entre el 16 y el 34% del menisco incrementa la carga biomecánica sobre el
cartílago articular, hecho que se correlaciona con la aparición y progresión de
cambios de OA (1-2). Sin embargo, en algunas circunstancias, la meniscectomía
total es la única opción debido a la complejidad y gravedad de las lesiones
meniscales. Por otro lado, la meniscectomía es un factor conocido de riesgo para
el desarrollo de osteoartritis (OA) de la rodilla (1-9).
En un esfuerzo de restablecer la anatomía y fisiología normales de la rodilla (10-
17) y prevenir el subsecuente daño degenerativo al cartílago articular, se han
empleado diferentes estrategias quirúrgicas, una de ellas es el trasplante de
menisco de cadáver técnica con la que se consigue mejorar la sintomatología de
los pacientes hasta en un 70% de los casos, sin embargo, este procedimiento no
ha demostrado prevenir el desarrollo de la OA (18-23). En modelos animales, la
meniscectomía es el estándar para producir OA de la rodilla experimentalmente.
La OA, también conocida como artrosis, es una enfermedad articular crónica,
ocasionada básicamente por el deterioro del cartílago hialino e hiperreactividad de
1

los osteoblastos del hueso subcondral. A pesar de que es considerada una
enfermedad de tipo degenerativo relacionada con la mayor edad del individuo, es
debida a un proceso patológico dinámico que resulta de un desbalance entre la
formación y la destrucción del cartílago articular, asociado a un intento de
reparación manifestado por osificación endocondral e hiperplasia del hueso
subcondral.
En diferentes modelos animales, en los que se han trasplantando meniscos
homólogos, NO se ha logrado demostrar que la maniobra tenga un papel
condroprotector, específicamente en la prevención del daño al cartílago articular
que desemboca en el desarrollo de OA (24-30).
Objetivo General:
El objetivo central de este trabajo fue desarrollar un menisco con ingeniería de
tejidos que sea eficaz y seguro para prevenir el desarrollo de la OA en un modelo
animal.
Para ello, el estudio contó con 4 grupos experimentales:
Grupo 1. Control (Rodillas no operadas)
Grupo 2. Meniscectomía
Grupo 3. Trasplante de menisco.
Grupo 4. Menisco de Bioingeniería.
Los desenlaces a comparar para eficacia fueron: presencia de alteraciones
osteocartilaginosas propias de la OA evaluadas tanto macroscópicamente, como
microscópicamente y calidad de tejido implantado evaluado por microscopía
electrónica.
2

Con respecto a seguridad los desenlaces a comparar fueron: la permanencia en
posición anatómica del menisco de bioingeniería y el desarrollo de eventos
adversos.
3

2. ANTECEDENTES
Las lesiones de los meniscos se presentan mas frecuentemente en pacientes
jóvenes dentro de rangos de la segunda a la cuarta década de la vida.
Las lesiones meniscales están entre las lesiones de la rodilla más comunes. La
incidencia de lesiones meniscales agudas es 61/100,000. En pacientes sobre 65
años, hay un 60% de incidencia de rupturas meniscales degenerativas. Las
lesiones meniscales son mas frecuentes entre el género masculino que entre el
femenino, con una frecuencia de 2.5:1, El pico de edad para el género masculino
se presenta entre los 31 y 40 años de edad y para el femenino entre los 11 y 20
años. Los procedimientos quirúrgicos sobre los meniscos se realizan sobre un
estimado de 850,000 pacientes por año (1).
Las lesiones meniscales son 2.5 veces más frecuentes que las lesiones del
ligamento cruzado anterior (LCA). En Suecia, se realizaron 20,000 cirugías de
menisco que representan ocho veces más procedimientos quirúrgicos que las
reconstrucciones del LCA (1). El estado del menisco es un determinante
fundamental de la función y de riesgo de OA a mediano plazo (10 años) después
de una cirugía de LCA (2) .
Estas estimaciones de incidencia poblacional, sugieren un riesgo atribuible de
lesiones meniscales sintomáticas que requiere cirugía de por lo menos el 15%, en
pacientes con un rango de edad de 10 a 64 años, a las cuales se debe agregar las
lesiones meniscales que no causan síntomas (1,2).
4

En población joven, la lesión a los meniscos, usualmente es el resultado de
trauma o lesiones deportivas, y constituye una de las principales indicaciones de
cirugía artroscópica (1-3). Los meniscos son muy importantes en las funciones de
absorción del impacto biomecánico, lubricación articular y de proveer funciones
estabilizadoras de la rodilla (4-6). La meniscectomía es uno de los determinantes
más importantes de la función a largo plazo y factor de riesgo para el desarrollo de
OA de la rodilla. El cirujano ortopedista aborda las lesiones del menisco con el
interés de preservar la mayor cantidad de tejido posible, ya que su ausencia se
asocia directamente con el desarrollo de OA de la rodilla (7, 8).
Se ha demostrado un riesgo relativo de 6 a 8 veces para el desarrollo de OA
radiográfica, en pacientes con meniscectomía, comparados a controles no
operados. También se ha descrito mayor asociación de OA en pacientes con
meniscectomías del compartimiento lateral más que del medial, y mayor
asociación de OA en meniscectomía totales que en meniscectomías parciales, y
se considera un factor de riesgo más importante en la génesis de OA de rodilla
que las causas hereditarias (9-10). Con una meniscectomía parcial, hasta el 84%
de los pacientes mostraran evidencia radiográfica de deterioro de la articulación de
la rodilla a través del tiempo (11-12).
Tradicionalmente, la OA se ha reconocido como una artropatía no inflamatoria, de
carácter degenerativo, pero con los nuevos métodos de estudio y evaluación, se
ha demostrado que algunas vías de la cascada de la inflamación están activadas
en el líquido sinovial. Algunos de los factores implicados en su génesis son
mecánicos como la obesidad, lesiones meniscales, y sobrecarga biomecánica.
5

Recientes estudios mencionan la importancia de otros factores como la
inestabilidad articular, debilidad muscular y síndromes de mala alineación.
2.1 Patogénesis del daño articular en la osteoartritis.
Los cambios en el cartílago articular en la OA, incluyen una degradación
proteolítica de la matriz extracelular, asociada al aumento en la síntesis de
algunos componentes de la matriz por los condrocitos. Estos eventos se reflejan
por cambios morfológicos tempranos del cartílago como: fibrilación de la superficie
condral, formación de fisuras y disminución del espesor del cartílago articular. Los
cambios óseos de la OA son: formación de osteofitos en el margen articular,
aumento del aporte vascular y endurecimiento del hueso subcondral.
Las citocinas pro-inflamatorias, como la Interleucina 1 (IL-1), la colagenasa-1
(MMP-1), la estromelisina-1 (MMP-3) y la gelatinasa que son enzimas
proteolíticas encargadas de la degradación de la matriz extracelular en la OA y
otros factores como la plasmina, catepsina, y el óxido nítrico son liberados desde
el cartílago, el tejido sinovial y el hueso, lo que conduce a un proceso inflamatorio
de los condrocitos y del tejido meniscal.
2.2.Anatomía y fisiología de los meniscos
Es esencial un conocimiento de la anatomía de los meniscos, su bioquímica, su
biomecánica y sus funciones para comprender su patología, su tratamiento y las
técnicas de la cirugía de reparación meniscal (13).
En la rodilla hay dos meniscos, uno medial y otro lateral, cada uno con su propia
morfología y función. Las propiedades fisiológicas, bioquímicas, biomecánicas,
6

