Coronavirus EP1694829B1

EP 1 694 829 B1
ID NO :39 ), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3.
b) extrémité 3’non-codante (3’NC)
5
10
15
20
25
30
a 1 ) synthèse de l’ADNc
[0204] Les ARN issus du prélèvement 031589, extraits comme ci-dessus, ont été soumis à une transcription inverse,
selon le protocole suivant : le mélange réactionnel contenant : ARN (5 l), H 2 O (5 l), tampon de transcriptase inverse
5X (4 l), dNTP 5 mM (2 l), Oligo 20T 5M (2 l), RNasin 40 U/ l (0,5 l) et RT-AMV 10 UI/ l (1,5 l, PROMEGA)
a été incubé dans un thermocycleur, dans les conditions suivantes : 45 min à 42°C, 15 min à 55°C, 5 min à 95°C, puis
il a été maintenu à +4°C.
[0205] L’ADNc obtenu a été amplifié par une première réaction PCR à l’aide des amorces S/N/+/28468-28487 et
ancre 14T précitée. Les conditions de l’amplification sont les suivantes : une étape initiale de dénaturation à 94°C
pendant 2 min est suivie de 10 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 20 sec, une étape
d’hybridation à 45°C pendant 30 sec puis une étape d’élongation à 72°C pendant 50 sec puis de 30 cycles comprenant
une étape de dénaturation à 94°C pendant 20 sec, une étape d’hybridation à 50°C pendant 30 sec puis une étape
d’élongation à 72°C pendant 50 sec, puis d’une étape finale d’élongation à 72°C pendant 5 min.
[0206] Le produit de la première amplification PCR a subi une seconde étape d’amplification à l’aide des amorces
S/N/+/28933-28952 et ancre 14T précitée, dans des conditions identiques à celles de la première amplification. L’amplicon
ainsi obtenu a été purifié, séquencé à l’aide de l’amorce S/N/+/29257-29278 et cloné comme ci-dessus pour les
différentes ORF, pour donner le plasmide dénommé SARS-3’NC. L’ADN de ce clone a été isolé et séquencé à l’aide
des amorces universelles M13 sens et M13 anti-sens et de l’amorce S/N/+/29257-29278 précitée.
[0207] L’amplicon représentant l’ADNc correspondant à l’extrémité 3’NC de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement
répertorié sous le n° 031589 correspond à la séquence SEQ ID NO :73 dans la liste de séquences jointe en
annexe ; cette séquence ne comporte pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats
AY274119.3-Tor2 et AY278741-Urbani.
[0208] Le plasmide dénommé SARS-3’NC a été déposé sous le n° I-3123 le 7 novembre 2003, auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15. ; il contient la séquence
d’ADNc correspondant à l’extrémité 3’non codante du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement
répertorié sous le n° 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant à celle située entre le nucléotide
en position 28933 à 29727 (SEQ ID NO :40), en référence à la séquence Genbank n° d’accès AY274119.3, se
termine par une série de nucléotides a.
35
40
45
50
55
2.6) ORF1a et ORF1b
[0209] L’amplification de la région 5’ contenant les ORFla et ORFlb du génome du SARS-CoV issu du prélèvement
031589 a été réalisée en pratiquant des réactions de RT-PCR suivies de PCR nichées selon les mêmes principes que
ceux précédemment décrits pour les autres ORF. Les fragments amplifiés sont chevauchants sur plusieurs dizaines de
bases, permettant ainsi la reconstruction informatique de la séquence complète de cette partie du génome. En moyenne,
les fragments amplifiés sont de deux kilobases.
[0210] 14 fragments chevauchants dénommés L0 à L12 ont ainsi été amplifiées à l’aide des amorces suivantes :
REGION
AMPLIFIEE ET
SEQUENCEE (ne
tient pas compte
des amorces)
Tableau II: Amorces utilisées pour l’amplification de la région 5’(ORF1a et ORF1b)
Amorce sens RT-
PCR
Amorce antisens
RT-PCR
L0 50-480 S/L0/F1/+30 S/L0/R1/-481
Amorce sens PCR
nichée
Amorce antisens
PCR nichée
L1 231-2240 S/L1/F1/+147 S/L1/R1/-2336 S/L1/F2/+211 S/L1/R2/-2241
L2 2156-4167 S/L2/F1/+2033 S/L2/R1/-4192 S/L2/F2/+2136 S/L2/R2/-4168
L3 3913-5324 S/L3bis/F1/+3850 S/L3bis/R1/-5365 S/L3bis/F2/+3892 S/L3bis/R2/-5325
L4b 4952-6023 S/L4b/F1/+4878 S/L4b/R1/-6061 S/L4b/F2/+4932 S/L4b/R2/-6024
L4 5325-7318 S/L4/F1/+5272 S/L4/R1/-7392 S/L4/F2/+5305 S/L4/R2/-7323
30