LA TECNOLOGIA del DNA RICOMBINANTE

LA TECNOLOGIA del
DNA RICOMBINANTE

1
2
3
Rappresentazione schematica del clonaggio (I)
DNA SORGENTE
DNA BERSAGLIO
VETTORE DI
CLONAZIONE
frammentazione enzimatica linearizzazione enzimatica
congiungimento DNA bersagliovettore
di clonazione

introduzione del DNA nella
cellula ospite (trasformazione) e
isolamento delle cellule con il
gene clonato
proteina codificata
dal gene clonato
cellula ospite
Produzione della
proteina
dal gene clonato
tutto ciò è possibile… grazie alla scoperta delle endonucleasi di restrizione

EcoRI
EcoRI
SITO DI
RICONOSCIMENTO
5’- GAATTC - 3’
3’- CTTAAG – 5’
Le Endonucleasi di Restrizione (I)
Enzimi batterici: endonucleasi di TIPO II:
- Riconoscono e tagliano corte sequenze di DNA
(4-8bp);
- le sequenze riconosciute sono palindromiche,
cioè risultano ugluali se lette su ogni filamento
nella stessa direzione
- il taglio produce estremità piatte o coesive
Esempio di una delle prime endonucleasi di tipo II meglio caratterizzate:
genere:
Escherichia
EcoRI
specie:
Coli
ceppo:
R
Ordine di caratterizzazione di
diverse endonucleasi
appartenente allo stesso
organismo (I)
OH P
5’- G AATTC - 3’
PRODOTTI FORMAZIONE
3’- CTTAA G – 5’ DI ESTREMITÀ
COESIVE
P
OH

Le Endonucleasi di Restrizione (II)
Enzima
EcoR I
BamH I
Hind III
KPN I
NOT I
EcoR V
Xho I
Sito di riconoscimento
G A A T T C
C T T A A G
G G A T C C
C C T A G G
A A G C T T
T T C G A A
G G T A C C
C C A T G G
G C G G C C G C
C G C C G G C G
G A T A T C
C T A T A G
C T C G A G
G A G C T C

…grazie alla scoperta delle endonucleasi di restrizione…
Le librerie geniche: collezione di cloni derivante dalla totalità di DNA estratto da un organismo e
digerito con un enzima di restrizione:
Le librerie genomiche: composta dalla totalità del DNA cromosomico di un organismo (es: se si vuole
studiare l’organizzazione genica);
Le librerie di cDNA: composta dall’mRNA di una cellula o di un tessuto in un particolare momento (es:
studiare il profilo di espressione di una particolare proteina in u particolare momento o tessuto)
Confronto tra I principali passaggi richiesti per la costruzione di librerie genomiche e di cDNA
1 Libreria genomica
Libreria di cDNA 1
2
3
4
Estrazione del DNA
cromosomico
Taglio del DNA con
endonucleasi di restrizione
(digestione parziale o totale)
Inserimento di ogni frammento
di DNA in un vettore
5
Trasformazione batterica
Estrazione dell’mRNA 2
Produzione di cDNA
(trascrittasi inversa)
Inserimento di ogni cDNA
in un vettore
3
4

Estremità piatte
Esempio: HaeIII (da Haemophilus
parainfluenzae)
La sequenza di DNA in doppia elica:
5’-NNNNGGCCNNNN-3’
3’-NNNNCCGGNNNN-5’
viene tagliata nel seguente modo:
5’-NNNNGG pCCNNNN-3’
3’-NNNNCCp GGNNNN-5’
Estremità coesive
Esempio: EcoRI
La sequenza di DNA in doppia elica:
5’-NNNNGAATTCNNNN-3’
3’-NNNNCTTAAGNNNN-5’
viene tagliata nel seguente modo:
5’-NNNNG pAATTCNNNN-3’
3’-NNNNCTTAAp GNNNN-5’

Rappresentazione schematica del clonaggio (II) - estremità coesive
reannealing
annealing
Gli appaiamenti (annealing-reannealing) sono transitori a causa della debolezza dei legami a
idrogeno tra il numero ridotto di basi a livello delle estremità coesive. Questi legami vengono
stabilizzati grazie all’uso dell’enzima DNA LIGASI in un processo noto con il nome di ligazione.
Enzima T4 DNA ligasi (isolato dal batteriofago T4) forma legami covalenti tra il gruppo fosfato 5’
di una estremità e il gruppo 3’ OH della catena adiacente. L’enzima lavora a 10°C e richiede ATP.

