REVIEW: Ellagitanin; Biosintesis, Isolasi, dan Aktivitas Biologi

More documents

Recommendations

Info

28Biofarmasi 1 (1): 25-38, Pebruari 2003senyawa dan tumbuhannya. Oleh karena itu, penelitianbiosintesis ellagitanin sekarang mengalamiperkembangan, tidak hanya difokuskan pada beberapajenis tumbuhan di atas, namun sudah semakinmeluas.Jalur biosintesis ellagitanin, terdiri atas tiga tahapanreaksi. Tahap pertama adalah pembentukanasam galat (1), sebagai penyusun struktur primerellagitanin (Gambar 1). Tahap ini diawali dari jalurshikimat (8) yang membentuk dua arah reaksisintesis asam galat. Arah pertama melaluipembentukan L-fenilalanin (10) dengan perantaraarogenate (9). Pembentukan asam sinamat dari L-fenilalanin (10) dihalangi oleh enzim L-AOPP (L-2-aminooxy-3-phenylpropionic acid), dan reaksidiarahkan pada senyawa kafeat (11). Arah reaksikedua melalui pembentukan 3-dehidroshikimat (12)yang mengalami hidrogenasi pada atom C ke-3sehingga terbentuk asam galat (Gross, 1992).Tahap kedua adalah pembentukan pentagalloilglukosayang diawali oleh reaksi asam galat(1) dengan uridin 5-difosfat glukosa (15) untukmembentuk -glukogallin (16) (Gambar 2). Denganpenambahan 4 molekul galloil, -glukogallin diubahmenjadi 1,2,3,4,6-pentagalloilglukosa (17). Empatmolekul galloil menggantikan atom H pada empatgugus hidroksil. Proses penggantian atom Htersebut dinamakan reaksi galloilasi. Reaksi iniberurutan mulai dari gugus hidroksil ke-1, lalu ke-6,ke-2, ke-3, dan yang terakhir ke-4. Reaksi ini membutuhkanenzim galloiltransferase (Gross, 1992).Tahap terakhir merupakan tahap yang secaralangsung menuju ke pembentukan senyawasenyawagolongan ellagitanin (Gambar 2). Sepertitelah disebutkan sebelumnya, biosintesis senyawaellagitanin berbeda-beda tergantung jenis senyawadan jenis tumbuhan penghasilnya. Senyawaellagitanin dihasilkan dari oksidasi (atau lebihtepatnya dehidrogenasi/pelepasan atom H darigugus OH) pentagalloilglukosa. Residu sederhanayang dihasilkan dari proses dehidrogenasi dua grupgalloil dari pentagalloilglukosa adalah HHDP (2).Dehidrogenasi yang terjadi diikuti dengan reaksiperangkaian (coupling) antar atom C dua gugusgalloil. Gallotanin yang mengalami oksidasiperangkaian C-C dan C-O pada gugus galloil yangberdekatan menghasilkan ellagitanin (Gross, 1992).EKSTRAKSI DAN ISOLASIELLAGITANINBahan tumbuhanPada prinsipnya, semua bagian jaringantumbuhan penghasil ellagitanin dapat digunakansebagai sumber ekstrak ellagitanin, namun jenisdan kadar pada setiap jaringan cenderung berbedabeda.Dalam menentukan bagian tumbuhan yangakan diekstraksi, perbandingan kadar senyawa padasetiap jaringan perlu dipertimbangkan. Selain itu,umur jaringan juga perlu diperhatikan. Umumnya,jaringan tua memiliki kandungan metabolitsekunder lebih banyak daripada jaringan muda.Tanin dapat diekstraksi dari seluruh bagiantumbuhan, meliputi daun, cabang, batang, akar,dan buah (Scalbert, 1991). Bagian yang kaya akantanin, berbeda-beda tergantung jenis tumbuhannya,misalnya pada Caesalpinia