Inseminación artificial - Albeitar

14Inseminación artificialLA CRIOPRESERVACIÓNDEL SEMEN PORCINOEN ESTE ARTÍCULO SE PRETENDE ANALIZAR SUCINTAMENTELA LABOR QUE UN EQUIPO DE INVESTIGACIÓN MULTICÉN-TRICO ESTÁ REALIZANDO, DESDE DIVERSAS PERSPECTIVAS,EN EL CAMPO DEL SEMEN CONGELADO EN PORCINO.ESPERAMOS QUEEL RESULTADO DEESTA INVESTIGACIÓNSEA POSITIVO, CONLO QUE PODRÍAMOSPREDECIR LACAPACIDAD DECRIORRESISTENCIADE LOS EYACULADOS.Nº de primeras IA30.00025.00020.00015.00010.0005.0000Domínguez, J.C.; 1 Cisale, H.;2Kirkwood, R.; 1 Breininger, E.;3Gonzalez, R.; Tejerina, F.; 3 Alegre, B.;Alegre, E.; 3 Peláez, J.; García, J.C.;Bernal, S.; Cárdenas, S.; Cordova, C.A.;3Abad, M.; 3 Abad, F.; 2 Manjarin, R.y 3 Martín, D.Facultad de Veterinaria de la Universidadde León (jcdomt@unileon.es)1Facultad de Medicina Veterinaria.Universidad de Buenos Aires (Argentina)2Large Animal Clinical Sciences.Michigan State University (USA)3Centro Tecnológico de InseminaciónArtificial (CENTROTEC)La criopreservación espermática es unabiotecnología de gran trascendencia, todavez que tiene un papel relevante en la conservacióny difusión de recursos genéticos.Sin embargo, en la especie porcina no hatenido éxito su utilización debido a la incapacidadde obtener resultados comparablesa los del semen fresco o conservadomediante refrigeración a 15 ºC (Jonhson etal., 2000). El uso de semen congelado eneste sector representa apenas el 0,2% deltotal de inseminaciones realizadas en elmundo (gráfica); su utilidad ha quedadorestringida puntualmente a la producciónen pureza de núcleos de selección, bancosgenéticos y transporte internacional (Almlidy Hofmo,1996), perdiéndose la grandisponibilidad espacio/temporal que ofreceel semen congelado.EVOLUCIÓN ANUAL DEL NÚMERO DE PRIMERAS IAEN EL MUNDO CON SEMEN PORCINO CONGELADO12.000197726.0007.000 5.0001985 1998 2007AñoLa tecnología de crioconservación incluye seis etapasimportantes:1. Dilución seminal.2. Enfriamiento de la suspensión espermática.3. Adición del agente crioprotector y envasado.4. Congelación.5. Almacenamiento en envase criogénico.6. Descongelación y aplicación a la hembra.El diseño de cada una de estas fases debe ir enfocado aproducir el menor daño posible sobre las estructuras yel metabolismo del espermatozoide, siendo de especialimportancia la función y arquitectura de la membranaplasmática. La inadecuada adaptación a las etapas citadasanteriormente, así como los cambios que va asufrir la célula durante tan delicado proceso, son responsablesde daños o agresiones, que suponen la pérdidade la capacidad del espermatozoide para llevar acabo sus funciones con normalidad (Watson, 1995;Gao et al., 1997). No obstante, se considera que laadición del agente crioprotector (Watson, 2001) y lasetapas de enfriamiento, congelación y descongelaciónCONGELACIÓN DE SEMEN DE PORCINOOtras causas de la baja utilización delsemen congelado porcino son:• Alto coste, con un alto número deespermatozoides por dosis y un manejocomplicado (Bolarin et al., 2006).• Excesiva variabilidad de la congelabilidadentre razas, individuos y eyaculados.• Imprecisión de los criterios de valoracióndel semen criopreservado en relacióna su fertilidad.• Precapacitación y disminución de lavida útil espermática.