caratterizzazione fisiologica e molecolare di lieviti apiculati d ...

CARATTERIZZAZIONE FISIOLOGICA E MOLECOLARE
DI LIEVITI APICULATI D’INTERESSE ENOLOGICO
Giuseppe COMI
Dipartimento di Scienze degli Alimenti, Facoltà di Agraria, Università degli Studi di Udine, Via
Marangoni, 97, 33100 Udine,I.
E-mail: giuseppe.comi@uniud.it
Parole chiave: lieviti apiculati, caratterizzazione, metodi tradizionali, metodi molecolari.
Key-words: Apiculate yeasts, characterization, traditional methods, molecular methods.
1. INTRODUZIONE
I lieviti sono microrganismi ampiamente distribuiti in natura e nei più disparati
substrati alimentari, quali carni, formaggi e latte, vegetali, frutta e in particolare sull’uva.
Pasteur aveva osservato che la polpa dell’uva, prelevata in asepsi, e i frutti immaturi
erano privi di lieviti. Questi, infatti, possono essere osservati solo sulla buccia a
maturazione avvenuta. Successivamente, grazie all’utilizzo del microscopio a scansione,
si è potuto osservare che i lieviti sono localizzati sulle lenticelle e sugli stomi; in queste
sedi essi formano microcolonie sfruttando le sostanze zuccherine fuoriuscite tramite
soluzioni di continuità. Sulla bacca si possono trovare, oltre ai lieviti alcolici, anche
blastomiceti ossidanti, batteri acetici, batteri lattici e muffe.
Quando si osserva la flora blastomicetica di mosti in fermentazione, ci si accorge
che questa cambia con il procedere del processo fermentativo (Comi, Traldi, 1982;
Delfini, 1995; Zambonelli, 2005); già De Rossi (cit. Castelli, 1969) stabilì che i lieviti
devono essere isolati dai mosti in tre fasi successive e precisamente dopo la pigiatura,
durante la fermentazione tumultuosa ed alla fine del processo fermentativo. I lieviti
isolati nelle tre fasi in questo studio, poi confermati da diversi autori, sono i seguenti:
Kloeckera apiculata, Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora rosei, Saccharomyces
bayanus, Metschnikowia pulcherrima, Kloeckera magna e Candida stellata.
Suddividendo i lieviti in sporigeni ed asporigeni si è notato che nei mosti di Paesi
a clima caldo predominano gli sporigeni, in quelli a clima freddo gli asporigeni: infatti
il genere Kloeckera, asporigeno, presente soprattutto nei mosti del nord, viene sostituito
nei mosti del sud dal genere Hanseniaspora, sporigeno. Castelli (1969) ha dimostrato
che tale cambiamento è proprio dovuto al clima; infatti ha notato che in zone di alta
collina del sud predominano i ceppi asporigeni, come anche in zone a clima temperato:
quindi, in queste località, nella prima fase della fermentazione si sviluppano Kloeckera
spp. e solo in un secondo tempo Saccharomyces cerevisiae (Romano et al., 1992; 1993;
1997; Zironi et al., 1993; Esteve-Zarzoso et al., 2001; Comi et al., 1997; 2001; Zohre,
QUAD. VITIC. ENOL. UNIV. TORINO, 30, 2008

84
Erten, 2002; Cocolin et al., 2002; 2004; Manzano et al., 2004). Inoltre nei mosti ottenuti
da uve botritizzate si possono trovare anche concentrazioni notevoli di Candida stellata,
mentre in vini giovani, in particolare in bianchi, possono essere isolati
Schizosaccharomyces pombe e Saccharomyces bayanus (Cocolin et al., 2002; 2004).
È comunque opinione condivisa che la stragrande maggioranza dei lieviti implicati
nei processi fermentativi provengano dalle cantine e dalle attrezzature enologiche
piuttosto che dalle uve. Si è di fatto notato che in cantine di nuova costruzione il mosto
fatica ad entrare in fermentazione, appunto perché l’ambiente non è sufficientemente
contaminato da lieviti fermentanti.