Rappresentazione schematica del clonaggio (III) - estremità coesive
gene per resistenza
ad antibiotico
GATCC
GG
BAMH1
plasmide
CTTAA
G
CCTAG
BAMH1
ECOR1
reannealing
G
AATTC
Siti di
restrizione
ECOR1
estremità coesive
G
CCTAG
Siti di
restrizione
BAMH1 ECOR1
GATCC
G
BAMH1
ECOR1
G
CTTAA
Ibridazione delle
estremità e ligazione
DNA estraneo
annealing
AATTC
G

Vettori per il clonaggio (I)
Per clonare una qualsiasi molecola di DNA è necessario inserirla in un vettore per il clonaggio.
Questi elementi di DNA possono essere mantenuti e propagati in un organismo ospite in cui il
vettore possa replicarsi. Un tipico ospite è Escherichia Coli che cresce e si divide rapidamente.
Qualsiasi vettore con un origine di replicazione adatta si replica con successo in E.Coli
(assieme al DNA inserito). Quindi, qualsiasi DNA inserito in un vettore può essere amplificato
(se ne possono produrre quantità illimitate) e usato per successive analisi
Isolamento di un clone mediante
screening della libreria
Libreria genica: ogni vettore
contiene un frammento diverso di
DNA estraneo
Amplificazione
del singolo clone

Vettori per il clonaggio (II)
- SONO STATI SVILUPPATI DA MOLECOLE PRESENTI IN NATURA (PLASMIDI BATTERICI, BATTERIOFAGI) O
COMBINAZIONE DEGLI ELEMENTI CHE LI COMPONGONO (COSMIDI).
Plasmidi (i)
• DNA extracromosomico circolare di piccole dimensioni presente in molti batteri che conferisce
resistenza a antibiotici, capacità di metabolizzare substrati e capacità di coniugazione.
• anni ’70: alcuni di questi vettori sono stati modificati in laboratorio (digestioni e successive ligazioni)
per costruire vettori di clonaggio (es: pBR322 da Bolivar e Rodriguez);
• un plasmide artificiale è molto più piccolo di quello naturale e viene più facilmente inserito nei batteri
nel processo noto come trasformazione;
• un origine di replicazione del DNA di tipo batterico cosicchè il DNA può essere replicato dalla cellula
ospite
• plasmidi come pBR322 hanno un origine di replicazione rilassata, che non segue cioè la divisione
cellulare, in modo che la replicazione del plasmide è molto più frequente di quella cromosomica. In
questo modo ogni cellula produce molte molecole di plasmide.
• introdotti geni che codificano per la rsistenza agli antibiotici
•
•in vari punti del plasmide ci sono siti singoli di riconoscimento per una serie di enzimi di restrizione.

Vettori derivati da virus (I)
- Per inserti lunghi (più di 5kb) si usano vettori derivanti dal batteriofago λ in quanto offrono una
efficienza di clonaggio superiore di circa 15 volte rispetto ai vettori plasmidici;
- il batteriofago λ è un fago con DNA lieare a doppia elica, lungo circa 50 kb in grado di infettare E.Coli,
inserendogli il proprio DNA attraverso la membrana cellulare
- il DNA del fago λ può replicarsi secondo due modalità:
1. si integra nel cromosoma di E. Coli dove resta quiesciente fino a quando un segnale ne
promuove l’escissione (ciclo lisogenico)
2. si replica aapena infetta la cellula, sintetizza le proteine della testa e della coda, si
formano nuove particelle fagiche (ciclo litico)

coda
Vettori derivati da virus (II)
DNA
testa
I fagi sono stati utilizzati per la costruzione di librerie geniche perchè hanno permesso di introdurre
frammenti più grandi di DNA rispetto ai plasmidi. Il DNA del batteriofago è lungo circa 50 kb,
approssimativamente 20 dei quali risultano indispensabili agli eventi di integrazione-escissione (I/E). Per
formare le genoteche si è ragionato sulla possibilità di sostituire queste 20 kb con altrettante kb di DNA
clonato. Una simile molecola di DNA si potrebbe perpetuare sotto forma di batteriofago “ricombinante”
tramite cicli litici forzosi.