• Celo excesivamente largo de la cerda yperiodo prolongado de ovulaciones.A pesar de este panorama desalentador,la investigación en el campo de la crioconservacióndel semen porcino no hacesado, intentando mejorar los resultadosde fertilidad y prolificidad. Nuestro grupode investigación aborda, entre otros, lossiguientes aspectos: la optimización de losprotocolos de congelación; la mejora dela calidad seminal y capacidad fecundantemediante diversas técnicas (aditivos,antioxidantes, plasma seminal, etc.); eldesarrollo de test de criorresistencia y termorresistenciaespermática que prediganla congelabilidad; el estudio y evaluaciónobjetiva de las lesiones de capacidad funcionalespermática mediante técnicas devisión artificial (sistemas CASA-ASMA) yla inducción y sincronización de ovulacionestras el destete de la cerda.EFECTOS DE LACRIOPRESERVACIÓN SOBRELA FUNCIONALIDAD YESTRUCTURA ESPERMÁTICAA continuación se describen los cincoefectos de la criopreservación sobre lafuncionalidad y estructura espermática.ALTERACIONES EN LASMEMBRANAS CELULARESEl plasmalema (membrana plasmática) esla estructura espermática (figura 1) queresulta más severamente dañada (Parks,(Watson, 1990) son las principales fuentes de dañosobre las células en el conjunto del proceso.De todos los protocolos descritos de congelación,sólo han sido utilizados intensamente a nivel comerciallos de Pursel y Johnson, y de Westendorf et al.(Johnson, 1985). De 1985 a esta parte se ha desarrolladoun gran trabajo experimental para establecerlas condiciones óptimas de congelación y descongelacióny hacer más práctico el uso de semen,pero siempre tomando como base los dos protocolosanteriormente citados.El protocolo de congelación utilizado por nuestro equipode investigación es el denominado optimizado deBwanga et al. (1990), basado en los siguientes pasos:• Concentración seminal por centrifugación.• Diluyente de refrigeración con yema de huevo.• Diluyente de congelación con glicerol.• Envasado en minipajuelas de 0,25 ml.• Régimen trifásico de congelación desde 6 ºC hasta–100 ºC, utilizando un congelador de N 2 líquido programablecon control del descenso de temperatura.1997), aunque la membrana acrosómicaexterna y las membranas de la mitocondriatambién se ven afectadas (Watson, 1995).Estas alteraciones estructurales provocanpérdida de enzimas intracelulares y trastornosen el balance iónico, con pérdida de lapermeabilidad selectiva del plasmalema ytrastornos en el metabolismo aeróbico yglucolisis anaeróbica, comprometiendotodas aquellas funciones celulares energético-dependientes,como la motilidad; deigual forma se produce pérdida de enzimasresponsables de la metabolización de lasROS (Reactive Oxigen Species) y la disminuciónde compuestos antioxidantes (αtocoferol,ácido ascórbico, taurina, hipotaurina,etc.) en el medio extracelular trasla dilución y/o centrifugación previa a lacongelación (Brouwers et al. 2005).MODIFICACIONESDEL MEDIO INTERNOSe producen alteraciones en el balanceiónico del sodio, zinc y calcio, que se acumulanen el espacio intracelular, y delpotasio y magnesio, que salen masivamentede la célula (Watson y Plummer,1985). Aunque existen grandes diferenciasindividuales, el incremento de calciointracelular es muy característico de laespecie porcina en comparación con otrasespecies, y se debe a una alteración de labomba que lo regula (White, 1993), yaque las proteínas de membrana que funcionancomo bomba de iones disminuyensu actividad con el descenso de la temperatura(Watson y Plummer, 1985).EFECTOS SOBREEL CITOESQUELETOMuchas de las proteínas del citoesqueletoejercen una función estabilizadora delplasmalema (Holt y North, 1991), con uncomportamiento de despolimerización yrepolimerización dependiente de la temperatura(Watson, 1995). El glicerol, además,altera a los microtúbulos, lo querepercute indirectamente sobre la membrana.Por otro lado, los rápidos cambiosdel