La popolazione blastomicetica dei mosti e dei vini è ampiamente rappresentata da
lieviti buoni fermentatori e da lieviti ossidanti: questi ultimi compaiono principalmente
ad inizio fermentazione ed appartengono ai generi Pichia, Hansenula, Candida e
Brettanomyces (Comi, Traldi, 1982; Romano et al., 1992; 1993; 1997; Zironi et al., 1993;
Cocolin et al., 2004).
Ora, vista l’ampia diffusione dei lieviti in cantina ed in alcuni casi anche sulle bacche,
i microbiologi hanno effettuato una selezione in funzione delle specie, indirizzando la loro
attenzione su quelle che presentano caratteri ritenuti industrialmente utili e vantaggiosi,
quindi verso Saccharomyces cerevisiae e S. bayanus, Schizosaccharomyces pombe e
Torulaspora rosei. Naturalmente alcune specie, benché isolate nelle cantine e presenti
nei mosti, non hanno finora dimostrato un grande interesse dal punto di vista enologico
(Kloeckera apiculata), mentre altri sono tuttora oggetto di studio (Schizosaccharomyces
pombe).
1.1.I lieviti apiculati
G. COMI
Il processo di vinificazione è il risultato di una complessa interazione tra diversi
gruppi microbici.
Gli studi effettuati hanno dimostrato che nel processo fermentativo possono
intervenire diverse specie di lieviti indigeni (Fleet et al., 1984; Heard, Fleet, 1986).
Nelle prime fasi delle fermentazioni spontanee, prendono il sopravvento lieviti apiculati,
quali Kloeckera apiculata, Hanseniaspora guilliermondii, ed altre specie quali
Candida stellata, Hansenula spp., Torulaspora delbrueckii, e solo in un secondo tempo
si ha l’intervento della specie Saccharomyces cerevisiae. Infatti, con il procedere della
fermentazione gli apiculati soccombono e lasciano che S. cerevisiae la domini e la
completi. Tali cambiamenti sono stati osservati durante le fermentazioni spontanee in
ogni parte del mondo (Fleet, 1989; Herraiz et al., 1990; Fregoni et al., 2004; Ribéreau-
Gayon et al., 2004; Comi et al., 2005).
Tuttavia la presenza di Kloeckera apiculata, Hanseniaspora guilliermondii ed
Hanseniaspora uvarum, come già accennato, parrebbe legata alle condizioni climatiche
della zona di vinificazione; è noto, infatti, che Kloeckera spp. è presente principalmente

LIEVITI APICULATI D’INTERESSE ENOLOGICO 85
in mosti di zone fredde, viceversa Hanseniaspora spp. in mosti di zone a clima
mediterraneo. In Italia, infatti, Kloeckera spp. viene isolata dalle uve del Nord, viceversa
Hanseniaspora spp. viene isolata da uve provenienti da aree meridionali.
Inizialmente la concentrazione di questi lieviti non-saccaromicetici nel mosto non
supera mai le 10 4 -10 5 UFC mL -1 ; poi durante lo sviluppo la loro concentrazione può
raggiungere valori compresi tra le 10 6 e le 10 8 UFC mL -1 . Quindi, a causa dell’incremento
della concentrazione dell’alcool e della competizione operata da Saccharomyces spp.,
gli apiculati decrescono fino a scomparire entro la prima settimana di fermentazione
(Fregoni et al., 2004; Ribéreau-Gayon et al., 2004; Comi et al., 2005). Tuttavia il loro
intervento può risultare significativo nella produzione dell’aroma e della composizione
chimica del vino (Romano et al., 1993; 1997; Comi et al., 2001). Infatti è ormai
riconosciuto che la produzione dei circa 400 componenti volatili del vino è imputabile
allo sviluppo in associazione di varie specie levuliformi e non solo alla specie
Saccharomyces cerevisiae (Lafon-Lafourcade, Riberéau-Gayon,1984). Del resto la
natura e la concentrazione dei composti volatili e non-volatili presenti in ogni tipo di
produzione vinaria dipende non solo dai parametri chimico-fisici (temperatura, pH,
composizione dei mosti), ma anche e soprattutto dallo sviluppo, dalla persistenza e
dalla prevalenza ora dell’una, ora dell’altra specie microbica (Kunkee, Amerine, 1970;
Lafon-Lafourcade, Riberéau-Gayon, 1984; Romano et al., 1993;1997; Comi et al., 2001):
lo sviluppo, infatti, di Kloeckera apiculata e Torulaspora delbrueckii prima del S. cerevisiae
incrementa la concentrazione dei componenti volatili nei vini (Herraiz et al., 1990).
