Coronavirus EP1694829B1

EP 1 694 829 B1
(suite)
5
Oligo SNE-AS1 50 M
RNAsin 40 U/l
RT/Platinum Taq mix
0,2 l
0,12 l
0, 5 l
2. A 20 l du mix, ajouter 5 l d’ARN et procéder à l’amplification sur thermocycleur (conditions ABI 9600) :
10
15
20
2.1 45°C 30 min.
55°C 15 min.
94°C 2 min.
2.2. 94°C 15 sec. }
45°C 30 sec. } x 5 cycles
72°C 30 sec. }
2.3. 94°C 15 sec. }
55°C 30 sec. } x 35 cycles
72°C 30 sec. + 2sec./cycle }
2.4. 72°C 5 min.
2.5 10°C ∞
25
Conservation à +4°C.
[0285] La RNAsin (N2511/N2515) de Promega a été utilisée comme inhibiteurs de RNase.
[0286] Des ARN synthétiques ont servi de témoin positif. A titre de contrôle, 10 3 , 10 2 et 10 copies d’ARN synthétique
R SNE ont été amplifiées dans chaque expérience.
Seconde étape : PCR nichée "SAR"
30
Oligonucléotides :
[0287]
35
- SAR1-S 5’ CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA 3’
- SAR1-AS 5’ TAT AGT GAG CCG CCA CAC ATG 3’
-> Taille attendue : 121 pb
1. Préparer un mix :
40
45
H2O
Tampon Taq 10X
MgCl 2 25 mM
Mix dNTPs 5 mM
Oligo SAR1-S 50 M
Oligo SAR1-AS 50 M
Taq ADN pol 5 U/l
35,8 l
5 l
4 l
2 l
0,5 l
0,5 l
0,25 l
50
55
L’AmpliTaq DNA Pol d’Applied Biosystems a été utilisée (tampon 10X sans MgCl 2 , réf 27216601).
2. A 48 l du mix, ajouter 2 l du produit de la première PCR et procéder à l’amplification (conditions ABI 9600) :
2.1. 94°C 2 min.
2.2. 94°C 30 sec. }
45°C 45 sec. } x 5 cycles
72°C 30 sec. }
2.3. 94°C 30 sec. }
55°C 30 sec. } x 35 cycles
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