ultraestructurales de los meniscos han sido estudiadas por diversos autores tanto
en situaciones de normalidad como de patología y de meniscectomía (13-15).
El menisco interno o medial cubre aproximadamente el 30% de la meseta tibial
medial y tiene forma oval. El menisco externo o lateral, recubre aproximadamente
un 50% del platillo tibial lateral y tiene una forma más circular. Los cuernos anterior
y posterior del menisco medial se encuentran más separados que en el menisco
lateral. La zona periférica del menisco interno o medial se inserta anteriormente al
platillo tibial mediante los ligamentos menisco-tibiales o coronarios, centralmente a
la cápsula articular y al ligamento lateral interno, y posteriormente a la cápsula
articular. No hay inserciones del menisco externo al ligamento lateral, y el tendón
poplíteo interrumpe su inserción capsular posterior. El menisco interno tiene una
inserción más firme que el externo y menor movilidad en sentido anteroposterior,
con una translación de hasta 5 mm. durante la flexión de la rodilla, mientras que el
menisco externo puede desplazarse hasta 11 mm.
La irrigación del menisco es importante en la cicatrización del trasplante y para
aportar los nutrientes necesarios para la repoblación del injerto con
fibrocondrocitos. El 10-30% de la periferia de los meniscos recibe su nutrición a
través de una red capilar premeniscal que se origina a lo largo de la periferia del
menisco desde las arterias geniculadas medial, lateral y media. El tercio central
avascular del menisco adulto recibe su aporte de nutrientes por difusión desde el
líquido sinovial. Esto significa que la porción central tiene una capacidad limitada
de cicatrización, pero la zona periférica es capaz de una respuesta vascular.
También existen canales vasculares que se extienden a la zona avascular,
7

preparando al cartílago meniscal para actuar como un andamio para la
repoblación por fibrocondrocitos.
Los meniscos intervienen en la estabilidad articular, la absorción de impactos y la
lubricación de la articulación. Ayudan a estabilizar la rodilla profundizando la
meseta tibial de manera que el fémur y la tibia conserven una mayor superficie de
contacto y una posición relativa adecuada a través de todo el arco de movilidad de
la articulación. La carga del peso provoca que el menisco comprima el líquido
sinovial hacia el interior del cartílago articular, disminuyendo las fuerzas de la
rodilla hasta un coeficiente de fricción de 0,001. La importancia de la función
estabilizadora de los meniscos es más patente en la rodilla sin LCA, porque en ella
se produce un aumento significativo en la translación de los cóndilos femorales
durante el movimiento de la rodilla después de la meniscectomía medial,
especialmente tras la resección del cuerno posterior.
La transmisión de cargas y la absorción de fuerzas de choque son dos funciones
mecánicas importantes de los meniscos y que intervienen en la prevención del
desgaste o degeneración del cartílago articular. Las propiedades viscoelásticas del
menisco producen tensión que resiste el desplazamiento radial convirtiendo las
cargas axiales en stress tensil. En conjunto, los meniscos transmiten 45-60% de la
carga compresiva (más en la parte medial que en la lateral), y esta puede
aumentar hasta 95% al flexionar 90º la rodilla, centrándose la mayoría de la carga
en los cuernos posteriores a 70º de flexión. Las fuerzas de contacto aumentan
enormemente tras la meniscectomía, y la capacidad de absorción de impactos de
la rodilla puede reducirse hasta en un 20%.
8

Tanto la meniscectomía parcial como la total, conducen a una disminución del
área de contacto con el consecuente aumento de los picos y la media de las
fuerzas de contacto. Radin demostró lo anterior a través de estudios fotoelásticos;
Baratz utilizando película sensible a la presión y Kurosawa empleando técnicas de
moldeo. Todos ellos demostraron que el hecho de concentrar una fuerza
biomecánica de mayor magnitud sobre un área más reducida de cartílago hialino
conlleva un desgaste del cartílago articular y en consecuencia al desarrollo de la
OA (5).
2.3 Morfología de los meniscos.
Los meniscos son estructuras fibrocartilaginosas en forma de “C”, interpuestas
entre los cóndilos del fémur y tibia. Realizan importantes funciones en la
articulación de la rodilla dadas sus propiedades viscoelásticas: se mueven y
distribuyen la carga al pasar de posición de flexión a extensión con carga,
absorben el impacto al funcionar como un medio bifásico que al ser comprimido
expulsa el agua y al relajarse es afín por ella, y favorecen la estabilidad articular
(13-15).
Histológicamente, el menisco esta compuesto principalmente por agua y un
entramado de fibras de colágena y células, dispuestas en una matriz de
proteoglicanos y glicoproteínas.
Las células del menisco son responsables de sintetizar y mantener la matriz
extracelular. Se han descrito dos formas de células dentro del menisco: una
fusiforme localizada en la superficie del menisco, y una ovoidea o poligonal
dispuesta en el resto del mismo. A esta última se le ha llamado fibrocondrocito por
9

su apariencia, y por la capacidad de formar una matriz extracelular fibrosa (16).
Desde 1936, se sentaron las bases de la reparación meniscal: para que haya
cicatrización debe haber comunicación con el aporte sanguíneo periférico y una
respuesta reparadora adecuada. Al examinar un menisco lesionado para su
potencial reparación, frecuentemente se clasifica de acuerdo a la localización de la
lesión y su “apariencia vascular”, se denominan lesiones periféricas a aquellas
lesiones ubicadas en la zona roja-roja; centrales a aquellas localizadas en la zona
blanca-blanca; y roja-blanca en la transición periferia-centro. Teóricamente, las
lesiones en la región roja-roja tienen suficiente vascularidad para sanar con un
excelente pronóstico, y las lesiones de la región blanca-blanca no sanan por la
ausencia de vasos sanguíneos (17).
2.4 Trasplante de menisco.
Una vez resecado un menisco, se han utilizado diferentes estrategias terapéuticas
en los pacientes sintomáticos (síndrome post-meniscectomía): implantes de
colágena, tejido interpuesto (submucosa intestinal, tejido adiposo, tendones, etc.),
la técnica más difundida es el trasplante homólogo de menisco. El trasplante de
menisco se ha utilizado en procedimientos de reconstrucción y salvamento (18,
19). Ha demostrado ofrecer mejoría clínica en cuanto a sintomatología y función
(20-23). Existen diferentes tipos de trasplantes; frescos, frescos congelados,
congelados y desecados, criopreservados. La sobrevida clínica de los meniscos a
los 10 años para los meniscos mediales y laterales es de 74.2% y de 69.8%
respectivamente. Las técnicas de congelamiento profundo y congelamiento
desecación han mostrado que destruyen las células viables y desnaturalizan
10

