Cours 2 CP NCI 2012 - Département de biologie

Neurobiologie des canaux ioniques
Master I DI
porcher@inmed.univ-mrs.fr

Chapitre 2 : l’excitabilité
Luigi Galvani (1737-1798)
Un courant électrique appliqué à un nerf provoque une contraction musculaire.
Chaque animal contient de l’électricité continuellement présente dans son corps,
"l’électricité animale".
Lorsque nerf et muscle sont reliés l'un à l'autre par un ustensile fait de deux
métaux différents, cette électricité se décharge.

Avec une quantité adéquate d’électricité injectée dans le cerveau, un cadavre
revient à la vie

Alessandro Volta (1745-1827)
La rivalité entre Galvani et Volta
D'aprés Volta, les travaux de Galvani ne prouvent pas
l'existence d'une électricité animale, mais au contraire
celle d'une électricité métallique.
Volta ne met pas en doute les expériences de Galvani
mais les interprète différemment.

l’excitabilité
1850 : H. von Helmholtz mesure la
vitesse de l'influx nerveux dans un
nerf.
Vitesse de quelques m/s seulement.
C’est donc beaucoup plus lent que
L’électricité circulant dans un fil
Métallique.
La cellule agit comme une pile électrique

L’excitabilité
Les neurones transmettent des informations par le biais
de signaux électriques. Ces signaux se basent sur
des flux d’ions membranaire.
Nous allons aborder les notions de :
• Potentiel de repos membranaire
• Potentiel seuil
• Potentiel d’action
• Potentiel d’inversion

Mécanisme du potentiel de repos
La membrane plasmique est constituée d’une bicouche lipidique isolante à propriété capacitive
(propriété d’un condensateur à accumuler un gradient de charges électriques de part et d’autre d’une
substance isolante).
On peut donc assimiler un élément de membrane à une pile de 70mV (Um), négative à l’intérieur,
reliée à une résistance membranaire (Rm) mise en parallèle avec un condensateur membranaire
(Cm).

Partie hydrophyle
La membrane biologique
Partie centrale
hydrophobe
La membrane plasmique constitue une barrière entre le milieu intra et extracellulaire.
Elle est composée d’une bicouche de phospholipides. Les protéines
membranaires traversent (proteines intrinseques) ou sont attachées à la
bicouche de lipides sans la pénétrer (protéines extrinsèques)

Canaux et protéines de transport
Les membranes des neurones possèdent de nombreuses protéines qui participent au transport
des molécules :
1. canaux ioniques (voltage- ou chimio-dépendants i.e. neurotransmetteur).
2. Uniporteurs qui permettent à de petites molécules hydrophyles de traverser la membrane
selon leur gradient de concentration (diffusion facilitée).
3. Transports couplés aux mouvements d’autres substances (en général des ions), soit dans
la même direction (symporteur), soit dans des directions opposées (antiporteur).
4. Transport actif : processus dépendant d’energie utilisé pour transporter des ions ou de
petites molécules contre leur gradient électrochimique.

• D’un changement de
potentiel
transmembranaire.
• Il existe deux types de
potentiels
transmembranaires
– Potentiel de repos
(pas excité)
– Potentiel d’action
(excité suite à une
stimulation)
D’où vient l’excitabilité ?

L’excitabilité : principe
Solution aqueuse d’ions (NaCl)
Les électrons du métal
sont attirés par la borne positive
et repoussés par la borne négative:
mouvement d’électrons
mouvement de particules chargées
genèse d’un courant
Les ions positifs (Na + ) sont attirés
par la borne -. Les ions
négatifs (Cl - ) par la borne +
et repoussés par la borne - :
mouvement d’ions

L’excitabilité
Les ions + (cations) en solution attirent les molécules d'eau par leur
partie négative. Les ions - (anions) en solution attirent les molécules
d'eau par leur partie positive. Il en résulte que chaque ion s'entoure
d'un certain nombre de molécules d'eau.
Ce phénomène est appelé solvatation des ions. Lorsque le solvant
est l'eau la solvatation est appelée hydratation.