Per questi motivi, negli anni, si è diffusa la tecnica di inoculare ceppi di lieviti buoni
fermentatori (Saccharomyces cerevisiae e/o S. bayanus) nel mosto ai fini di operare
fermentazioni in purezza, che permettano di ottenere vini di qualità. Indubbiamente
l’uso di ceppi starters permette ai vinificatori di migliorare la produzione, canalizzando
l’andamento della fermentazione; i ceppi maggiormente utilizzati appartengono alle
specie Saccharomyces cerevisiae e S. bayanus che, una volta inoculati nel mosto, si
presuppone siano in grado di prendere rapidamente il sopravvento sui lieviti indigeni
e sugli apiculati in particolare.
Invece spesso accade che ceppi indigeni, quali Candida spp. e Kloeckera spp.
continuino a svilupparsi normalmente, nonostante gli inoculi di 10 6 -10 7 UFC mL -1 di
ceppi starters attivati: i non-saccaromicetici, sviluppandosi, possono comunque portare
il loro contributo alla fermentazione. Solo dopo 3-4 giorni di fermentazione il ceppo
inoculato prende definitivamente il sopravvento. Inoltre, anche gli stessi Saccharomyces
indigeni continuano indisturbati la loro crescita.
L’uso di inoculi con ceppi marcati geneticamente o distinguibili all’analisi elettroforetica
ha dimostrato che questi ceppi starters non dominano completamente la
fermentazione (Delteil, Aizac, 1988) e gli apiculati continuano a fermentare per diversi
giorni; da ciò deriva che difficilmente si riesce ad operare una fermentazione in purezza
se non si usano mosti trattati con SO 2 o filtrati. L’uso degli stessi lieviti killer non è
sufficiente ad impedire lo sviluppo dei lieviti indigeni: quindi, nonostante l’impiego

86
G. COMI
degli starters, gli apiculati riescono a dare un contributo fondamentale alle fermentazioni.
La temperatura regola lo sviluppo dei microrganismi, per cui risulta molto importante
il suo controllo durante la fermentazione: attualmente è possibile operare con tecnologie
che permettono di regolare la temperatura di ogni punto della massa fermentativa.
In colture miste l’impiego di temperature idonee può favorire lo sviluppo e la
predominanza ora dell’una, ora dell’altra specie: in particolare, temperature inferiori
ai 20 °C favoriscono lo sviluppo dei non-saccaromiceti (Heard, Fleet, 1988a, b). A questa
temperatura la fermentazione sembra essere dominata da K. apiculata e S. cerevisiae
(Heard, Fleet, 1988a, b) mentre a 10 °C, K. apiculata può prendere addirittura il
sopravvento su Saccharomyces (Fleet, 1989). La stessa resistenza all’etanolo è incrementata
in K. apiculata e Candida stellata a temperature comprese tra i 10 ed i 20 °C (Gao,
Fleet, 1988; Heard, Fleet, 1988a, b); cellule di K. apiculata tollerano il 10-12,5 % di
alcol a 15 °C, ma non a 10 °C e 30 °C (Gao, Fleet, 1988), mentre C. stellata tollera il
12,5 % di alcol a 10-l5 °C, ma non a 30 °C. Gli stessi S. cerevisiae manifestano un’alta
resistenza all’etanolo a temperature inferiori ai 20 °C, ma a temperature superiori la loro
resistenza diminuisce (Gao, Fleet, 1988).
