Mai 2004

1) De quel système à deux substrats s'agit-il. Représentez le sur un schéma.2) Etablir l'équation reliant la vaux concentrations de salicylate et NADH, qui a permit d'obtenirles paramètres ci-dessus.B. La réduction.de l'enzyme par le NADH en excès, en absence d'oxygène, a été étudiéeen cinétique rapide par une méthode de "stopped-flow". Le schéma réactionnel suivant peut êtreproposé (en absence de salicylate):k) k3E+NH~E.NH~k2kt:Io.EH2.Navec E et EH2:enzyme oxydée et réduiteN et NH: NAD+et NADHCette réduction a été suivie au cours du temps par la mesure de la variation de DO à 450nm(~A450), correspondant à la réduction du FAD sur l'enzyme. L'ajustement de ~A450 au cours du. temps à une exponentielle permet d'obtenir la constante de vitesse apparente pour la formation deEH2N (kobs).Des expériences ont été réalisées en utilisant différentes concentrations de NADH en excès parrapport à l'enzyme. Les données obtenues ont pu être ajustées à l'équation suivante:k3 . [NH]kobs=Ki + [NH]Ces expériences ont été réalisées en absence ou en présence de salicylate. Les résultats figurentdans le tableau ci-dessous:sans salicylateavecnsalicylate~ (mM)0.45~kl16.0.661.25:L'expression de kobscorrespondant au schéma réactionnel ci-dessus est la suivante:k)k3 [NH] + (k) [NH] + k2) ktkobs=k) [NH] + k2 + k3111l3) Comment l'ajustement des données réalisé montre-t-il que la seconde étape du schémaréactionnel est irréversible et limitante ?4) D'après les résultats du tableau, quel est l'effet de la présence du salicylate sur la réaction deréduction de l'enzyme?5) Comparez les valeurs de K obtenues par les expériences de cinétique à l'état stationnaire d'unepart, et les Ki en cinétique rapide d'autre part. Qu'en concluez-vous?