spinosa organ buahmemiliki kandungan tanin paling tinggi (Galvez etal. 1997), sedangkan pada pohon oak (Quercus)kandungan tanin banyak terdapat di batang (Helm,2000). Umumnya ekstraksi tanin dilakukan daridaun dan batang tumbuhan. Jaringan yangdiekstrak dapat berupa jaringan segar maupun yangsudah kering. Untuk analisis, sebaiknya digunakanjaringan segar (Scalbert, 1992). Namun,kadangkala hal itu tidak memungkinkan karenajauhnya jarak pengambilan sampel denganlaboratorium. Untuk itu sampel tumbuhan dapatdibekukan, dikeringbekukan, atau dikeringanginkan.Metode kering-beku merupakan cara yang palingaman untuk mencegah perubahan jaringan, yangberakibat pada perubahan kadar tanin. Metode inidilakukan dengan menggunakan nitrogen cair.Jika nitrogen cair tidak tersedia, maka alternatifyang mudah adalah dikeringanginkan. Titik uapsenyawa ellagitanin sangat tinggi, misalnya padalagerstroemin (5) di atas 250 0 C, namun prosespengeringan sebaiknya dilakukan pada suhu kamaratau kurang dari 40 0 C. Pada suhu lebih dari 40 0 Cdapat terjadi penurunan kadar dan ekstrakbilitastanin secara drastis. Jika pengeringan dilakukandalam ruang yang kelembabannya tinggi, makapenggunaan kipas angin sangat disarankan. Hal iniakan mempercepat proses pengeringan danmencegah molekul air bereaksi dengan molekultanin melalui lukaluka pada jaringan.Ekstraksi dan IsolasiSenyawa tanin umumnya dapat larut denganpelarut dari polar sampai semipolar. Ekstraksi tanindari jaringan tumbuhan dilakukan denganmenggunakan pelarut aseton 70% atau metanol50% dalam air (FAO/IAEA, 2000). Lin et al. (2001)melakukan ekstraksi ellagitanin dari daun keringEuphorbia tirucalli dengan menggunakan pelarutaseton 60%. Sedangkan Machado et al. (2002)berhasil melakukan ekstraksi ellagitanin dari kulitbuah delima segar (Punica granatum; Punicaceae)dengan etanol. Seperti yang dilakukan oleh Liu etal. (2001), jika menggunakan air sebagai pelarut,proses ekstraksi harus berlangsung pada kondisi airmendidih. Suhu panas dapat membantuekstrabilitas tanin terhadap pelarut air.Prosedur ekstraksi biasa tidak cukup untukmengisolasi ellagitanin. Proses ekstraksi umumnyadilakukan secara berulang dan bertahap. Seringkali, ekstraksi dengan aseton 70% dilakukan berulangsampai tiga kali dan dilanjutkan ke tahapanisolasi. Banyak pekerjaan isolasi ellagitaninmengharuskan penggunaan kromatografi kolomsebagai salah satu tahapan isolasi. Ellagitanin dapatterpisah dengan baik menggunakan kolom pemisahSephadex LH-20, MCI-gel CHP 20P, atau ODS-AQ.Metanol dengan konsentrasi bertingkat merupakaneluen yang baik untuk memperoleh ellagitanin.