Una delle ragioni principali dell’aggiunta di SO 2 ai mosti è la limitazione dello
sviluppo dei lieviti indigeni; nelle fermentazioni naturali, infatti, l’assenza di tale
composto favorisce lo sviluppo dei lieviti indigeni saccaromicetici, apiculati e filmogeni:
la dominanza dei primi viene ottenuta solo dopo una settimana di fermentazione.
Nel caso di mosti fermentati con starters risulta quasi d’obbligo l’impiego di diossido
di zolfo. Infatti si tende a considerare che questo sopprima sia Saccharomyces indigeni,
sia i lieviti apiculati e filmogeni. Tuttavia, spesso le sperimentazioni hanno dimostrato
che l’SO 2 non sempre ha effetto sui lieviti indigeni (Fleet, 1989), nonostante alcuni
ricercatori sostengano che la composizione aromatica e la qualità dei vini prodotti con
mosti addizionati di tale composto sia simile a quella di vini fermentati in presenza di
soli Saccharomyces (Herraiz et al., 1989).
In mosti rossi la concentrazione di 100 ppm di SO 2 non inibisce la crescita di
K. apiculata (Fleet, 1989), mentre in mosti bianchi 50 ppm di SO 2 sono sufficienti ad
inibire questo lievito (Heard, Fleet, 1988b). In ogni caso, lo sviluppo dei non-saccaromiceti
risulta lievemente rallentato dalla presenza di SO 2 : tale rallentamento è correlato alla
concentrazione dell’inibente e risulta più marcato per le specie Candida rispetto a
Kloeckera ed a Torulaspora.
Naturalmente il limitato sviluppo dei non-saccaromiceti si ripercuote anche sulla
composizione dei componenti, volatili e non, dei vini: è stato infatti osservato che vini
fermentati con associazioni di K. apiculata, Torulaspora delbrueckii e S. cerevisiae
contenevano una frazione volatile quantitativamente superiore rispetto a quella di vini
fermentati con solo S. cerevisiae (Herraiz et al., 1989; 1990).
Inoltre nel mosto l’attività di lieviti apiculati o non-saccaromiceti è favorita in parte
anche dalla loro potenziale capacità di produrre il cosiddetto fattore Killer (K+), glicoproteina
o proteina molto efficace nei confronti di un gran numero di Saccharomyces

LIEVITI APICULATI D’INTERESSE ENOLOGICO 87
spp. sia di origine naturale che di starter selezionati del commercio. È ormai conosciuta
l’esistenza di lieviti killer, appartenenti a varie specie presenti nei mosti in fermentazione
(Heard et al., 1987); gli stessi lieviti starter del commercio possono contenere il fattore
killer oppure il fattore che induce resistenza (R+) ai ceppi killer. Tuttavia la specificità
della tossina killer di tali ceppi è tale da non produrre significative mutazioni nella
flora microbica naturale di un mosto (Heard, Fleet, 1987), per cui questi lieviti K+ non
hanno un grande effetto sui ceppi apiculati del mezzo. Del resto l’azione della PK
(Proteina Killer) è così specifica che il bersaglio può essere rappresentato da un solo
ceppo, ma mai da un’intera specie o genere, anche se i lieviti K+ del commercio, essendo
selezionati, possono avere un ampio spettro d’azione. Infatti è stato dimostrato come
l’inoculo di alcuni ceppi starter costituiti da S. cerevisiae K+ abbia inattivato la maggior
parte della flora indigena, anche se secondo alcuni autori l’uso di ceppi selezionati
produttori del fattore K+ può essere inutile, essendo alta la concentrazione dei ceppi
indigeni nel mosto resistenti a tale fattore (Barre, Vezinhet, 1984).