antígenos de histocompatibilidad (21-23).
Se han superado algunos cuestionamientos iniciales como la cicatrización a la
cápsula y la repoblación del injerto. Sin embargo, durante artroscopias de revisión
se ha puesto de manifiesto una rápida degeneración del menisco y por otro lado,
existe evidencia de una menor capacidad biomecánica del menisco trasplantado.
No existe evidencia que el trasplante meniscal detenga en alguna medida el
desarrollo de OA de la rodilla acorde con el desenlace a largo plazo mostrado en
diferentes estudios (24-30,42).
2.5 Ingeniería de tejidos.
La ingeniería de tejidos busca reemplazar las funciones biológicas y estructura
perdidas de los tejidos del cuerpo. La ingeniería de tejidos aplicada al cartílago
articular es un campo científico emergente con diferentes perspectivas clínicas
(31).
Desde que los condrocitos fueron aislados y mantenidos en cultivo a finales de
1960, la tecnología para expansión condrocítica, para la medición de la
proliferación y de la actividad biosintética han progresado. El entendimiento de
cómo algunos factores ambientales influyen en la expresión fenotípica de los
condorcitos también ha avanzado. Los cultivos celulares de cartílago, son
relativamente sencillos de aislar y mantener, ya que son de tan solo una estirpe
celular.
Los cultivos celulares de condrocitos, han sido aprobados para el uso
clínico en procedimientos de reparación de cartílago articular (32).
El ácido poliglicólico (PGA) un polímero biodegradable, se ha utilizado en
diferentes protocolos generando constructos con células de menisco (33), sin
11

embargo no se ha probado su eficacia en modelos in vivo de OA. La celulosa
oxidada regenerada, se absorbe del lugar de implante dando lugar al crecimiento
celular y generación de matriz; la tasa de absorción depende de varios factores,
incluyendo la cantidad utilizada y la zona de implantación. En este proyecto de
investigación se pretende generar un sustituto de menisco utilizando un polímero
comercial de PGA y celulosa oxidada (BIOFELT®, Concordia fibers) como
andamio interno para las células, aunado a una malla de celulosa biodegradable
(PROCEED® Surgical Mesh, Ethicon) para proporcionar sostén y fijación a la
superficie articular.
12

3. JUSTIFICACION
La lesión a los meniscos es la principal indicación de cirugía artroscópica. La
ausencia de menisco es un factor de riesgo bien identificado de OA de la rodilla y
en este contexto, el trasplante de menisco es un tratamiento ampliamente
difundido que no ha probado retrasar el desarrollo de la OA.
En modelos animales y mediante el empleo de estrategias de ingeniería de tejidos,
se ha tenido éxito en la formación de un tejido similar al del menisco, pero no se
ha demostrado la prevención de OA en tales modelos.
En el Instituto Nacional de Rehabilitación durante el periodo 2002-2005, de un total
de 1309 pacientes sometidos a artroscopía de rodilla, se encontraron 355 con
lesiones meniscales y 804 pacientes con lesiones condrales (43).
Los avances tecnológicos aplicados a la cirugía ortopédica tienen como objetivo
disminuir la discapacidad de estas enfermedades, retrasar su aparición, optimizar
la actividad física realizada por los pacientes y mejorar la calidad de vida. Varios
intentos para limitar los daños ocasionados por lesiones a las estructuras
articulares y las enfermedades degenerativas de las articulaciones, se han
enfocado en las técnicas de reparación del cartílago articular y del fibrocartílago.
En este proyecto de investigación se pretende generar un sustituto de menisco
utilizando un polímero comercial de PGA y celulosa oxidada (BIOFELT®,
Concordia fibers) como andamio interno para las células, aunado a una malla de
celulosa biodegradable (PROCEED® Surgical Mesh, Ethicon) para proporcionar
13

sostén y fijación a la superficie articular y valorar su efecto condroprotector en un
modelo animal de osteoartritis .
14

4. HIPOTESIS
¿Es posible desarrollar un neo-menisco con fibrocondrocitos autólogos y
polímeros biodegradables que sea eficaz y seguro en la prevención de la OA en
un modelo animal?
Un menisco de bioingeniería desarrollado con fibrocondrocitos autólogos en una
matriz biodegradable presentará un daño cartilaginoso menor (10 puntos) que la
meniscectomía de acuerdo a la calificación histológica de OA de Mankin
modificada por Little en un modelo ovino de osteoartritis.
15

5. OBJETIVOS
5.1. OBJETIVO GENERAL:
Desarrollar un menisco con ingeniería de tejidos que sea eficaz y seguro para la
prevención de la OA de rodilla en un modelo animal.
5.2. OBJETIVOS PARTICULARES:
1. Construir un menisco de bioingeniería con fibrocondrocitos autólogos
embebidos en una matriz biodegradable en forma de menisco medial ovino.
2. Implantar un menisco de bioingeniería en la localización anatómica del
menisco medial en un modelo ovino de OA.
3. Trasplantar un menisco homólogo fresco congelado en la localización
anatómica del menisco medial en un modelo ovino de OA.
4. Comparar el grado de daño al cartílago articular macroscópicamente entre
los diferentes grupos experimentales.
5. Comparar el grado de cambios histomorfológicos del cartílago articular entre
los diferentes grupos experimentales.
6. Comparar el tamaño de las fibras de colágena medidas por microscopía
electrónica de transmisión en el tejido cicatricial del grupo de
meniscectomía, el menisco de bioingeniería y trasplante de menisco al
momento del sacrificio.
16

7. Corroborar la localización anatómica de los meniscos, de los implantes y
trasplantes por técnicas de ultrasonido (US) y a través de la evaluación
macroscópica directa.
17

6. MATERIAL Y METODOS
6.1. Tipo de Estudio.
Experimental.
6.2 Variables de estudio:
Las variables dependientes se muestran en la tabla 4.
Eficacia:
Evaluación Macroscópica de Kelly (Cualitativa ordinal 0-4) (tabla 1)
Evaluación Macroscópica de OARSI de osteofitos (Cualitativa ordinal de 0-3)
(tabla 2)
Evaluación histológica de OA modificada de Mankin (Escala Cuantitativa continua
0-27 puntos posibles) (Tabla 3)
Promedio de ancho de fibras de colágena en nm (Escala cuantitativa continua)
Presencia/ausencia de fibrocondrocitos productores de matriz extracelular por
microscopía electrónica (Evaluación cualitativa dicotómica).
Seguridad
Evaluación de la localización anatómica de los implantes y trasplantes.
Localización por US (cualitativa dicotómica)
Localización en observación directa (cualitativa dicotómica)
Variable independiente:
Los cuatro grupos experimentales constituyen la variables independiente, estos
son: grupo control de rodillas no operadas (grupo 1), grupo de meniscectomía
18