Cosmidi
Possono trasportare 40 kb di DNA clonato e possono essere mantenuti come plasmidi in E. Coli.
Vector system Host cell Insert capacity (kb)
Plasmid E. coli 0.1-10
Bacteriophage l E. coli 10-20
Cosmid E. coli 35-45
Bacteriophage P1 E. coli 80-100
BAC (bacterial artificial
chromosome)
P1 bacteriophage-derived
AC
Vettori di clonaggio
E. coli 50-300
E. coli 100-300
YAC Yeast 100-2,000

TRASFORMAZIONE: assunzione di DNA da parte di un organismo
1970: Mandel and Higa osservarono che batteri, trattati con soluzioni di
CaCl 2 e riscaldati velocemente, potevano essere trasformati con DNA del
batteriofago _ quindi questo trattamento conferiva ai batteri un transiente
stato di “competenza”
COMPETENZA: capacità di assumere DNA
Efficienza di trasformazione = numero di colonie/ microgrammo di DNA
trasformato
Nel corso degli anni sono stati fatti diversi tentativi per migliorare
l’efficienza di trasformazione. Le due tecniche maggiormente utilizzate oggi
sono:
Elettroporazione
Trasformazione con CaCl 2
La trasformazione (II)

Trasformazione Per Elettroporazione
Le cellule batteriche unite
al DNA vengono sottoposte
ad una veloce scarica
elettrica che permette la
formazione di “elettropori”
che favoriscono l’entrata di
DNA.
Competenza: 10 8 -10 10 cellule
trasformate /µg di DNA

Crescita di un ceppo E.Coli in
terreno ricco di nutrienti.
Le cellule si raccolgono quando
sono in fase logaritmica
Trasformazione in CaCl 2

I cationi divalenti schermano le cariche negative sul DNA (dei gruppi fosfato)
La combinazione di bassa temperatura e di cationi divalenti può aiutare a cristallizzare
regioni della membrana rendendo più accessibili i canali di assunzione del DNA

Sommario delle fasi importanti nella clonazione del DNA
1. Vettore plasmidico e DNA esogeno da inserire devono avere estremità
compatibili. I due “pezzi” di DNA sono fusi creando molecole di DNA
ricombinante;
2. Introduzione del DNA in cellule batteriche ospiti idonee (trasformazione)
3. Selezione delle cellule resistenti all’antibiotico e selezione dei cloni che
hanno assunto il DNA ricombinante

gene di
interesse
BamHI EcoRI
VETTORE I
Secondo esempio di clonaggio

Turno laboratorio Biol Sperimentale IIIA,
previsto per 8-16 gennaio
Si svolgerà invece dal
27 gennaio al 4 febbraio

Proprietà dei vettori di clonaggio
Properties of a good vector:
minimal size
origin of replication
high yield of DNA
dominant selectable markers (e.g. AMP)
lots of useful restriction sites (polylinker)
selection/screen for inserts (e.g. blue/white)
inducible or high level expression (e.g. lac, T7)

Come esprimete questo gene nei batteri?
The red boxes represent exons,
the blue boxes represent the introns, and
the grey boxes represent the 5’ and 3’ UTRs
Insert only the ORF: into an expression vector
that contains prokaryotic transcriptional and
translational regulatory sequences

Prokaryotes vs eukaryotes: key points
Prokaryotes Eukaryotes
Operons
(functional grouping)
Polycistronic mRNAs
(single mRNA, multiple ORFs)
No splicing
Regulatory sequences lie near
(~100 bp) the start site
Translation is concurrent with
transcription
Moncistronic RNAs
(One mRNA, one protein)
Ribosome scanning
Often spliced
Regulatory sequences can be far
(>1 kb) from the start site
RNA processing is concurrent with
transcription; translation occurs in a
separate compartment

Implicazioni pratiche dei fondamenti
dell’espressione genica
1. Prokaryotic and eukaryotic promoters and translation signals are
different...they are not exchangeable.
You therefore can’t simply put a eukaryotic promoter into bacteria
and expect it to function.
2. Processing also presents a problem for bacterial expression of human
mRNAs.
The eukaryotic ORF must be cloned into the expression vector,
not the genomic copy.
3. The genetic code is identical for most bacterial and eukaryotic mRNAs.
Although the code is the same, expression levels can be affected
by codon frequency, which varies between organisms and
transcripts.
4. Post-translational modifications can be important for protein function.
Those modifications might not occur in bacteria. The
solution…try expressing in a eukaryotic expression system (viral,
baculovirus, yeast).