Altri parametri che possono influenzare lo sviluppo dei lieviti apiculati sono la
composizione dei mosti (particolarmente importanti risultano la concentrazione degli
zuccheri e delle componenti azotate ed il pH del mezzo), la presenza di residui di
fungicidi e la popolazione microbica antagonista. È noto che a pH=3,0-3,5 a 25 °C S.
cerevisiae è il lievito dominante, mentre le altre specie, benché presenti, vengono inattivate
con il procedere della fermentazione (Heard et al., 1988a). Il pH non influenza
invece la resistenza all’alcol dei non-saccaromiceti: come abbiamo sopra riportato, è
solo la temperatura che incide sulla resistenza a questo composto (Gao et al., 1988).
In generale l’influenza dei fungicidi e della flora antagonista è poco conosciuta; è
noto tuttavia che alcuni fungicidi possono rallentare i processi fermentativi ed inattivare
gli apiculati nel mosto.
Infine sull’antagonismo dei batteri acetici si sa che Acetobacter aceti, A. pasteurianus
e Gluconobacter oxydans non inibiscono la crescita degli apiculati e di Saccharomyces
spp.; del resto la competizione è limitata principalmente alle fonti azotate e non a quelle
carboniche, per cui si potrebbe osservare solo un rallentamento dello sviluppo in fase
di latenza.
Di conseguenza gli apiculati e i non-saccaromiceti si sviluppano e fermentano
durante i primi stadi di fermentazione e in alcuni casi fino a concentrazione dell’alcol
pari al 5-6 %; valore limite per gran parte degli apiculati stessi.
I lieviti apiculati comprendono i generi: Kloeckera, Hanseniaspora e
Saccharomycodes (tab. 1). Sulle uve e nei mosti italiani sono presenti in particolare
Kloeckera apiculata, Hanseniaspora uvarum, H. guilliermondii e Saccharomycodes
ludvigii.
Le fermentazioni vinarie sono condotte da lieviti buoni fermentatori quali S. cerevisiae
e S. bayanus, lieviti naturalmente presenti nel mosto o addizionati intenzionalmente
come starter. Uno dei problemi principali di queste fermentazioni guidate è sapere se
effettivamente il lievito inoculato abbia preso il sopravvento sui lieviti indigeni e abbia

88
Tab. 1 - Principali specie di lieviti apiculati presenti nei mosti.
Kloeckera apiculata
Kloeckera magna
Hanseniaspora uvarum
Hanseniaspora guilliermondii
Hanseniaspora vinae
Saccharomycodes ludvigii
iniziato e portato a termine la fermentazione. A tale scopo sono stati prodotti e ottimizzati
numerosi metodi molecolari. Tali metodi, basati sullo studio del genoma, permettono di
identificare in ogni fase della fermentazione i ceppi che intervengono. Di conseguenza
permettono di identificare sia i ceppi “buoni fermentatori” sia ceppi di apiculati. Ora
ai fini fermentativi risulta più importante individuare i ceppi inoculati piuttosto che i ceppi
indigeni. Del resto la maggior parte dei metodi molecolari della letteratura identificano
prevalentemente ceppi di Saccharomyces spp. anche se per ottenere una completa
informazione sulle specie che intervengono in ogni stadio della fermentazione vinaria
risulta altrettanto importante la produzione e l’ottimizzazione di metodi molecolari in
grado di caratterizzare gli apiculati. A tal proposito, in questa sede, saranno citati metodi
tradizionali e non-convenzionali e/o molecolari per caratterizzare e tipizzare lieviti
apiculati direttamente o previo isolamento da mosti in fermentazione.
2. CARATTERIZZAZIONE DEI LIEVITI APICULATI
G. COMI
Gli apiculati vengono caratterizzati attraverso studi fenotipici e genotipici. I primi
si basano sullo studio delle caratteristiche morfologiche, fermentative e ossidative nei
confronti di composti organici quali zuccheri o acidi. I secondi si basano sull’analisi del
genoma attraverso studi del cariotipo, del DNA ribosomiale, del DNA mitocondriale e
delle impronte digitali (fingerprinting). In letteratura, ai fini ecologici o per definire la
diffusione delle diverse popolazioni di apiculati, vengono utilizzate una o più associazioni
di metodi molecolari.