(grupo 2); grupo de trasplante de menisco (grupo 3), el grupo de menisco de
bioingeniería (grupo 4).
6.3 Protocolo quirúrgico y manejo de las especies.
Se intervinieron quirúrgicamente 10 ovejas, mayores de 6 años. Se asignaron por
sorteo simple a 4 grupos: las rodillas no operadas fueron tomadas como control
(grupo 1), el grupo de meniscectomía (grupo 2), un grupo de trasplante de
menisco (grupo 3), un grupo de menisco de bioingeniería (grupo 4).
Acorde con el flujograma metodológico (tabla 5), se realizó la meniscectomía
medial de la rodilla derecha de los 3 grupos de tratamiento. Los meniscos del
grupo de meniscectomía se mantuvieron en congelación a -80 grados
centígrados, desde su obtención hasta 1 hr. antes del implante. Los meniscos del
grupo 3 (trasplante de menisco) se emplearon para realizar las pruebas de
adhesión celular al implante. Los meniscos del grupo 3, fueron procesados para
retirar la matriz extracelular y realizar el cultivo tisular y constructo.
A los 2 meses de la meniscectomía se llevó a cabo tanto el trasplante de menisco
como el implante del menisco de bioingeniería.
A los 6 meses de la meniscectomía se sacrificaron los sujetos de estudio con una
sobredosis de pentobarbital acorde con la normas bioéticas establecidas y la
norma oficial mexicana NOM-062-ZOO-1999 (46). Se tomaron muestras de la
superficie osteocartilaginosa femoral y tibial de las rodillas operadas así como de
las no operadas para su estudio.
Se evaluaron clínicamente los sujetos de estudio por veterinarios experimentados
19

en manejo de grandes especies de la facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia
de la UNAM en sus instalaciones de Tres Marías, estado de Morelos Centro de
Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Ovina (CEIEPO). Los
hallazgos se anotaron en el expediente clínico. En caso de presentar datos de
infección después de alguna cirugía, se inició el tratamiento médico con
antibióticos y analgésico y/o desbridamiento quirúrgico. Si algún sujeto de estudio
presentaba dolor no tratable o incapacidad física grave que comprometiera su
bienestar, fue sacrificado.
Todos los procedimientos involucrados en el cuidado y manejo de los animales
fueron efectuados de acuerdo a los requerimientos que en la materia determina la
NOM-062-ZOO-1999 Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso
de animales de laboratorio
6.4 Métodos de laboratorio
6.4.1 Cultivo de células de menisco.
Se colocaron las muestras de menisco en tubos con 15 ml de PBS sin calcio ni
magnesio, suplementado con antibiótico-antimicótico y se mantuvieron en
refrigeración hasta su procesamiento. Se seccionaron con bisturí en fragmentos
de aproximadamente 1 mm 3
, procurando no dejarlas secar. Se mantuvieron en
medio de cultivo [Dulbecos Modified Eagle Medium] DMEM suplementado con
10% de suero bovino fetal inactivado por calor, 100 U/mL de penicilina, 100
ugr/ML de estreptomicina, anfotericina B al 0.1% y ácido ascórbico 30ug/mL.
Todo el procedimiento se realizó en un gabinete de seguridad microbiológica
20

Clase II.
En tubos de 50 ml, se colocaron 10 ml de DMEM 1% antibiótico-antimicótico con
colagenasa Tipo I o II al 0.3%. Los tubos se ajustaron en el Orbital Shaker a 37° C
a 250 rpm durante 4 horas, vigilando el avance en la digestión.
Al finalizar las 4 hrs, de digestión se centrifugaron a 300 x g durante 12 minutos.
Después de la centrifugación con una pipeta Pasteur se absorbió el sobrenadante
cuidando el botón celular y fue resuspendido golpeando gentilmente el tubo
agregando 5 ml de PBS sin Calcio ni Magnesio con 1% antibiótico-antimicótico.
Nuevamente se centrifugó a 300 x g por 12 minutos.
Con una pipeta Pasteur desechamos el sobrenadante y agregaremos 5 ml de
DMEM 10% SBF 1% antibiótico-antimicótico.
Para realizar el conteo celular se utilizó la técnica de azul tripano la cual se lleva a
cabo de la siguiente manera: se agregan 10 μl de suspensión celular y 10 μl del
colorante en una placa de 96 pozos homogeneizando la mezcla. Se agregan 10 μl
de la mezcla a cada uno de los pozos de la cámara de Neubauer. Contando las
células viables y no viables (las células no viables se tiñen con el colorante azul).
El cálculo de la población celular se obtiene de acuerdo a la siguiente fórmula:
(número de células)(Factor de Dilución[2 en este caso]) x (ml de la solución
celular) = x104.
Al finalizar el procedimiento de extracción las células se sembraron en cajas de
cultivo de tipo T (Falcon BD, Biosciences) de acuerdo con el siguiente criterio: de
250 – 500 mil células recuperadas en cajas T25 con 5 ml de medio; de 500 – 1.5
millones de células en cajas T75 con 10 ml de medio; mas de 1.5 millones de
21

células en cajas T175 con 20 ml de medio. Las células se incubaron a 37°C y 5%
CO2, cambiando el medio de cultivo cada 2 días.
6.4.2 Pasaje celular de menisco
Cuando los cultivos en monocapa llegaron a confluencia después de 7 a 10 días,
se cosecharon las células de la siguiente manera: se aspiró el medio con pipeta
Pasteur de la caja de cultivo y se agregó tripsina-EDTA y esperamos 5 minutos
exactamente mientras se monitorea el desprendimiento de la capa celular. Ya
desprendida la monocapa, se colocó en tubos de 50 ml y se agrega 5 ml de
PBS/albúmina al 2.5% y se centrífuga a 300 x g por 6 minutos.
6.4.3 Construcción del menisco de bioingeniería.
Se sembraron alrededor de 10 millones de células por constructo meniscal, y se
utilizaron dos polímeros para generar el sustituto de menisco, el primero que forma
el centro del mismo y se constituye de PGA y el segundo, envuelve al primero y
se compone de celulosa oxidada.
El constructo de PGA se cubrió con la celulosa oxidada y se le dio forma y medida
dependiendo de cada caso.
6.5 Procedimiento anestésico.
Los sujetos de estudio se indujeron con Xilazina intramuscular a 0.8mg x kg, y se
realizó una sedación leve con la infusión intravenosa de 5 mgr x kg de Ketamina.
Acto seguido, se colocó a la oveja en decúbito lateral y se realizó la preparación
de aproximadamente 20 cm de la región lumbar en donde se quitó la lana, se hizo
22

un lavado con isodine espuma y alcohol y se prepararon campos estériles para
realizar una punción espinal con una aguja espinal 22 G. Una vez corroborado la
ubicación epidural se procedió a infiltrar lentamente 3 cc de lidocaína simple al
2%. Esto garantizó tres horas de bloqueo.
6.6 Procedimientos quirúrgicos.
Meniscectomía. Después del procedimiento anestésico, se colocó a la oveja en
decúbito dorsal con las extremidades fijas con vendas elásticas protegidas con
algodón para evitar puntos de presión. La babilla derecha fue rasurada para
quitarle la lana. Se realizó antisepsia de la rodilla con espuma de Iodo povidona y
alcohol. Se colocaron campos estériles y se realizó una incisión longitudinal de la
babilla de 8-10 cm de longitud, se disecó por planos, se realizó una artrotomía en
‘J’ para exponer el menisco. Se disecó de la cápsula articular con cuidado de no
lesionarla. Se cerraron los planos con sutura de PGA (Vicryl 1-0) y la piel con
sutura de nylon (Dermalon 2-0). Se aplicó sobre la superficie cutánea azul de
metileno como antiséptico y gasas estériles fijas a la piel con sutura para cubrir la
herida. Se retiraron dichas gasas a los 3 días, para permitir la exposición de la
herida quirúrgica al medio ambiente.
6.6.1 Técnica quirúrgica del trasplante de menisco.
Se aplicó el tratamiento (trasplante de menisco o menisco de bioingeniería)
acorde al grupo asignado a los 2 meses de la meniscectomía. La babilla derecha
fue rasurada para quitarle la lana y puntos de nylon de la meniscectomía. Se
realizó antisepsia de la rodilla con espuma de Iodo povidona y alcohol. Se
colocaron campos estériles y se realizó una incisión longitudinal de la babilla de 8-
23

