Coronavirus EP1694829B1

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à 30°C dans du milieu LB, en présence ou en l’absence d’inducteur (IPTG 1mM). Piste 1 : pIV2.3S C Piste 2 :
pIV2.3S L . Piste 3 : pIV2.4S 1 Piste 4 : pIV2.4S L .
- la figure 4 illustre l’activité antigénique des protéines N, S L et S C recombinantes produites dans la souche E. coli
BL21(DE3)pDIA17 transformée par les vecteurs pIVEX recombinants. A : électrophorèse (SDS-PAGE) des lysats
bactériens. B et C : Westem-blot avec les sérums, provenant d’un même patient infecté par le SARS-CoV, prélevés
respectivement 8 jours (B : sérum M12) et 29 jours-(C : sérum M13) après le début des symptômes du SRAS. Piste
1 : pIV2.3N. Piste 2 : pIV2.4N. Piste 3 : pIV2.3S C . Piste 4 : pIV2.4 S 1 . Piste 5 : pIV2.3S L . Piste 6 : pIV2.4S L
- la figure 5 illustre la purification sur colonne Ni-NTA agarose de la protéine N recombinante produite dans la souche
E. coli BL21(DE3)pDIA17 à partir du vecteur pIV2.3N. Piste 1 : Extrait bactérien total. Piste 2 : Extrait soluble. Piste
3 : Extrait insoluble. Piste 4 : Extrait déposé sur la colonne Ni-NTA. Piste 5 : protéines non-retenues. Piste 6 :
Fractions du pic 1. Piste 7 : Fractions du pic 2.
- la figure 6 illustre la purification de la protéine S C recombinante à partir des corps d’inclusions produits dans la
souche E. coli BL21(DE3)pDIA17 transformée par le pIV2.4S 1 .A. Traitement au Triton X-100 (2%) : Piste 1 : Extrait
bactérien total. Piste 2 : Extrait soluble. Piste 3 : Extrait insoluble. Piste 4 : Surnageant après traitement au Triton
X-100 (2 %). Pistes 5 et 6 : Culot après traitement au Triton X-100 (2 %).B : Traitement à l’urée 4M, 5M, 6M et 7M
des extraits solubles et insolubles.
- la figure 7 représente l’immunoempreinte réalisée à l’aide d’un lysat de cellules infectées par le SARS-CoV et d’un
sérum de patient atteint de pneumopathie atypique.
- la figure 8 représente des immunoempreintes réalisées à l’aide d’un lysat de cellules infectées par le SARS-CoV
et d’immunsérums de lapins spécifiques de la nucléoprotéine N (A) et de la protéine de spicule S (B). I.S. : sérum
immun. p.i. : sérum pré-immun. L’immunsérum anti-N a été utilisé au 1/50000 et l’immunsérum anti-S au 1/10000.
- la figure 9 illustre la réactivité en ELISA des sérums polyclonaux monospécifiques de lapin dirigés contre la protéine
N ou le fragment court de la protéine S (S C ), vis-à-vis des protéines recombinantes correspondantes utilisées pour
l’immunisation. A : lapins P13097, P13081, et P13031 immunisés avec la protéine N recombinante purifié. B : lapins
P11135, P13042, et P14001 immunisés avec une préparation de corps d’inclusions correspondants au fragment
court de la protéine S (S C ). I.S. : sérum immun. p.i. : sérum pré-immun.
- la figure 10 illustre la réactivité en ELISA de la protéine N recombinante purifiée, vis-à-vis de sérum de patients
atteints de pneumonie atypique causée par le SARS-CoV. Figure 10a : plaques ELISA préparés avec la protéine
N à la concentration de 4 g/ml et 2 g/ml. Figure 10b : plaque ELISA préparée avec la protéine N à la concentration
de 1 g/ml. Les sérums désignés A, B, D, E, F, G, H correspondent à ceux du Tableau IV.
- la figure 11 illustre l’amplification par RT-PCR de quantités décroissantes d’ARN synthétique du gène N du SARS-
CoV (10 7 à 1 copie), à l’aide des couples d’amorces n° 1 (N/+/28507,N/-/28774) (A) et n° 2 (N/+/28375,N/-/28702)
(B). T : amplification réalisée en l’absence d’ARN. MW : marqueur d’ADN.
- la figure 12 illustre l’amplification par RT-PCR en temps réel d’ARN synthétique du gène N du SARS-CoV : des
quantités décroissantes d’ARN synthétique en répliquat (repli. ; pistes 16 à 29) ainsi que de l’ARN viral dilué au
1/20x10 -4 (piste 32) ont été amplifiés par RT-PCR en temps réel à l’aide du kit "Light Cycler RNA Amplification Kit
Hybridization Probes" et des couples d’amorces et de sondes de la série n° 2, dans les conditions décrites à l’exemple
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- la figure 13.1 à 13.70 (figure 13.1 à 13.70) représente la carte de restriction de la séquence SEQ ID NO : 1 correspondant
à l’équivalent ADN du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro
031589.
- la figure 14 montre le résultat du test de sérologie SRAS par ELISA N indirect (1ère série de sérums testés)
- la figure 15 montre le résultat du test de sérologie SRAS par ELISA N indirect (2ème série de sérums testés)
- la figure 16 présente le résultat du test de sérologie SRAS par ELISA N double épitope (1 ère série de sérums testés)
- la figure 17 montre le résultat du test de sérologie SRAS par ELISA N double épitope (2ème série de sérums testés)
- la figure 18 illustre le test de réactivité des anticorps monoclonaux anti-N par ELISA sur la nucléoprotéine N native
du SRAS-CoV. Les anticorps ont été testés sous la forme de surnageants de culture d’hybridomes par un ELISA
indirect utilisant un lysat irradié de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV comme antigène (courbes lysat
SRAS). Un contrôle négatif de réactivité est réalisé pour chaque anticorps sur un lysat de cellules VeroE6 non
infectées (courbes lysat négatif). Plusieurs anticorps monoclonaux de spécificité connue ont été utilisés comme
anticorps témoins négatifs : para1-3 dirigé contre les antigènes des virus parainfluenza de type 1-3 (Bio-Rad) et
grippe B dirigé contre les antigènes du virus de la grippe de type B (Bio-Rad).
- la figure 19 illustre le test de réactivité des anticorps monoclonaux anti-N du SRAS-CoV par ELISA sur les antigènes
natifs du coronavirus humain 229E (HCoV-229E). Les anticorps ont été testés sous la forme de surnageants de
culture d’hybridomes par un test ELISA indirect utilisant un lysat de cellules MRC-5 infectées par le coronavirus
humain 229E comme antigène (courbes lysat 229E). Un contrôle négatif d’immunoréactivité est réalisé pour chaque
anticorps sur un lysat de cellules MRC-5 non infectées (courbes lysat négatif). L’anticorps monoclonal 5-11H.6
dirigé contre la protéine S du coronavirus humain 229E (Sizun et al. 1998, J. Virol. Met. 72 : 145-152) est utilisé
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