Coronavirus EP1694829B1

EP 1 694 829 B1
5
S C fusionnée à une étiquette polyhistidine en position C-terminale présente une taille plus faible que celle attendue.
Une expérience d’immunodétection avec un anticorps anti-polyhistidine a montré que cette construction était incomplète.
En conclusion, les deux constructions, pIV2.3N et pIV2.4S I , exprimant respectivement la protéine N entière fusionnée
à l’étiquette polyhistidine en C-terminal et la protéine S courte fusionnée à l’étiquette polyhistidine en N-terminal, ont
été retenues pour produire les deux protéines en grande quantité afin de les purifier. Les plasmides pIV2.3N et pIV2.4S I
ont été déposés respectivement sous le n° I-3117 et I-3118 auprès de la CNCM, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS
15, le 23 octobre 2003.
10
15
3) Analyse de l’activité antigénique des protéines recombinantes
[0218] L’activité antigénique des protéines N, S L et S C a été testée par western-blot, à l’aide de deux échantillons de
sérum, provenant d’un même patient infecté par le SARS-CoV, prélevés 8 jours (M12) et 29 jours-(M13) après le début
des symptômes du SRAS. Le protocole expérimental est comme décrit à l’exemple 3. Les résultats illustrés par la figure
4 montrent (i) la séroconversion du patient, et (ii) que la protéine N possède une plus forte réactivité antigénique que la
protéine S courte.
4) Purification de la protéine N à partir de pIV2.3N
20
25
30
[0219] Plusieurs expériences de purification de la protéine N, produite à partir du vecteur pIV2.3N, ont été réalisées
selon le protocole suivant. Les bactéries BL21(DE3)pDIA17, transformées par le vecteur d’expression pIV2.3N, ont été
cultivées à 30°C dans 1 litre de milieu de culture contenant 0,1 mg/ml d’ampicilline, et induites par 1 mM IPTG quand
la densité cellulaire, équivalente à A 600 = 0,8, est atteinte (environ 3 heures). Après 2 heures de culture en présence
d’inducteur, les cellules ont été récupérées par centrifugation (10 min à 5000 rpm), remises en suspension dans le
tampon de lyse (50 mM NaH 2 PO 4 , NaCl 0,3 M, 20 mM imidazole, pH 8 contenant le mélange d’inhibiteurs de protéases
Complete®, Roche), et lysées par la presse de French (12000 psi). Après centrifugation du lysat bactérien (15 min à
12000 rpm), le surnageant (50 ml) a été déposé à un débit de lml/min sur une colonne (15 ml) de chélation métallique
(Ni-NTA superflow, Qiagen), équilibrée par le tampon de lyse. Après lavage de la colonne par 200 ml de tampon de
lyse, la protéine N a été éluée par un gradient d’imidazole (20 →250 mM) en 10 volumes de colonne. Les fractions
contenant la protéine N ont été rassemblées et analysées par électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions
dénaturantes puis coloration au bleu de Coomassie. Les résultats illustrés par la figure 5 montrent que le protocole
employé permet de purifier la protéine N avec une homogénéité très satisfaisante (95%) et un rendement moyen de 15
mg de protéine par litre de culture.
35
40
45
50
55
5) Purification de la protéine S C à partir de pIV2.4S C (pIV2.4S I )
[0220] Le protocole suivi pour purifier la protéine S courte est très différent de celui décrit ci-dessus car la protéine
est fortement agrégée dans le système bactérien (corps d’inclusion). Les bactéries BL21(DE3)pDIA17, transformées
par le vecteur d’expression pIV2.4S I ont été cultivées à 30°C dans 1 litre de milieu de culture contenant 0,1 mg/ml
d’ampicilline, et induites par 1 mM IPTG quand la densité cellulaire, équivalente à A 600 = 0,8, est atteinte (environ 3
heures). Après 2 heures de culture en présence d’inducteur, les cellules ont été récupérées par centrifugation (10 min
à 5000 rpm), remises en suspension dans le tampon de lyse (0,1 M Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 7,5), et lysées par la
presse de French (1200 psi). Après centrifugation du lysat bactérien (15 min à 12000 rpm), le culot a été remis en
suspension dans 25 ml de tampon de lyse contenant 2% Triton X100 et 10 mM β-mercaptoéthanol, puis centrifugé
pendant 20 min à 12000 rpm. Le culot a été remis en suspension dans un tampon Tris-HCl 10 mM contenant 7 M urée,
et mis en agitation douce pendant 30 min à température ambiante. Ce dernier lavage des corps d’inclusion avec 7 M
urée est nécessaire pour éliminer la plupart des protéines membranaires d’E. coli qui co-sédimentent avec la protéine
S C agrégée. Après une dernière centrifugation pendant 20 min à 12000 rpm, le culot final est remis en suspension dans
le tampon Tris-HCl 10 mM. L’analyse électrophorétique de cette préparation (Figure 6) montre que la protéine S courte
peut être purifiée avec une homogénéité satisfaisante (environ 90%) à partir des corps d’inclusion (extrait insoluble).
Exemple 3 : Immunodominance de la protéine N
[0221] La réactivité des anticorps présents dans le sérum des patients atteints de pneumopathie atypique causée par
le coronavirus associé au SRAS (SARS-CoV), vis-à-vis des différentes protéines de ce virus, a été analysée par westernblot
dans les conditions décrites ci-après.
34