10 cm de longitud, se disecó por planos, se realizó una artrotomía en ‘J’ para
exponer el compartimiento femoro-tibial medial. Una vez expuesta la superficie
articular de la tibia se hicieron túneles transóseos de manera anterógrada con una
broca de 2.5 mm. Dichos túneles se dirigieron a la región anatómica de la
inserción de los cuernos anterior y posterior del menisco. Se tuvo cuidado de
labrar los túneles de manera independiente en una situación superior a la
inserción del pes anserinus ipsilateral y dejando 3 mm al menos entre cada túnel.
Lograda la perforación de los túneles se transportaron las suturas guías del
trasplante de menisco o del menisco de bioingeniería a través de los túneles. Se
fijó la periferia del menisco o menisco de bioingeniería con puntos verticales
independientes y las suturas guía fueron anudadas sin tensión excesiva. Se
cerraron los planos con sutura de PGA (Vicryl 1-0) y la piel con sutura de Nylon
(Dermalon 2-0). Se colocó azul de metileno como antiséptico y gasas estériles
fijas a la piel con sutura para cubrir la herida. Se retiraron dichas gasas a los 3
días, para permitir la exposición de la herida al medio ambiente.
La evolución clínica fue registrada durante 6 semanas, se realizó US articular de
ambas rodillas y el sacrificio fue realizado con una dosis letal de pentobarbital para
la toma de muestras a los 6 meses de la meniscectomía. Después del sacrificio
de las ovejas se tomaron fotografías de las superficies articulares para las
evaluaciones macroscópicas.
Evaluaciones del cartílago articular:
a. Evaluación macroscópica de Kelly (Tabla 1) (44).
b. Evaluación macroscópica de OARSI para osteofitos (Tabla 2) (45).
24

c. Calificación histológica modificada de Mankin de OA (Tabla 3) (40).
6.7 Histología.
Los tejidos osteocartilaginosos fueron fijados en formol amortiguado para su
procesamiento y posterior descalcificación y tinción con safranina O y azul alciano,
para la evaluación macroscópica e histológica. Dicha evaluación fue hecha por un
patólogo independiente entrenado en patología articular.
6.8 Ultrasonido
A través de un equipo Siemens Sonoline Antares® y un transductor de 7 a 13 MHz
en forma de “palo de hockey” con una huella de 1.5 cms de longitud se adquirieron
las imágenes ecográficas en modo B con escala de grises ajustando la frecuencia
del transductor a la máxima permitida por el equipo. La evaluación sonográfica se
realizó con el sujeto de experimentación anestesiado con la babilla en flexión de
110°, se localizó la interlínea articular y mediante maniobras de “punta-tacón” se
determinó la presencia de tejido meniscal entre el fémur y la tibia. La evaluación
se realizó en ambas babillas y las imágenes se adquirieron en planos ortogonales.
Las imágenes representativas de la situación se seleccionaron y se guardaron en
la memoria del equipo y finalmente se almacenaron en el sistema local PACS
(Picture Archiving and Communication System) para ser evaluadas y revisadas
posteriormente.
La presencia de material intraarticular hiperecóico ubicado entre las superficies
articulares femorotibiales mediales definió la ubicación anatómica del menisco
25

nativo, del trasplante meniscal y del menisco de bioingeniería.
La presencia de otras alteraciones articulares como hipertrofia sinovial, derrame
sinovial se diagnosticaron de acuerdo a las definiciones para patología
ultrasonográfica de OMERACT (41).
Evaluación de la localización anatómica de los implantes y trasplantes.
. US y evaluación macroscópica directa.
6.9 Evaluación del menisco con microscopia electrónica de transmisión
(menisco nativo, cicatriz de meniscectomía, menisco de bioingeniería y trasplante
de menisco).
1. Presencia/Ausencia de fibrocondrocitos productores de matriz
extracelular y fibras de colágena.
2. Medición del ancho de las fibras de colágena y comparación entre los
diferentes grupos.
6.10 Cálculo de Tamaño de Muestra
Basado en el trabajo de Young [39] y colaboradores, de donde se tomaron los
siguientes valores:
- Tamaño del efecto (d)= 5 puntos
- Desviación Estándar (s): 1.8
Asumimos un tamaño del efecto en el grupo experimental 4 con los siguientes
valores:
-zα = 1.96 α = 0.05
- zβ = 1.282 β = 0.20
26

Despejando:
2 (1.8) 2 (1.96 + 1.282) 2 / (5) 2
aprox = 3 sujetos por grupo
- por conveniencia usamos 4 ovejas por grupo experimental.
6.11 Análisis Estadístico. Se realizó estadística descriptiva y expresamos los
valores en mediana e intervalo intercuartilar para las variables cuantitativas y
en frecuencias relativas las cualitativas. Dado que la muestra es pequeña,
utilizamos estadística no paramétrica. Las comparaciones entre grupos de las
variables cuantitativas las analizamos con Kruskal-Wallis y el ajuste de
Bonferroni para el análisis post-hoc. El valor de p significativo fue ajustado
entre el numero de grupos evaluados para las comparaciones de OA
histológica (modificada de Mankin) p = 0.05/4 = 0.0125 y para el ancho de
las fibras de colágena 0.005/3 = 0.017
27

7. RESULTADOS
7.1 Población de estudio.
Las características generales de la población de estudio se muestran en la tabla 6.
Las babillas de las ovejas incluidas se dividieron en 4 grupos experimentales:
controles no operados (grupo 1); meniscectomía medial (grupo 2), trasplante de
menisco (grupo 3) y menisco de bioingeniería (grupo 4).
7.2 Microscopia electrónica.
Las muestras de tejido de los controles, meniscectomía, trasplante de menisco, y
menisco de bioingeniería fueron evaluadas por microscopia electrónica de
transmisión (Figura 1 y Tabla 7). Mediante calibradores se realizó la medición del
ancho de las fibras de colágena (mediana e intervalo intercuartilar): grupo control
63.9 nm (51.2-69.6); grupo meniscectomía, las fibras de colágena resultaron mas
delgadas 27.8 nm (22.6-33.0) y fibroblastos alargados que representan tejido
cicatricial; la degeneración y desorganización de las fibras de colágena en los
trasplantes de menisco impidió que se pudieran hacer mediciones; y en el grupo
de menisco de bioingeniería flas fibras de colágena resultaron adelgazadas y de
pequeño tamaño 30.23 nm (rango 26.1-32.6), adicionalmente en este grupo se
observo la presencia de fibrocondrocitos . La diferencia entre los controles y los
grupos de intervención fue estadísticamente significativa (p