volumen celular influyen sobre el sosténesquelético de las membranas plasmáticay acrosomal, aunque poco se conoceal respecto (Watson, 1995). En la alteraciónestructural de la membrana plasmáticade la región acrosómica influyen lasdimensiones de la cabeza espermática: enel espermatozoide de las especies más vulnerablesésta es alargada y plana, distintade la más pequeña y convexa de las especiesresistentes. El componente citoesqueléticoestabilizador parece no estar presenteen la región anterior de la cabeza,con lo que las consecuencias del enfriamientoserían más graves en las especiescon espermatozoides de cabeza plana yalargada (Watson y Plummer, 1985).EFECTOS SOBRE LA MOVILIDADTal como ha señadado Brouwers et al.(2005), la peroxidación lipídica es particularmenteintensa en la pieza intermedia,lo que explicaría la disminución de lamovilidad espermática tras la descongelación.Los cambios cualitativos de la movilidaddespués de la descongelación (Cremadeset al., 2005), presentan similarescaracterísticas a los espermatozoideshiperactivados a consecuencia de la capacitaciónespermática previa a la fecundación(Schmidt y Kamp, 2004).EFECTOS SOBRE EL NÚCLEOEl fenómeno de supercondensación de lacromatina nuclear se ha constatado enespermatozoides criopreservados de verraco(Hamamah et al., 1990), relacionándolocon una alteración de la capacidadfecundante y del desarrollo embrionario.También Martín-Rillo et al. (1999) asocianlos trastornos del desarrollo embrionario aalteraciones en la organización de la cromatinanuclear, pues encuentran unamayor proporción de embriones en estadiosmenos avanzados del desarrollo, ytambién de embriones degenerados en cerdasinseminadas con semen descongelado,en comparación con otras que lo fueroncon refrigerado. Un estudio de Fraser yStrzezek (2007) ha descrito un incrementode la fragmentación del ADN del núcleode los espermatozoides porcinos tras elproceso de congelación-descongelación.APORTACIONES A LACRIOPRESERVACIÓNESPERMÁTICANuestras aportaciones a esta línea deinvestigación han sido numerosas y endiferentes aspectos, que resumidamentepodemos agrupar en las siguientes:Criorresistencia y termorresistenciacomo pruebas de la valoración de la123capacidad de criopreservación.Lesiones espermáticas durante la criopreservacióny vitalidad espermática. Utilizaciónde antioxidantes en su prevención.Aplicaciones de las nuevas tecnologíasCASA y ASMA en la cuantificación delesiones espermáticas durante la criopreservación:desarrollo de nuevas técnicasde visión artificial en la valoración de laslesiones acrosomales producidas durantela criopreservación.Utilización del test homólogo FIV en lavaloración de la capacidad fecundante456del semen descongelado de verraco.Variación de las subpoblaciones espermáticasdurante el proceso de congelación-descongelación.Protocolos de inducción y sincronizacióndel celo en la cerda en la ayuda alproceso de inseminación con semencriopreservado.La valoración de la criorresistencia deun eyaculado depende del parámetro demedida de calidad que se considere(Peláez, 2003; Peláez et al., 2004). Ennuestro trabajo la estimación más precisase obtiene considerando el porcentaje deespermatozoides mótiles bajo estimulacióncon cafeína y el porcentaje de espermatozoidescon membrana plasmáticaíntegra evaluada con el fluorocromo yodurode propidio. No obstante, la utilizaciónde una prueba complementaria de termorresistenciaposdescongelación, medianteincubación a 37 ºC, con un seguimientode la motilidad espermática (mejor que dela vitalidad) con y sin estimulación por’119