Comment mesurer le potentiel membranaire
Solution conductrice : e.g. la micropipette est remplie d’une solution saline (KCl)

THE PATCH-CLAMP TECHNIQUE
Erwin Neher Bert Sakmann
(1991 Nobel Laureates) ‘gigaseal’

Configuration inside-out
La face intracellulaire du canal baigne dans le milieu de superfusion
But: étudier la régulation de l’activité d’un canal ou d’un récepteur par des
enzymes, messagers seconds etc…. Cela donne une idée de la régulation
intracellulaire de l’activité des canaux

Configuration whole-cell
Le milieu intracellulaire est conditionné par la solution intra-pipette
But: étudier l’activité électrophysiologique de l’ensemble des canaux et des
récepteurs au niveau d’une cellule entière.

Configuration cellule attachée
But: Etudier les propriétés d’un canal ionique ou d’un récepteur dans les
conditions physiologiques (sans perturber le milieu intracellulaire).

Configuration outside-out
Un canal ionique ou un récepteur est isolé, sa partie extracellulaire baigne dans
la milieu de superfusion
But: étudier les propriétés d’un récepteur-canal et déterminer particulièrement
l’affinité du récepteur pour un agoniste

Patch-clamp recording : setup
la préparation (cellule) est reliée via une pipette de patch à une tête
d'amplificateur, elle même connectée à un amplificateur, lui-même connecté à
un ordinateur.

Potentiel de repos
Cette différence de potentiel est maintenue
grâce à la pompe Na + K + .

Potentiel de repos
• Dans une cellule, la charge électrique est différente de
celle du milieu.
• Cela génère une différence de potentiel (ddp)
• Cette ddp est créée par les différences dans la
composition du milieu intérieur et extérieur
• Pourquoi ?
– Perméabilité sélective de la membrane.
• perméable au K + et Cl - .
• Imperméable au Na + .
– Mécanisme de transport actif. (Na + et Cl - )

Concentrations en ions de part et d’autre de la membrane
Extérieur de la membrane:
• Ions positifs = Na + surtout (un peu de K + aussi)
• Ions négatifs = Cl - surtout
Surplus d’ions +
Intérieur du neurone:
• Ions positifs = K + surtout (un peu de Na + aussi)
• Ions négatifs = Protéines et ions phosphates
Surplus d’ions -
BILAN : + à l’extérieur; - à l’intérieur

Supposons que de part et d’autre d’une membrane on ait
autant d’ions positifs que négatifs
10 Cl - et 10 Na +
10 K + et 10 ions -
Potentiel nul (autant de + que de -)
Potentiel nul (autant de + que de -)

Que se passe-t-il si on ajoute des canaux permettant le passage
des K + , mais pas des autres ions?
==> diffusion du potassium
10 Cl-
10 Na +
3 K+
10 ions -
7 K +
13 charges + et 10 - = +3
+3
-3
7 charges + et 10 - = -3

La diffusion ne se fera pas jusqu’à équilibre des
concentrations du K +
Le K + cherche à
diffuser en suivant
son gradient de
concentration
Le K + est attiré par
les charges - de
l'intérieur et
repoussé par les
charges + de
l'extérieur
Le gradient électrique qui se forme arrête la diffusion.