Figura 1.
Evaluación por microscopía electrónica de transmisión
Fibras De Colágena
7.3 Evaluación del cartílago articular.
7.3.1.Evaluación macroscópica.
Células
Grupo 1 Controles
Grupo 2 Meniscectomía
Grupo 3 Trasplante de
Menisco
Grupo 4 Menisco de
Bioingeniería
En el grupo 1 Controles. Observamos fibras de colágena con el ancho de referencia
y un fibrocondrocito maduro.
En el grupo 2 Meniscectomía. Se observan fibras de colágena de menor calibre y
fibroblastos alargados.
En el grupo 3 Trasplante de menisco. Se puede apreciar fibras de colágena con
degeneración hialina y desarregladas y fibrocondrocitos escasos, pequeños y
fragmentados.
En el grupo 4 Menisco de bioingeniería. Las fibras de colágena son pequeñas y
delgadas, y presentan un arreglo heterogéneo; se puede observar una célula con
abundante reticulo endoplasmico, complejos de Golgi, y pocas mitocondrias y con
matriz extracelular inmadura a su alrededor, que sugiere ser un fibrocondrocito.
La meniscectomía medial resultó en alteraciones morfoestructurales
macroscópicas del cartílago articular consistentes con OA y que se manifestaron
por irregularidades de la superficie, fibrilación y erosión del cartílago articular y
29

adicionalmente por la presencia de osteofitosis en los márgenes articulares de la
meseta tibiales. Las anormalidades macroscópicas estuvieron presentes en los
tres grupos y se manifestaron por la presencia de fibrilación de la superficie
condral y osteofitosis, hecho que contrasta significativamente con el grupo control,
en el que no se encontraron alteraciones osteocartilaginosas macroscópicas. El
cartílago articular de las mesetas tibiales del grupo control resultó liso, sin
irregularidades, áreas de erosión o adelgazamiento (Figura 2 y Tabla 8).
Figura 2.
Grupo 1 Controles
Grupo 2 Meniscectomía
Grupo 3 Trasplante
de Menisco
Grupo 4 Menisco
de Bioingeniería
Evaluación macroscópica del cartílago articular.
Mesetas tibiales de los grupos de estudio.
Grupo 1. La superficie articular se observa lisa, sin osteofitos ni
irregularidades.
Grupo 2. Observamos fibrilación leve, un caso con artrofibrosis y tejido
fibroso en la periferia.
Grupo 3. Se observan remanentes de la sutura en de los túneles óseos,
osteofitos de 2 a 4 mm. y fibrilación.
Grupo 4. Observamos un caso con artrofibrosis, formación de osteofitos
de tamaño moderado y fibrilación de la superficie.
30

7.3.2 Evaluación Histológica
Los cambios histomorfológicos del cartílago articular evaluados mediante la
clasificación de OA modificada de Mankin (figura 3 y gráfica 1) se comportaron de
la manera siguiente: Grupo control 1.5 (0.3-5); Grupo Meniscectomía 15.5 (13.3-
18.5); Grupo Trasplante de Menisco 12.5 (10.5-14.5); Grupo Menisco de
Bioingeniería 23 (16.5-25).
Como se muestra en la gráfica 1. En todos los grupos en los que se asigno una
maniobra quirúrgica, encontramos un mayor daño estructural del cartílago articular
comparado con el grupo de contraste (p

Figura 3.
Evaluación Histológica del cartílago articular.
Grupo 1 Controles
Grupo 2 Meniscectomía
Grupo 3 Trasplante de
Menisco
Grupo 4 Menisco de
Bioingeniería
Micrografías de superficie articular de meseta tibial medial con Safranina O
/Verde rápido.
Grupo 1. Observamos tinción intensa y uniforme de la matriz extracelular.
Observe la integridad de la transición de la capa de cartílago calcificado y
hueso subcondral.
Grupo 2. Se observan irregularidades en la tinción, griestas y algunos
clones celulares.
Grupo 3. Se observan irregularidades en la tinción, grietas, clones celulares.
Grupo 4. Se observan alteraciones severas de la tinción, grietas que llegan
al hueso subcondral y transgrede el frente calcificado. Adicionalmente se
observa abundante tejido cicatricial
32

Grafica 1. Evaluación histológica del daño del cartílago articular
7.4 Evaluación Ultrasonográfica
Daño histológico del cartílago articular.
Diagrama de cajas y bigotes que muestra la diferencia
entre los grupos experimentales y los controles.
Además, se observa una diferencia significativa entre el
grado daño histológico del grupo de menisco de
bioingeniería y el grupo de trasplante de menisco.
En el grupo control encontramos el menisco nativo en posición normal en todas las
rodillas y con características sonográficas normales. Como era esperado, no
33

encontramos evidencia sonográfica de menisco (estructura ecogénica de forma
triangular en la interlinea articular femoro-tibial) en el grupo de meniscectomía, y
constatamos a través de ésta técnica de imagen que en todos los sujetos de
estudio, tanto del grupo de trasplantes como de meniscos de bioingeniería la
estructura trasplantada o implantada estaba ubicada en el sitio anatómico
esperado, esto es entre el cóndilo femoral y el platillo tibial medial
En todos los grupos operados, encontramos evidencia sonográfica de moderada
sinovitis, manifestada por la presencia ya sea de derrame o hipertrofia sinovial y
señal Doppler de poder positiva.
En todos los sujetos de estudio, tanto los trasplantes como los implantes se
mantuvieron en su posición anatómica. La correcta ubicación anatómica de los
mismos se corroboró visualmente a través de la artrotomía postmortem.
7.5 Eventos adversos.
En un caso de meniscectomía y en otro de menisco de bioingeniería encontramos
evidencia macroscópica de artrofibrosis manifestada por la presencia de un
proceso fibrocicatricial que involucraba a diferentes estructuras articulares y que
no se manifestó clínicamente.
34

8. DISCUSION
En este estudio demostramos la capacidad de formar un tejido con características
morfológicas similares al tejido meniscal a través de técnicas de ingeniería de
tejidos sobre una plataforma de materiales biosintéticos y biodegradables.
De un modelo animal obtuvimos fibrocondrocitos, los proliferamos e insertamos en
un polímero biocompatible de PGA y celulosa oxidada. Documentamos por medio
de microscopía electrónica de transmisión la presencia en el menisco de
bioingeniería de una población celular morfológicamente similar a fibrocondrocitos,
adicionalmente la presencia de fibras de colágena, y matriz extracelular. A
diferencia del menisco trasplantado y del tejido cicatricial de reparación presente
en el grupo de meniscectomía, los rasgos ultraestructurales y morfológicos del
neotejido mostraron características similares al tejido meniscal nativo.
Se ha reportado una perdida de la permeabilidad meniscal y alteraciones
vasculares como causantes de la degeneración y desarreglo morfoestructural de
las fibras de colágena en los meniscos congelados (48). Estos observaciones son
similares a las encontradas por nosotros en el grupo de trasplante de menisco
fresco congelado, en el cual se perdió la periodicidad de las bandas de colágena,
hubo mayor grado de disrupción, desarreglo conformacional y edema. Por otro
lado, nuestros resultados muestran que también hay degeneración hialina,
alteración en la disposición de las fibrillas y una menor densidad de
fibrocondrocitos.
35

