Coronavirus EP1694829B1

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(A., B.) ou 90-100% (C), les cellules ont été fixées, perméabilisées et marquées par des anticorps polyclonaux de
lapins anti-SRAS-CoV et un conjugué anti-IgG(H+L) de lapin couplé au FITC (Jackson).
- la figure 43 illustre l’analyse par western blot de l’immunoréactivité de sérums de lapins dirigés contre les peptides
E1-12, E53-76 et M2-14. Le lapin 20047 a été immunisé avec le peptide E1-12 couplé à la KLH. Les lapins 22234
et 22240 ont été immunisés avec le peptide E53-76 couplé à la KLH. Les lapins 20013 et 20080 ont été immunisés
avec le peptide M2-14 couplé à la KLH. Les immunsérums ont été analysés par western blot à l’aide d’extraits de
cellules infectées par le SRAS-CoV (B) ou à l’aide d’extraits de cellules infectées par un virus recombinant de la
vaccine exprimant la protéine E (A) ou M (C) de l’isolat 031589 du SRAS-CoV. Les immunoempreintes ont été
révélées à l’aide d’un conjugué anti-IgG(H+L) de lapin couplé à la peroxidase (NA934V, Amersham).
[0148] La position des protéines E etM est indiquée par une flèche.
[0149] Une échelle de masse moléculaire (kDa) est portée sur la figure.
[0150] Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d’illustration de l’objet de
l’invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemple 1 : Clonage et séquençage du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié
sous le numéro 031589
[0151] L’ARN de la souche de SARS-CoV a été extrait à partir du prélèvement de lavage bronchoalvéolaire répertorié
sous le numéro 031589, effectué sur un patient de l’hôpital français de Hanoi (Vietnam) atteint de SRAS.
[0152] L’ARN isolé a été utilisé comme matrice pour amplifier les ADNc correspondant aux différents cadres ouverts
de lecture du génome (ORF la, ORF1b, ORF-S, ORF-E, ORF-M, ORF-N (incluant les ORF-13 et ORF-14), ORF3, ORF4,
ORF7 à ORF11), et aux extrémités 5’ et 3’ non-codantes. Les séquences des amorces et des sondes utilisées pour
l’amplification/détection ont été définies d’après la séquence nucléotidique disponible du SARS-CoV.
[0153] Dans ce qui suit les amorces et les sondes sont identifiées par : la lettre S, suivie d’une lettre qui indique la
région correspondante du génome (L pour l’extrémité 5’incluant ORF1a et ORF1b ; S, M et N pour les ORF-S, ORF-M,
ORF-N, SE et MN pour les régions intergéniques correspondantes), puis éventuellement de Fn, Rn, avec n inclus entre
1 et 6 correspondant aux amorces utilisées pour la PCR nichée ou imbriquée (paire F1 + R1 pour la première amplification,
paire F2 + R2 pour la deuxième amplification, etc...), puis de /+/ ou /-/ correspondant à une amorce sens ou antisens
et enfin des positions des amorces en référence à la séquence Genbank AY27411.3 ; pour les amorces S et N sens et
antisens et les autres amorces sens uniquement, lorsqu’une seule position est indiquée elle correspond à celle de
l’extrémité 5’ d’une sonde ou d’une amorce d’environ 20 bases ; pour les amorces antisens autres que les amorces S
et N, lorsqu’une seule position est indiquée elle correspond à celle de l’extrémité 3’ d’une sonde ou d’une amorce
d’environ 20 bases.
[0154] Les produits d’amplifications ainsi générés ont été séquencés à l’aide d’amorces spécifiques afin de déterminer
la séquence complète du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589.
Ces produits d’amplification, à l’exception de ceux correspondant aux ORF1a et ORF1b, ont ensuite été clonés dans
des vecteurs d’expression afin de produire les protéines virales correspondantes et les anticorps dirigés contre ces
protéines, notamment par immunisation à base d’ADN.
1. Extraction des ARN
[0155] Les ARN ont été extraits à l’aide du kit QIamp viral RNA extraction mini (QIAGEN) en suivant les recommandations
du fabricant. De manière plus précise : 140 l du prélèvement et 560 l de tampon AVL ont été mélangés
vigoureusement pendant 15 secondes, incubés 10 min à température ambiante puis centrifugés brièvement à vitesse
maximale. 560 l d’éthanol à 100% ont été ajoutés au surnageant et le mélange ainsi obtenu a été agité très vigoureusement
pendant 15 sec. 630 l du mélange ont ensuite été déposés sur la colonne.
[0156] La colonne a été placée sur un tube de 2 ml, centrifugée 1 min à 8000 rpm, puis le reste du mélange précédent
a été déposé sur la même colonne, centrifugé à nouveau, 1 min à 8000 rpm et la colonne a été transférée sur un tube
de 2 ml propre. Ensuite, 500 l de tampon AW1 ont été ajoutés sur la colonne, puis la colonne a été centrifugée 1 min
à 8000 rpm et l’éluat a été éliminé. 500 l de tampon AW2 ont été ajoutés sur la colonne qui a ensuite été centrifugée
3 min à 14000 rpm et transférée sur un tube de 1,5 ml. Enfin, 60 l de tampon AVE ont été ajoutés sur la colonne qui
a été incubée 1 à 2 min à température ambiante puis centrifugée 1 min à 8000 rpm. L’éluat correspondant à l’ARN purifié
a été récupéré et congelé à -20°C.
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