À l’équilibre:
+3
Valeurs
arbitraires
-3
Les charges positives en surplus
s ’accumulent sur la membrane
Les charges négatives en surplus
s ’accumulent sur la membrane

The plasma membrane separates two media of different ionic composition
Cations:
• Intracellular: K +
• Extracellular: Na +
Anions:
• Intracellular: organic molecules (P - ):
negatively charged amino acids
(glutamate and aspartate), proteins,
nucleic acids, phosphates, etc…
• Extracellular: Cl -
A marked difference between cytosolic and
extracellular Ca 2+ concentrations is also
observed

The plasma membrane separates two media of different ionic composition
Intracellular and extracellular media are neutral ionic solutions: in each
medium, the concentration of (+) ions = (-) ions.
Extracellular:
[Na + ]e + [K + ]e + 2[Ca 2+ ]e = 140 +3 + (2 x 1.5) = 146 mM and [Cl - ]e = 146 mM
Intracellular:
[Na + ] i + [K + ] i + 2[Ca 2+ ] i = 7 + 140 + 0.0002 = 147 mM but [Cl - ] i = 7 mM
In the intracellular compartment, other anions than chloride ions are present
and compensate for the positive charges (HCO 3 - , PO4 2- , aminoacids, proteins,
nucleic acids, etc …).

The unequal distribution of ions across the neuronal plasma
membrane is kept constant by active transport of ions
Concentration gradients for Na + , K + , Ca 2+ and Cl - ions are constant in the
external and cytosolic compartments.
Two hypotheses can explain this constancy:
1. Na + , K + , Ca 2+ and Cl - ions cannot cross the plasma membrane. In
that case, concentration gradients need to be established only
once in the lifetime.
2. Plasma membrane is permeable to Na + , K + , Ca 2+ and Cl - ions but
there are mechanisms that continuously re-establish the
gradients and maintain constant the unequal distribution of ions.

The unequal distribution of ions across the neuronal plasma
membrane is kept constant by active transport of ions
When proteins are absent from a synthetic lipid bilayer, no movements of
ions occur.
The lipid bilayer is a barrier for the diffusion of ions and most polar
molecules.
E.g. When a axon is immerged in a bath containing a control concentration
of radioactive *Na + ( 24 Na + ), *Na + constantly appear in the cytoplasm.
This *Na + influx is not affected by dinitrophenol (DNP), a blocker of ATP
synthesis in mitochondria. It does not require energy expenditure.
This is passive transport.
But what are the mechanisms that maintain concentration gradients across
neuronal membranes?

The unequal distribution of ions across the neuronal plasma
membrane is kept constant by active transport of ions
When the reverse experiment is conducted, the axon is passively loaded
with radioactive *Na + , and is transferred to a bath containing cold Na + .
Measuring the quantity of *Na + that appears in the bath per unit of time
(d*Na + /dt, expressed in counts per minute) allows quantification of the efflux
of *Na +.
In the presence of dinitrophenol (DNP) this *Na + efflux quickly diminishes to
nearly zero.
The process can be started up again by intracellular injection of ATP.
Therefore the *Na + efflux is active transport.

Ionic composition of cytosol and
extracellular compartments are
maintained at the expense of a
continuous basal metabolism that
provides energy (ATP) utilized to
actively transport ions and thus to
compensate for their passive
movements.
(a) Effect of dinitrophenol on the outflux of *Na + as a function of time
(b) Passive and active Na + fluxes are in opposite directions

La polarité de la membrane est donc due:
• Différence de concentration en ions entre l’intérieur
et l’extérieur de la cellule.
• Perméabilité sélective de la membrane (laisse
passer le K+).
La polarité se maintient même si
du Na + parvient à pénétrer:
pompes à sodium / potassium.
– Une pompe Na+ K+ travaille à
200 Na + /secondes
– Il y a plus de 200 pompes / µm 2 .

Equation de Nernst
– Ex = potentiel d’équilibre pour l’ion x
– R = constante des gaz parfaits
– T = température absolue (Kelvin)
– Z = valence (charge électrique) de l’ion perméant

Origine du potentiel de membrane
• Le potentiel de membrane est le résultat de la différence
de concentration d’ions (gradients) et de la perméabilité
sélective de la membrane cellulaire.
– Si P K est importante, E m est proche de E K
– if P Na est importante, E m est proche de E Na
– etc. etc
E
m
=
RT
F
ln
P [ K] + P [ Na] + P [ Cl]
K o Na o Cl i
P [ K] + P [ Na] + P [ Cl]
K i Na i Cl o

Les potentiels électriques
• Ces potentiels électriques dépendent
de deux sortes de protéines de la
membrane cellulaire :
– Les canaux ioniques
– Les pompes à ions

Les canaux ioniques déterminent la perméabilité
• Ils permettent à certains ions
de franchir la membrane
suivant leurs gradients de
concentration.
• L’ouverture de ces canaux
augmente la perméabilité
membranaire.