En el menisco de bioingeniería encontramos abundantes células parecidas a
fibrocondrocitos, ya que contienen cuantioso retículo endoplásmico, complejos de
Golgi, pocas mitocondrias, y producción de matriz extracelular. Esto contrasta con
la baja densidad celular presente en los meniscos trasplantados. En otro estudio,
en un grupo de 28 pacientes se tomaron biopsias de meniscos trasplantados a 16
meses de seguimiento. Las muestras estudiadas mostraron una repoblación
incompleta de células viables del huésped, ya que solo se encontraron en las
capas superficiales y no en el centro del menisco trasplantado. El fenotipo de
dichas células orientaba al origen fibroblástico y sinovial de la cápsula adyacente
(48).
El tratamiento y preservación de la función del menisco después de una lesión
representa un reto clínico que aún no se logra vencer, ya que hoy en día no
contamos con un tratamiento que reemplace las características biomecánicas del
menisco, que evite el síndrome postmeniscectomía y que a prevenga el desgaste
cartilaginoso, por lo que a través de técnicas de ingeniería de tejidos buscamos
una alternativa terapéutica.
La idoneidad de un plataforma de bioingeniería está dada por su
biocompatibilidad, estabilidad mecánica, reproducibilidad y disponibilidad (47). Uno
de los problemas que presenta la adición de células a un andamio meniscal es la
dificultad de que estas permanezcan en la zona el tiempo adecuado para ejercer
su función. El andamio elegido es suave, flexible, biocompatible y de alta
porosidad (>97%), con poros interconectados en tres dimensiones, lo que
favoreció la adecuada densidad celular encontrada. Sin embargo, las fibras de
36

colágena de los implantes de bioingeniería fueron de menor calibre, con una
disposición desordenada y menos compactas que las del menisco nativo. Esta
condición de ultra-arquitectura, pudo haber tenido un efecto negativo en las
propiedades biomecánicas del tejido neo formado, y de esta manera repercutir en
la pobre protección al cartílago articular encontrada en el grupo de menisco de
bioingeniería.
Para evaluar en términos de eficacia el efecto condroprotector de los diferentes
tratamientos quirúrgicos utilizamos las recomendaciones de OARSI (45). En ellas,
se sugiere evaluar la apariencia macroscópica de toda la superficie tibial cubierta
por cartílago, la presencia de osteofitos en la periferia, y los cambios
histomorfológicos característicos de la OA. En general, en nuestro estudio los tres
grupos de tratamiento mostraron una pobre condroprotección, principalmente en
las regiones periféricas de la superficie articular estudiada. En el trabajo de Kelly
se reportaron resultados similares. En un modelo ovino de trasplante de menisco
fresco congelado encontraron mayor daño en la zona periférica del cartílago
articular, y establecieron que el centro de la articulación fue parcialmente
condroprotegido (50).
En un estudio en donde compararon meniscos frescos congelados tomados de
manera estéril con meniscos frescos congelados esterilizados, encontraron que
las fuerzas de compresión disminuyeron a los 4 meses de ser trasplantados y que
eran más débiles que el menisco nativo. Además, la celularidad de ambos tipos
de injerto fue inferior que la de los meniscos nativos, y la severidad del daño
condral de las rodillas trasplantadas fue indistinguible de las articulaciones con
37

meniscectomía (51).
En nuestra técnica quirúrgica preferimos utilizar el compartimento medial por
diversas razones: posee una superficie articular de menor tamaño, la tibia no es
tan convexa, y principalmente no se lesionan los tendones extensor largo de los
dedos y poplíteo, en comparación al compartimento lateral. Se usaron túneles
transóseos para fijar las inserciones anterior y posterior de los meniscos. Esta
técnica tiene ventajas mecánicas y asegura la permanencia del implante en
posición anatómica. Este hecho fue corroborado en nuestro estudio mediante la
evaluación ultrasonográfica y por visualización directa de la posición del implante
y/o trasplante.
Se presentaron complicaciones como atrofibrosis en dos sujetos de investigación,
uno en el grupo de meniscectomía y otro en el grupo de menisco de bioingeniería.
Atribuimos las complicaciones a la excesiva tensión generada sobre las suturas
que reinsertaban el vasto medio oblicuo (VMO) y ligamento patelofemoral medial.
El abordaje medial requiere incidir el tendón del VMO y la cápsula articular medial
(que incluye al ligamento patelofemoral medial). Al término del estudio en las
ovejas con artrofibrosis observamos abundante tejido cicatricial en esta región.
Para proyectos futuros, repararemos este complejo medial a la patela con suturas
de polietileno de alta densidad (Orthocord, Fiberwire 2-0), que brindan una mayor
resistencia.
Los resultados obtenidos en este trabajo son alentadores aunque de ninguna
manera se pueden considerar como óptimos. Como principal fortaleza y
relacionada con la eficacia, podemos resaltar el hecho de que se logró obtener un
38

tejido similar al menisco nativo a partir de una plataforma de materiales
biosintéticos y biodegradables que fue sembrada con fibrocondrocitos autólogos
que consiguieron mantenerse viables, poblar el andamio poroso y mantenerse
funcionalmente activos a lo largo del estudio. Como principal debilidad tenemos
que el menisco de bioingeniería no fue capaz de prevenir el daño
osteocartilaginoso propio de la OA.
Otra debilidad radica en la falta de caracterización de los cultivos celulares, en
este estudio solo se cuantificaron manualmente las células que provenían de los
meniscos tomados y se evaluaron los fenotipos morfológicos en cultivo. Para
estudios ulteriores, proponemos evaluar el fenotipo con técnicas de
inmunohistoquímica, ELISA y PCR. La seguridad del modelo experimental se
obtuvo al demostrar que los implantes y trasplantes se mantuvieron en la posición
anatómica a lo largo del estudio.
9. DISCUSION
En conclusión, la plataforma de PGA y celulosa oxidada sembrada con
fibrocondrocitos autólogos es eficaz para producir un tejido similar al menisco
nativo. Las maniobras quirúrgicas fueron seguras al confirmarse la fijación y
permanencia en posicion anatómica de los meniscos trasplantados o implantados.
Sin embargo, no observamos un efecto de protección al cartílago articular con
estos tratamientos después de la meniscectomía.
39

10. PERSPECTIVAS
Este estudio sienta las bases experimentales suficientes para continuar con la
búsqueda de un modelo de bioprotesis que sea eficaz y segura para reemplazar el
menisco nativo dañado con una bioprotesis.
En un futuro continuaremos los trabajos experimentales ahora en un proyecto en
el que la plataforma o andamio sea construida con materiales sintéticos
bioabsorbibles y sembrada con células troncales autólogas con la finalidad de
evitar el dolor del síndrome postmeniscectomía y que sobre todo sea eficaz en la
protección y prevención del daño al cartílago articular y de este modo prevenir el
desarrollo de OA
Nuestros estudios han mostrado que las células meniscales cultivadas en
polímeros de PGA tienen la capacidad de formar un tejido similar al menisco
cultivado en un biorreactor, pero la utilidad clínica y de prevención de osteoartritis
no ha sido probada. Más aún, un inconveniente de los cultivos celulares de
células meniscales es que requiere dos etapas de cirugía para la aplicación de un
implante, aumentando el riesgo y los
costos.
La sustitución de tejido de menisco con células troncales mesenquimales
autólogas es un tema de intenso estudio. Ofrece ventajas logísticas, ya que
permite tomar células fuera de quirófano, cultivarlas, proliferarlas y caracterizarlas
para situarlas en un implante tridimensional en forma de menisco e implantarlas en
40

un solo tiempo. Nuestro grupo ha tenido éxito previamente en la formación de
tejido similar al menisco en un modelo ovino de OA con células autólogas. Pero el
tejido obtenido de biopsias directas de células meniscales requiere al menos 4
semanas de cultivo, haciendo logísticamente difícil, caro y riesgoso el uso en el
paciente humano. Así, las células troncales mesenquimales autólogas parecen
ser una respuesta biológicamente plausible en la sustitución de menisco.
41