1. Ibridazione su colonia del DNA
Screening di librerie geniche

Screening libraries
Libraries can be screened for specific DNA sequences
in different ways:
1. screen for specific sequences by hybridization with
labelled DNA or oligo or RNA probes
2. screen or select for biological activity in vivo

Screening una libreria per attività in vivo

Ibridazione
Ibridazione- sfrutta una
caratteristica del DNA
duplex –
complementarità di
sequenza dei due strand
DNA può riassemblarsi
con estrema precisione
Strands possono essere
separati (denaturati) dal
calore

Hybridisation
• I due strand di DNA sono complementari l’uno all’altro.
• The mRNA synthesized from a gene is identical to one strand of the
DNA and complementary to the other.
• Complementary strands could be separated (denaturation) and when
allowed to rejoin (renaturation) do so with high degree of specificity
forming DNA-DNA, DNA-RNA, or RNA-RNA hybrids.
Methods developed on these properties:
• Southern blot: Hybridization of DNA to DNA (solid/solution).
• Northern blot: Hybridization of DNA to RNA (solid/solution).
• RNAse protection assay: Hybridization of RNA to RNA (solution).
• In situ hybridisation: DNA-DNA or DNA-RNA (tissue section, cells)

DNA Hybridization
ssDNA probe is used to find DNA or RNA with a
homologous sequence.
This will tell us if a specific sequence is present
The substrate with the genetic material in question is
fixed on a membrane
Small drops of a known sequence of DNA with a
radioactive or fluorescent marker is added (PROBE)
The plate is rinsed and read in the proper instrument

Probing DNA
One way to study a specific DNA fragment within a
genome is to probe for the sequence of the fragment
A probe is a labeled (usually radioactive or fluorescent)
single-stranded oligonucleotide, synthesized to be
complementary to the sequence of interest – probe
sequence is known
Attach single-stranded DNA to a membrane (or other solid
support) and incubate with the probe so that it hybridizes
Visualize the probe (e.g. by X-ray for radioactive probes)

Ibridazione del DNA: metodi di marcatura
Nicks translation
E’ il metodo più comune per marcare il DNA anche se il termine
translation può generare qualche confusione: non c’entra nulla
con la “traduzione” dell’RNA messaggero nella catena
polipeptidica.
Tale metodo consta dei seguenti passaggi:
1. sono introdotte delle rotture della doppia elica di DNA
utilizzando l’enzima DNAasi I che produce frammentazioni
casuali nelle eliche
2. Questo danno viene quindi riparato sfruttando l’enzima DNA
polimerasi I in presenza di nucleotidi liberi marcati
3. Tali nucleotidi sono incorporati nel DNA che risulta così
marcato
Il numero di nucleotidi marcati incorporati è proporzionale al
tempo nel quale la reazione viene proseguita.

End labelling
Ibridazione del DNA: metodi di marcatura
La marcatura è attaccata alla parte terminale sia 3’ che 5’ sia di
DNA che di RNA.
L’enzima polinucleotide chinasi viene utilizzato per catalizzare il
trasferimento di un gruppo fosfato marcato alla terminazione 5’
di una catena nucleotidica.
La sensibilità è minore poiché la marcatura è limitata alle
terminazioni della sonda.

Condizioni dell’ibridazione
Quali sono le condizioni che aumentano la specificità del legame tra le
due porzioni a singola elica degli acidi nucleici?
Il fattore principale che determina la specificità è la capacità di formare
legami di idrogeno, che a sua volta dipende da 4 fattori esterni:
• Temperatura
• pH
• Forza salina
• Presenza di denaturanti
Gli acidi nucleici possono tollerare un certo grado di copie non
complementari e formare comunque una doppia elica. comunque
maggiori sono le coppie sbagliate e minore è la stabilità della doppia
elica che tenderà pertanto a denaturarsi. Quindi si possono variare le
condizioni operative per verificare la percentuale di complementarità tra
le basi.
Da tali fattori dipende il grado di non complementarità tollerato e quindi
la specificità di una sonda

fattori
temperatura
pH
conc. salina
denaturanti
tolleranza
Specificità delle sonde
↓ specificità
basse T
neutro
alta
bassa
alta
↑ specificità
alte T
estremi
bassa/nulla
alta
bassa
Dei quattro fattori la temperatura è quello che può essere
modificato con maggiore facilità e viene usato per saggiare la
specificità di una sonda.
Non è sempre auspicabile un’elevata specificità. Ad esempio
una sonda per il batterio Campylobacter jejuni riconoscera
solo tale batterio in condizioni di elevata specificità, mentre
riconoscerà qualsiasi Campylobacter diminuendo la specificità.