Per tipizzare gli apiculati sono state usate: l’analisi del DNA ribosomiale, ottenuta
attraverso l’amplificazione di rDNA (sequence ITS-Internal transcribed spaces, NTSnon
transcribed spaces, domini D1/D2) e successiva restrizione degli ampliconi (PCR-
RFLP- Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Lenght Polymorphism); l’analisi
(cariotipo) di cromosomi interi o di cromosomi trattati con enzimi di restrizione, attraverso
PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis); l’amplificazione di frammenti di rDNA, e
successiva rilevazione degli ampliconi attraverso DGGE (Denaturing Gel Gradient

LIEVITI APICULATI D’INTERESSE ENOLOGICO 89
Electrophoresis) o TGGE (Temperature Gel Gradient Electrophoresis); la restrizione
del DNA mitocondriale (mt-DNA-RFLP); il fingerprinting basato sull’amplificazione
di sequenze ripetute di DNA o di microsatelliti o RAPD-PCR (Random Amplified
Polymorphic-DNA). L’impiego di tali tecniche permette di discriminare i lieviti apiculati
a livello intra e inter-specie, e di conoscere la diffusione in natura o in fermentazioni
delle diverse popolazioni.
I metodi di identificazione e caratterizzazione comprendono test tradizionali, sempre
coltura-dipendenti e molecolari, che possono essere coltura-indipendenti o dipendenti.
I metodi molecolari coltura-dipendenti o indipendenti vengono utilizzati per identificare
i microrganismi dopo isolamento o direttamente dal substrato. Per studi ecologici, di
popolazioni o per valutare la biodiversità intraspecifica, si utilizzano solo metodi
coltura-dipendenti.
2.1.Metodi tradizionali
I metodi tradizionali usati per identificare gli apiculati comprendono l’isolamento
in piastra, lo studio della morfologia, della capacità di produrre o meno le spore, i test
di fermentazione o di assimilazione: si riporta quindi un esempio di test da eseguire per
identificare alcune specie di Kloeckera e Hanseniaspora (tab. 2).
Tali test permettono la sola identificazione della specie e non del ceppo e di
conseguenza non sono utili ai fini di valutare la biodiversità microbica intraspecifica.
Sono utili ai fini ecologici per valutare le diverse specie che intervengono in un
substrato in fermentazione.
Tab. 2 - Test consigliati per identificare alcune specie di Kloeckera e Hanseniaspora.
Cellule a forma di limone
Kloeckera apiculata:
No crescita a 37 °C
No fermentazione saccarosio
Assimilato 2-keto-D-gluconato
Hanseniaspora guilliermondii H. uvarum
ascospore a cappello ascospore rotonde
Crescita a 37 °C + Crescita a 37 °C -
Maltosio - Maltosio -
Saccarosio - Saccarosio -
Legenda: - non assimilato

90
2.2.Metodi molecolari
G. COMI
2.2.1.Analisi del cariotipo
Tale tecnica permette di separare interi cromosomi o frammenti di cromosomi
tagliati con enzimi di restrizione attraverso un’elettroforesi in campo pulsato (PFGE).
Esteve-Zarzoso e coll. (2001) utilizzando tale tecnica identificarono diverse specie
di apiculati e in particolare Hanseniaspora guilliermondii, H. uvarum, H. valbyensis,
H. occidentalis, H. osmophila e H. vinae. Infatti tramite PFGE, ceppi di
Hanseniaspora vennero classificati dapprima in due gruppi principali e quindi nelle
diverse specie in base al numero e alla posizione delle bande ottenute nel gel in seguito
alla separazione degli interi cromosomi.
2.2.2.Analisi del DNA mitocondriale (mit-DNA-RFLP)
La tecnica permette di identificare i lieviti a livello intraspecifico e consiste
nell’estrarre il DNA totale dalle cellule di lievito, digerirlo con enzimi di restrizione
(es. IndIII o InfI) e separare i frammenti del mit-DNA per elettroforesi in agarosio.