HERNAWAN dan SETYAWAN – Ellagitanin 29HOOHOHOHHOOHOHOHHOHOHOHOOHOHHO HC OHCHO OOHOHOOCH 2HOCOCOCOOOHOHOHOHOHHOHOHOHOOHOHHO HC OHCHO OOHOHOOCH 2HOCOCOCOOOHOHOHOHOHOOOOHOOHOHOHOHOOHCO H 2 CCOOOO CCOOOOH(18) flosin BHOOH(19) reginin AHOOHHOOHIsolasi lagerstroemin (5), flosin B (18), danreginin A (19) dari bungur (L. speciosa) pertamakali menggunakan aseton 70% berulang tiga kali.Ekstrak yang diperoleh kemudian disuspensikandalam air dan dipartisikan dengan etil asetat, eter,dan butanol. Fraksi air yang terbentuk dipisahkandengan menggunakan kolom pemisah Diaion HP-20dengan eluen metanol. Proses isolasi berakhir denganpenggunaan instrumen HPLC-preparatif (highperformance liquid chromatography). Kolom ODS-A,2 x 15 cm, dengan eluen metanol 25%, CH 3 CN 10mM dan buffer fosfat pH 2 dapat memisahkanellagitanin dengan baik (Hayashi et al., 2002).Pemisahan ellagitanin dari P. granatum dilakukandengan kolom berurutan yaitu XAD-16 danSephadex LH-20 (eluen yang dipakai adalahmetanol dengan konsentrasi bertingkat), setelahsebelumnya ekstrak etanol dipartisikan denganheksana, butanol, dan etilasetat dan kloroform.Fraksi yang diperoleh dielusikan ke instrumen HPLCpreparatiffase balik, kolom RP-18, 2x25 cmmenghasilkan -punicalagin 20, -punicalagin (21),-punicalin 22 dan -punicalin (23), dan asamelagat (3) (Machado et al., 2001).ANALISIS BIOKIMIAEllagitanin memberikan reaksi warna yang khasdengan asam nitrit (larutan NaNO 2 10% dengansuhu rendah yang ditambahi asam asetat). Warnayang terbentuk merah yang kian lama berubahmenjadi biru indigo. Prosedur sederhana ini biasadigunakan untuk deteksi ellagitanin yang dipisahkandengan menggunakan prosedur kromatografi kertasatau kromatografi lapis tipis (Harbone, 1996). Untukanalisis secara detail disarankan untuk tidakmengandalkan prosedur ini karena hanya cocokuntuk deteksi pendahuluan.Teknik kromatografi lapis tipis (KLT) dua arahbiasa digunakan untuk deteksi pendahuluanellagitanin, jika hanya menggunakan KLT satu arah,hasil pemisahan kurang maksimal akibat adanyabercak-bercak yang masih menyatu. Lempeng yangdigunakan dalam KLT adalah selulosa, misalnyaMN300, dengan pengembang I dari asam asetat 2%v/v dan pengembang II dari campuran butanol:asam asetat: air (12:3:5). Penyemprot yangdigunakan untuk ellagitanin adalah reagenvanillin/HCL dan reagen NaNO 2 (Harbone, 1996;FAO/IAEA, 2000).Reagen vanillin/HCL dibuat dengan melarutkan 1gram vanillin ke dalam 10 ml HCL 12 M. Setelahdibuat, hendaknya reagen ini langsung digunakankarena sifatnya yang tidak dapat bertahan lama.Jika disemprotkan ke spot ellagitanin, akan munculwarna merah. Reagen NaNO 2 dibuat denganmelarutkan 20 mg NaNO 2 dan beberapa tetes asamasetat glasial dalam 10 ml akuades yang telahdidinginkan sampai mendekati titik beku. Untukmengkondisikan lingkungan yang mendekati 0 0 Cdapat digunakan nitrogen cair. Spot ellagitanin akanmemberikan warna merah kecoklatan jika disemprotdengan reagen NaNO 2 (FAO/IAEA, 2000).Analisis kuantitatif, sebagai lanjutan dariprosedur di atas, pun memanfaatkan prinsip yang
Page 1 and 2: Biofarmasi 1 (1): 25-38, Pebruari 2
Page 3: HERNAWAN dan SETYAWAN - Ellagitanin
Page 7 and 8: HERNAWAN dan SETYAWAN - Ellagitanin
Page 9 and 10: HERNAWAN dan SETYAWAN - Ellagitanin
Page 14: 38Biofarmasi 1 (1): 25-38, Pebruari

REVIEW: Ellagitanin; Biosintesis, Isolasi, dan Aktivitas Biologi

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?