La lunghezza delle sonde
Oligonucleotidi corti hanno una lunghezza di 10-50 basi, mentre
sonde lunghe hanno una lunghezza di qualche centinaio di basi.
In condizioni ottimali di alta selettività una sonda dovrebbe
essere capace di individuare il cambio di una coppia di basi in
una sequenza nucleotidica.
Le sonde brevi hanno i seguenti vantaggi:
• più stabili nel tempo
• più semplici da ottenere
• ibridizzano più rapidamente (t < 30 min.)
ed hanno i seguenti svantaggi:
• la quantità di marcatura è minore
• la sensibilità è minore

Applicazioni dell’ibridazione
Identificazione di specifiche sequenze nucleotidiche
La ricerca di tali sequenze può essere utilizzata per
diagnosticare la presenza di un particolare microrganismo che
possiede una sequenza nucleotidica caratteristica. In tal modo
è possibile diagnosticare un infezione determinata da vari
agenti, quali batteri, protozoi e batteri. Tale metodo risulta
particolarmente utile per:
• microrganismi che crescono lentamente
• microrganismi che non si possono coltivare artificialmente
Gli svantaggi sono:
• non vengono differenziate cellule vive e morte
• è difficile trovare sequenze uniche e caratteristiche di un
determinato micro organismo.

Applicazioni dell’ibridazione
Identificazione di mutazioni in sequenze
nucleotidiche
La ricerca di tali mutazioni può essere utilizzata per
diagnosticare malattie ereditarie anche se molto spesso una
malattia può essere indotta da più di una patologia. Per
questo è necessario utilizzare sonde con bassa specificità o più
sonde contemporaneamente. Tra le patologie diagnosticabili
ricordiamo: fibrosi cistica, distrofia muscolare, fenilchetonuria
e anemia.
Identificazione dell’impronta genica
Può essere utilizzata per determinare l’identità di una persona
e viene usata nelle ricerche giudiziarie per confermare i
sospetti su una persona o nei tests di paternità

Ibridazione del DNA: mescolare target e sonda
Su supporto solido (Dot blot)
La sequenza target è legata ad un supporto solido come un filtro
da membrana e la sonda è aggiunta in soluzione: dopo lavaggio
per rimuovere la sonda libera l’ibridazione viene rilevata sul
supporto solido utilizzando il metodo più appropriato a seconda
della marcatura.
In soluzione
Sia il target che la sonda sono liberi di muoversi così da
massimizzare le opportunità di reazione: in tale modo la velocità
di reazione è massima.
In situ
Con questo metodo la sonda in soluzione è aggiunta ad un
preparato microbiologico o citologico che viene esaminato al
microscopio. La sonda produce una variazione visibile nel
campione se il target viene ibridizzato. La sensibilità e bassa, è
utile per la ricerca di microrganismi in un campione.

1. Ibridazione su colonia del DNA
Piastra
madre
o si piastrano cellule provenienti
dalla reazione di trasformazione
su terreno con antibiotico
Screening di librerie geniche
Trasferimento cellule o ciascuna colonia formatasi sulla
piastra madre, si trasferisce un
campione su una matrice solida
Subcultura della cellule
dalle colonie positive
provenienti dalla piastra madre
matrice
Incubazione con la sonda di DNA
complementare al DNA di interesse.
Lavaggi che eliminano la sonda non legata.
Autoradiografia che rivela i cloni
identificati con la sonda
(membrana di nylon o nitrocellulosa)
si lisano le cellule della matrice
e si denatura il DNA liberato,
deproteinizzandolo e legandolo
irreversibilmente alla matrice

Tipi di Blot
Southern Blot – DNA to probe DNA
Northern Blot – DNA to probe RNA
Western Blot – anticorpi to probe Protein

Southern Blot – DNA
DNA is
1. extracted from cells,
2. digested with a restriction enzyme
3. loaded into wells and run like a gel electrophoresis, in
solutions that are optimized for DNA.
The DNA is then transferred out of the gel onto a
membrane (nitrocellulose), radioactive DNA is then
added, and the activity is read or staining is used.

The Southern blotting procedure

The Southern blotting technique

Southern Blot Results

Northern blot – RNA
RNA is extracted from cells, and is
loaded into wells and run like a gel
electrophoresis, in solutions that
are optimized for RNA. The RNA
is then transferred out of the gel
onto a membrane (nitrocellulose or
other), and probed with radioactive
RNA or DNA and the activity is
read or staining is used.