Les pompes à ions instaurent des gradients ionique
• Ils transportent activement
certains ions, contre leurs
gradients de concentration.

Résumé canaux et pompes
Canaux et pompes travaillent les uns contre les autres
et produisent ainsi l’électricité cellulaire.
• Les pompes instaurent des différences de
concentration ionique
• Les canaux utilisent ces gradients de concentration
pour permettent une diffusion des ions dans le sens
de leurs gradients chimiques

Le potentiel d’action
Les neurones peuvent réagir à un stimulus (excitabilité).
Réaction = ouverture de canaux Na + de la membrane
Baisse d’ions + à l’extérieur
Hausse d’ions + à l’intérieur
Il y a dépolarisation de la membrane
(l’intérieur qui était négatif devient moins négatif)

• Début : dépolarisation proportionnelle à la stimulation
(infraliminaire).
• Si la stimulation est assez forte, la dépolarisation atteint
un seuil de dépolarisation (supraliminaire).
– Tous les canaux Na + ouvrent de façon explosive = entrée
massive de Na + .
– L’intérieur devient même + (+30-40 mV) !
– L’entrée de Na+ arrête grâce à un système d’inactivation des
canaux Na + .
• Ensuite, repolarisation, par ouverture de canaux K + (=
sortie massive de K + ).
• La pompe rétablit les ions.
Le potentiel d’action

Le potentiel d’action
Lorsque la dépolarisation au point stimulé dépasse un certain seuil (~ -
50 mV), il y a un potentiel d’action de déclenché.
Le stimulus 1 (S1) est plus petit que S2 qui est plus petit que S3. Seul
S3 provoque une dépolarisation qui atteint le seuil du neurone.

• Si la dépolarisation ne dépasse pas le seuil : la
membrane reprend sa polarisation normale et il n’y a
pas d’influx.
• Si la dépolarisation dépasse le seuil ==> la
dépolarisation se poursuit jusqu’à + 40 mV :
dépolarisation et repolarisation = potentiel d’action
==> influx nerveux
• Peu importe l’intensité du stimulus, la dépolarisation
ne dépassera pas + 40 mV

Entrée massive de Na + ==> baisse de la polarité là où
les canaux à sodium se sont ouverts.
- 70mV → - 60mV → - 50 mV → ...
Si le seuil est atteint, la polarité s'inverse au point stimulé.

Le point dépolarisé reprend rapidement sa polarité:
• Fermeture des canaux Na + .
• Ouverture de canaux à K +
qui étaient fermés
==> ↑ perméabilité au K +
==> ↑ sortie de K +
= potentiel d ’action

Potentiel de repos et potentiel d’action
Les changements de conductance (des ions Na+ et K+) qui sont à
la base du PA sont dépendants du voltage et du temps.

Quelques caractéristiques
1) Le seuil de dépolarisation :
• Le seuil de dépolarisation peut être différent d’un
neurone à l’autre.
• Il reste constant pour un neurone donné.
• Plus un stimulus est intense, moins il a besoin d’être
appliqué longtemps pour provoquer un PA.

Quelques caractéristiques
2) La loi du tout-ou-rien
• Dès que le seuil est atteint, il y a production d’un PA
d’intensité maximale, peu importe l’intensité du
stimulus.
3) Les sommations locales (temporelles et spatiales)
• Si le stimulus n’est pas assez intense pour déclencher le
potentiel, l’effet d’un deuxième stimulus rapproché peut
s’additionner, pour déclencher un PA.