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47

2009;467:1868-76
48

12. ANEXOS
Tabla 1. Clasificación de Kelly para la evaluación de cambios macroscópicos
del cartílago
GRADO Daño articular
0 Normal
1 Irregularidades superficiales
2 Fibrilación y fisuras
3 Erosiones pequeñas hasta el hueso subcondral (5mm de diámetro)
Kelly BT, Potter Hg, Deng XH, Pearle AD, Tuner AS, Warren RF, et al. Meniscal
allograft transplantation in the sheep knee: evaluation of chondroprotective effects.
Am J Sports med 2006; 34(9):1464-77.
Tabla 2. Clasificación de OARSI de osteofitos
GRADO Desarrollo de Osteofitos
0 Normal
1 Desarrollo leve de osteofitos (50% del
margen articular)
Little CB, Smith MM Cake MA Read RA Murphy MJ Barr FP. The OARSI
histopathology initiative - recommendations for histological assessments of
osteoarthritis in sheep and goats. Osteoarthritis and Cartilage 2010; 18: S80-S92.
(45)
49

Tabla 3. Calificación histológica modificada de Mankin
GRADO Desarrollo de Osteofitos
A – Estructura - Normal 0
- Irregularidades de superficie leves 1
- Irregularidades de superficie moderadas 2
- Irregularidades de superficie severas 3
- Grietas a la zona de transición (1/3 de profundidad) 4
- Grietas a la zona radial (2/3) 5
- Grietas a la zona calcificada (3/3 de profundidad) 6
- Fibrilación y/o pérdida de la zona de transición (1/3 de
profundidad) 7
- Fibrilación y/o pérdida de la zona radial (2/3 de
profundidad) 8
- Fibrilación y/o pérdida de la zona calcificada (3/3 de
profundidad) 9
B – Densidad de
condrocitos
C- Clonación
celular
D- Tinción
interterritorial
E- Transición
cartílago calcificado
/ hueso subcondral
- Fibrilación y/o pérdida del hueso subcondral 10
- Normal 0
- Aumento o disminución leve 1
- Disminución moderada 2
- Disminución grave 3
- Sin células 4
- Normal 0
- Algunos dobletes 2
- Muchos dobletes 2
- Dobletes y tripletes 3
- Múltiples nidos celulares 4.
- Normal 0
- Pérdida de tinción de la zona tangencial (1/3) 1
- Pérdida de tinción en la zona de transición (2/3) 2
- Pérdida de tinción en la zona radial (3/3) 3
- Sin tinción 4
- Hueso subcondral intacto + único “tide mark” 0
- Hueso subcondral intacto + “tide mark” múltiple 1
- Vasos sanguíneos que entran a la zona calcificada 2
- “Tide mark” atravesada por vasos sanguíneos 3.
Little C, Smith S, Ghosh P, Bellenger C: Histomorphological and
immunohistochemical evaluation of joint changes in a model of osteoarthritis
induced by lateral meniscectomy in sheep. J Rheumatol. 1997; 24:2199-209 (40).
50

Tabla 4. Variables dependientes
Variable Tipo de variable Definición conceptual
Evaluación macroscópica
de Kelly
Evaluación macroscópica
de OARSI de osteofitos
Evaluación histológica de
OA modificada de Mankin
Cualitativa ordinal
0-4
Cualitativa ordinal
0-3
Escala cuantitativa
0-27
Ultrasonido meniscal Cualitativa dicotómica
Sí o no
Evaluación cualitativa del
cartílago articular bajo
visión directa
Evaluación cualitativa del
cartílago articular bajo
visión directa
Evaluación histológica de
la estructura, celularidad,
características tintoriales,
y clonación de
condrocitos
Evalúa la ubicación
anatómica del
implante/trasplante de
menisco
Microscopía electrónica Cuantitativa continua Determina el promedio
del grosor de las fibras de
los meniscos estudiados.
51

Tabla 5. Flujograma metodológico:
52

Tabla 6. Descripción de los sujetos de estudio.
Ovejas
Suffolk
(n=10)
Peso
(Kg.)
Edad
(años)
Controles
Grupo 1
4
79.5
8.0
Meniscectomía
Grupo 2
4
80
8.5
Tabla 7. Microscopía Electrónica.
Ancho Fibras de
Colágena
Mediana nm
(Intervalo intercuartilar)
Presencia de
Fibrocondrocitos
Controles
Grupo 1
63.9 nm
(51.2-69.6)
Si
Trasplante
de Menisco
Grupo 3
2
80.5
8.0
Meniscectomía
Grupo 2
27.8 nm
(22.6-33.0)
No
Trasplante
Menisco
Grupo 3
NE
Menisco de
Bioingeniería
Grupo 4
4
80.25
8.5
Menisco
Bioingeniería
Grupo 4
30.23 nm
(26.1-32.6)
p
NS
NS
NS
P

Evaluación
Cartílago
Mediana (Intervalo
intercuartilar)
Tabla 8. Evaluación macroscópica cartílago y osteofitos (OARSI).
Controles
Grupo 1
0
Meniscectomía
Grupo 2
2.0 (1.25-3.5)
Trasplante
Menisco
Grupo 3
3 (3-3)
Menisco
Bioingeniería
Grupo 4
2.0(1.25-3.5)
P
0.03
Evaluación
osteofitos
Mediana (Intervalo
intercuartilar)
0
1.0 (1-2.5) 2.5 (2-3) 1.0(1-2.5) 0.02
* Hubo diferencia estadísticamente significativa de todos los grupos cuando se
compararon con el grupo control.
54

Derrame
sinovial (%)
Hipertrofia
sinovial
Localización
anatómica
(% éxito)
Tabla 9. Evaluación ultrasonográfica
Meniscectomía
n=4
Trasplante
de
Menisco
n=2.
Menisco de
Bioingeniería
n=4
Rodillas
no
operadas
n=10
1(25%) 1(50%) 1(25%) 0(0%)
1(25%) 1(50%) 1(25%) 0(0%)
0
2 (100%)
4 (100%)
10(100%)
55

HOJA DE TRABAJO
PROYECTO: EFECTO CONDROPROTECTOR DE UN MENISCO DE
BIOINGENIERÍA BIOMÉDICA DE UN MODELO OVINO DE OSTEOARTROSIS
No. Borrego: _______________ Fecha: __________________________
Rodilla intervenida: _______________ Sitio de intervención:
_______________
FASE I: EVALUACIÓN INICIAL
Menisco
Lesión
Menisco de bioingeniería
Menisectomía
Derrame
Hipertrofia sinovial
Rodilla derecha Rodilla Izquierda
Presencia/ausencia Presencia/ausencia
Señal Doppler Grado Grado
Elastografía
Osteofitosis
Cartílago Homogeneo/Heterogeneo Homogeneo/Heterogeneo
Observaciones
FASE II: PUNCIÓN ARTICULAR Y ANÁLISIS DE LIQUIDO SINOVIAL
Rodilla derecha
Rodilla izquierda
Punción
realizada (si/no)
FASE III: ESTUDIO CARTÍLAGO HIALINO
Rodilla
derecha
Rodilla
izquierda
Grosor
(mm)
Cantidad LS
extraída
Ecogenicidad Superficie Elastografía
Resultado del análisis
Observaciones
adicionales
56