Coronavirus EP1694829B1

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C. Séquence du promoteur synthétique 480 tel que contenu entre les sites Nde1 et Pst1 des plasmides de
transfert de la série pTN. Un site Asc1 a été inséré pour faciliter les manipulations ultérieures. Les sites de
restriction ainsi que la séquence du promoteur sont soulignés
D. Les virus recombinants de la vaccine sont obtenus par double recombinaison homologue in vivo entre la
cassette TK des plasmides de transfert des séries pTG et pTN et le gène TK de la souche Copenhague du
virus de la vaccine.
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SP : peptide signal prédit (aa 1-13) avec le logiciel signalP v2.0 (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering,
10 : 1-6)
TM : région transmembranaire prédite (aa 1196-1218) avec le logiciel TMHMM v2.0 (Sonnhammer et al.,
1998, Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182, AAAI Press). Il faut
noter que les acides aminés W1194 et P1195 font possiblement partie de la région transmembranaire avec
des probabilités respectives de 0,13 et 0,42.
TK-L, TK-R : parties gauche et droite du gène de la thymidine kinase du virus de la vaccine
MCS : site multiple de clonage
PE : promoteur précoce
PL : promoteur tardif
PL synth : promoteur tardif synthétique 480
- la figure 35 illustre l’expression de la protéine S par les virus vaccine recombinants, analysée par western blot. Des
extraits cellulaires ont été préparés 18 heures après infection de cellules CV1 par les virus vaccine recombinants
VV-TG, VV-TG-S et VV-TN-S à une M.O.I. de 2 (A). A titre de contrôle, des extraits de cellules VeroE6 ont été
préparés 8 heures après infection par le SRAS-CoV à une multiplicité d’infection de 2. Des extraits cellulaires ont
également été préparés 18 heures après infection de cellules CV1 par les virus vaccine recombinants VV-TG-S,
VV-TG-Ssol, VV-TN, VV-TN-S et VV-TN-Ssol (B). Ils ont été séparés sur des gels SDS à 8% d’acrylamide et
analysés par western blot à l’aide d’un anticorps polyclonal de lapin anti-S et d’un anticorps polyclonal anti-IgG(H+L)
de lapin couplé à la peroxidase (NA934V, Amersham). « 1l » et «10l » indique les quantités d’extraits cellulaires
déposées sur le gel. Une échelle de masse moléculaire (kDa) est portée sur la figure.
SRAS-CoV : extrait de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV
Mock : extrait contrôle de cellules non infectées
- la figure 36 montre le résultat d’une analyse par western blot de la sécrétion du polypeptide Ssol par les virus vaccine
recombinants.
A. Des surnageants de cellules CV1 infectées par le virus vaccine recombinant VV-TN, différents clones du
virus VV-TN-Ssol et par les virus VV-TG-Ssol ou VV-TN-Sflag ont été récoltés 18 heures après infection de
cellules CV1 à une M.O.I. de 2.
B. Des surnageants de cellules 293T, FRhK-4, BHK-21 et CV1 infectées en dupliqués (1,2) par le virus vaccine
recombinant VV-TN-Ssol à une M .O.I. de 2 ont été récoltés 18 heures après infection. Le surnageant de cellules
CV1 infectées par le virus VV-TN a également été récolté à titre de contrôle (M).
Tous les surnageants ont été séparés sur un gel SDS à 8% d’acrylamide selon Laemmli et analysés par western
blot à l’aide d’un anticorps monoclonal de souris anti-FLAG et d’un anticorps polyclonal anti-IgG(H+L) de souris
couplé à la peroxidase (NA931V, Amersham) (A) ou à l’aide d’un anticorps polyclonal de lapin anti-S et d’un anticorps
polyclonal anti-IgG(H+L) de lapin couplé à la peroxidase (NA934V, Amersham) (B).
Une échelle de masse moléculaire (kDa) est portée sur la figure.
- la figure 37 montre l’analyse du polypeptide Ssol, purifié par gel SDS de polyacrylamide
10, 5 et 2 l de polypeptide recombinant Ssol purifié par chromatographie d’affinité anti-FLAG ont été séparés sur
gel SDS en gradient de 4 à 15 % de polyacrylamide. Le polypeptide Ssol ainsi que des quantités variables de
marqueurs de masse moléculaire (MM) ont été révélés par coloration au nitrate d’argent (Gelcode SilverSNAP stain
kit II, Pierce).
- la figure 38 illustre l’immunoréactivité du polypeptide recombinant Ssol produit par le virus vaccine recombinant VV-
TN-Ssol vis-à-vis de sérums de patients atteints de SRAS. La réactivité de sérums de patients a été analysée par
test ELISA indirect contre des phases solides préparées à l’aide du polypeptide recombinant Ssol purifié. Les
anticorps de patients réagissant avec la phase solide à une dilution de 1/100 et 1/400 sont révélés par un anticorps
polyclonal anti-IgG(H+L) humain couplé à la peroxidase (Amersham NA933V) et du TMB plus H2O2 (KPL). Les
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