Quelques caractéristiques
4) Les périodes réfractaires
• Périodes durant lesquelles le neurone est difficilement
excitable :
– Absolue : impossible de déclencher un PA
– Relative : Il est beaucoup plus difficile de déclencher
un PA.
• Limitent la fréquence des PA.

Périodes réfractaires : Le canal Na + voltage dépendant

La phase ascendante du PA
coïncide avec la perméabilité aux
ions Na+.
La conductance au Na s’inactive
lorsque la dépolarisation est
proche de Eeq Na.
Cette dépolarisation active la
conductance K+ dépendante du
voltage, qui a pour effet de
repolariser la membrane.
L’hyperpolarisation rend non
opérationnelle la conductance K +
voltage dépendante.
Modèle du PA

Potentiel seuil

Potentiel seuil

Le potentiel-seuil
• Les PA d’un neurone
suivent la loi du “tout ou
rien”.
• Ainsi, l’intensité d’un
stimulus est codée par la
fréquence des PA et non par
leur amplitude.

Le potentiel-seuil
• Lorsque le potentiel de membrane approche -70 mV, il y a
apparition d’un PA.

Le potentiel-seuil
• Il existe une plage de dépolarisation sous-liminaire :
entrée Na + < sortie K + .
• Seuil : c’est la valeur du PM entre le niveau du PRM
et 0, pour laquelle entrée Na + = sortie K +
• Dès qu’un stimulus dépolarise la membrane au-delà
de cette valeur, il y a rétroaction + (entrée de Na + ) et
départ d’un PA.

Le potentiel d’action
• Proriétés communes à tous les PA :
– Seuil
– Conduction
– Période réfractaire
• Une propriété qui distingue les PA :
– Forme du PA

Formes et terminologie des PA

Formes des potentiels d’action
• La forme du PA va influencer la fréquence maximum à
laquelle un neurone peut générer des PA et le nombre de
PA généré pour un stimulus donné.
• L’encodage de cette information apparaît en terme de
fréquence de décharge.

Formes des potentiels d’action
Hugunard et McCormack,
Electrophysiology of the Neuron

Formes des potentiels d’action
• La forme du PA va influencer le taux de Ca 2+
qui entre dans la terminaison présynaptique
au cours d’un PA (ou d’un train de PA).
• Le taux de Ca 2+ intracellulaire conditionne la
quantité de NT qui va être libéré

Formes des potentiels d’action
• La forme des PA est
fonction de la nature des
canaux ioniques
présents sur la
membrane plasmique et
de leur mode
d’activation.
Il existe des canaux pour les différents ions.
Aujourd’hui, plus de 100 canaux sont répertoriés et il y en a probablement
plus…

Formes des potentiels d’action
• Les canaux Ca 2+ :
– forme du potentiel d’action
– influx Ca 2+ (intracellulaire)

Formes des potentiels d’action
• Les canaux Cl - :
– Forme du potentiel d’action
– Influence le potentiel de repos

Extracellular
milieu
membrane
Intracellulaire
milieu
+ de chlore et des effets excitateurs du GABA initialement
Cl -
Cl -
Cl -
GABA
Cl -
Cl -
Cl -
Cl -
Cl -
GABA
Cl -
Cl -
Cl - Cl -
Cl -
Cl -
Cl -
Cl -
Cl -
Développement
Cl -
Cl -
Cl -
Cl -
Cl -
Cl - Cl -
Cl -
Cl -
GABA
Cl -
Cl -
Cl -
Cl -
Cl -
GABA
Cl -
Cl -
Cl -
Cl -
Cl -
Cl -
Cl-

NKCC1 accumule le Cl- dans les neurones
Cl -­‐ Cl -­‐
Cl -­‐
Cl -­‐

GABA A R
Cl -
Cl -
Cl -
NKCC1
Cl -
Une séquence maturative
Cl -
KCC2
Jeune
Cl -
GABA A R
Cl -
KCC2
Cl - Cl -
NKCC1
Adulte

Formes des potentiels d’action
• Exemple 1 – Les canaux K + sont activés par une
augmentation du taux de [Ca 2+ ] i .
• Au cours d’un PA, il y a ouverture des canaux Ca 2+ VD et
entrée de Ca 2+ dans la cellule.
• Cette augmentation de [Ca 2+ ] i , accroit P K , et hyperpolarise
la membrane.

