Coronavirus EP1694829B1

EP 1 694 829 B1
Conjugué
5
[0263] Il s’agit de la protéine N recombinante purifiée, couplée à la peroxidase selon le protocole de Nakane (Nalcane
P.K. and Kawaoi A; (1974) : Peroxydase-labeled antibody, a new method of conjugation. The Journal of Histochemistry
and Cytochemistry Vol22, N)23, pp 1084-1091.), dans des ratios molaires respectifs 1/2. Ce conjugué ProtN POD est
utilisé à une concentration de 2g/mL dans du diluant serum/conjugué.
Autres solutions :
10
[0264] Solution de lavage R2, Solutions de révélation au TMB R8, diluant, R9 chromogène, R10 solution d’arrêt :
réactifs commercialisées par Bio-Rad (ex kit platelia pylori ref 72778).
b) Mode opératoire
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1ere étape en plaque de "prédilution"
[0265]
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■ Diluer chaque sérum au 1/5 dans la plaque de prédilution (48 L de diluant +12 L de sérum).
■ Après avoir dilués l’ensemble des serums, distribuer 60L de conjugué
■ Le cas échéant, le mélange sérum + conjugué est laissé à incuber.
2eme étape en plaque de "réaction"
25
30
35
40
45
50
55
[0266]
■ Transférer 100Lde mélange/puits dans la plaque de réaction
■ Incubation 1h 37°C
■ 5 lavages en solution de LAVAGE R2 10x préalablement diluée 10 fois en eau déminéralisée (--> solution de
lavage 1x)
■ distribuer 200L/puits de solution de révélation (à diluer extemporanément ex:l mL de R9 dans 10mL de R8)
■ incubation 30min à température ambiante à l’abri de la lumière
■ arrêter la réaction avec 100L/puits de R10
■ LECTURE à 450/620nm
[0267] De même que pour le test ELISA indirect, les résultats peuvent être interprétés en utilisant un serum "valeur
seuil". Tout serum ayant une réponse supérieure au sérum valeur seuil sera considéré comme positif.
2) Résultats
[0268] Les sérums de patients classés comme cas probables de SRAS de l’hôpital français de Hanoi, Vietnam ou en
relation avec l’hôpital français de Hanoi (JYK) ont été analysés en utilisant le test IgG-N indirect et le test N double épitope.
[0269] Les résultats du test IgG-N indirect (figures 14 et 15) et N double épitope (figures 16 et 17) montrent une
excellente corrélation entre eux ainsi qu’avec un test ELISA indirect comparant la réactivité des sérums vis-à-vis d’un
lysat de cellules VeroE6 non infectées ou infectées par le SRAS-CoV (ELISA-lysat SRAS-CoV ; voir le Tableau V ciaprès).
Tous les sérums prélevés 12 jours ou plus après le début des symptômes ont été trouvés positifs, y compris
chez des patients pour lesquels l’infection par le virus du SRAS-CoV n’avait pas pu être documentée par analyse de
prélèvements respiratoires par RT-PCR, vraisemblablement en raison d’un prélèvement trop tardif au cours de l’infection
(≥ J12). Dans le cas du patient TTH pour lequel un prélèvement nasal réalisé à J7 a été trouvé négatif par RT-PCR, la
qualité du prélèvement pourrait être en cause.
[0270] Certains sérums ont été trouvés négatifs alors que la présence de SRAS-CoV a été détectée par RT-PCR. Il
s’agit dans tous les cas de sérums précoces prélevés moins de 10 jours après le début des symptômes (ex : sérum #
032637). Dans le cas d’un patient PTTH (sérum # 032673), seule une suspicion de SRAS était évoquée au moment où
les prélèvements ont été réalisés.
[0271] En conclusion, les tests sérologiques IgG-N indirect et N-double épitope permettent de documenter l’infection
par le SRAS-CoV chez tous les patients pour des sérums prélevés 12 jours ou plus après l’infection.
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