Formes des potentiels d’action
Hugunard et McCormack, Electrophysiology of the Neuron
page 40, 1994

Formes des potentiels d’action
• Exemple 2 – Le transport électrogène d’ions par la pompe à Na + /K +
peut affecter le PM.
• Après une salve de PA, l’activité des pompes va augmenter afin de
restaurer le taux de i[K + ] et enlever l’excès de Na + .
• Parceque la pompe est électrogénique (3Na + pour 2 K + ), cette activité
provoque un courant hyperpolarisant transitoire.
• Cette hyperpolarisation est bloquée par l’ouabaïne

Formes des potentiels d’action

Conduction du potentiel de membrane
La conduction du courant en l’absence de PA est dite
conduction passive.
L’amplitude de la variation de potentiel décroît
exponentiellement avec la distance.
Le courant fuit à travers la membrane de l’axone.

Conduction du potentiel de membrane
Conduction passive

Conduction du potentiel de membrane
Si l’intensité du courant dépolarisant est suffisant pour
déclencher un PA, le PA se propage sur toute la
longueur de l’axone sans perte d’amplitude.
La propagation du PA exige une conduction active et
une conduction passive du courant.

Conduction du potentiel de membrane
Conduction active

Vitesse de déplacement de l’influx
~ 3 Km / heure à ~ 300 Km / heure
Vitesse dépend :
• Diamètre de la fibre nerveuse : ↑ diamètre ==> ↑ vitesse
• Présence de myéline ==> ↑ vitesse

La conduction saltatoire
« Une fibre non myélinisée devrait avoir un calibre de
plusieurs centimètres pour conduire l'influx à la même
vitesse (100 m/s) qu'une fibre myélinisée de 20 micromètres
de diamètre. »

dépolarisation
repolarisation
dépolarisation
repolarisation dépolarisation

Loi du tout ou rien
Pour qu’il y ait PA, la dépolarisation au point stimulé doit
dépasser un certain seuil (~ - 50 mV).
• Si la dépolarisation ne dépasse pas le seuil : la membrane
reprend sa polarisation normale et il n ’y a pas d’influx.
• Si la dépolarisation dépasse le seuil ==> la dépolarisation se
poursuit jusqu’à + 40 mV : dépolarisation et repolarisation =
potentiel d’action
==> influx nerveux
• Peu importe l’intensité du stimulus, la dépolarisation ne
dépassera pas + 40 mV

Rôle du Ca 2+ dans la libération des
neurotransmetteurs

Mécanismes moléculaires
• Il existe beaucoup de
molécules impliquées
dans la libération des
vésicules.
• Trois protéines sont
mieux connues : les
protéines SNARE
(récepteur des
protéines SNAP), la
synaptotagmine et les
canaux Ca 2+ .

Mécanismes moléculaires
• SNAP-25 régule
l’assemblage des deux
SNARE :
– SNARE vésiculaire
(synaptobrevine)
– SNARE membranaire
(syntaxine)

Mécanismes moléculaires
• La vésicule peut
s’accrocher lorsque
les protéines sont
en place.
• SNARES
– Synaptobrevine
– SNAP-25
• Synaptotagmine
• Canaux Ca 2+

Mécanismes moléculaires
• La dépolarisation ouvre les canaux
Ca 2+ VD situés très prêt de la
vésicule.

Endocytose médiée par des clathrines

Le modèle du « kiss and run »
Endocytose de type “kiss and run” : pas de mise en jeu des clathrines

Propagation du signal et exocytose : synthèse