Le tecniche dell’analisi del cariotipo e del mitDNA-RFLP vennero utilizzate da
Rodriguez e coll. (2004) per caratterizzare lieviti indigeni di vini prodotti in Patagonia.
L’analisi del cariotipo permise di identificare le diverse specie di lieviti non-
Saccharomyces (Candida e Hanseniaspora), mentre l’analisi del mit-DNA-RFLP
permise di separare i lieviti a livello di ceppo. In base a questi ultimi dati gli autori
conclusero che esisteva una notevole variazione genetica a livello intraspecifico,
variazione non evidenziabile però a livello fenotipico.
2.2.3.Analisi del DNA ribosomiale (rDNA)
Il DNA ribosomiale utilizzato in tale tecnica (fig. 1) comprende rDNA 18 S, rDNA
5.8 S, circondato da 2 frammenti nucleotidici che non sono trascritti (ITS1 e ITS2),
rDNA 26S, che contiene i domini D1/D2, rDNA 5 S, compreso tra due sequenze di DNA
non trascritte (NTS1 e NTS2) e dal rDNA 18S. Tali rDNA sono il bersaglio di primers, che
permettono, attraverso la rilevazione con diverse tipologie di elettroforesi, l’identificazione
a livello di specie (primers specifici) o a livello di ceppo (fingerprinting) quando
l’amplicone viene digerito con enzimi di restrizione.
Fig. 1 - DNA ribosomiale (Mannazzu, Budroni, 2005).

LIEVITI APICULATI D’INTERESSE ENOLOGICO 91
Prodotti di PCR (interi o tagliati con enzimi di restrizione) ottenuti attraverso
l’amplificazione di rDNA sono rilevati in diverse elettroforesi; dalla classica elettroforesi
in gel di agarosio, alla DGGE, TGGE. L’impiego di DGGE e di TGGE permette
l’identificazione della specie senza utilizzare l’isolamento delle colonie (è un metodo
coltura-indipendente). Tali elettroforesi ottenute in gel di acrilamide permettono di
separare gli ampliconi prodotti in base alla sequenza nucleotidica e non al loro peso
molecolare. In altre parole possono essere separate sequenze diverse anche se ottenute con
gli stessi primers. Di seguito si riportano esempi di applicazione di tali tecniche basate
si riportano sull’amplificazione del rDNA per tipizzare e caratterizzare lieviti apiculati.
Caruso e coll. (2002) amplificarono le sequenze NTS (spazi non trascritti) con
primers specifici ai fini di tipizzare ceppi di Kloeckera apiculata isolati da uve
‘Aglianico’ del Vulture. In particolare per valutare la biodiversità intraspecifica, gli
ampliconi ottenuti in PCR vennero digeriti con due enzimi di restrizione HaeIII e MspI.
Pur avendo ottenuto un numero rilevante di bande in seguito a restrizione dell’amplicone
(NTS), la tecnica non permise agli autori di discriminare gli isolati a livello di ceppo.
Infatti, contrariamente a quanto ottenuto da altri autori, tutti i ceppi considerati
presentavano gli stessi profili elettroforetici.
Esteve-Zarzoso e coll. (2001) amplificarono la regione ITS e la regione 5.8S-ITS
per caratterizzare diversi ceppi di Hanseniaspora. I prodotti PCR vennero digeriti in
diversi frammenti con enzimi di restrizione (CfoI, DdeI, HaeIII e HinfI). In base al
numero e al peso molecolare dei frammenti, gli autori poterono discriminare gli isolati
sia a livello di specie sia di ceppo e pertanto conclusero che tale tecnica debba essere
considerata discriminante e in grado di studiare popolazioni microbiche di uve o di mosti.
Mills e coll. (2002) utilizzarono metodiche coltura-dipendente e indipendente per
caratterizzare lieviti di mosti di uve botritizzate, nel corso della fermentazione. In
particolare impiegarono la tecnica DGGE per valutare profili elettroforetici di ampliconi
ottenuti attraverso l’amplificazione di rDNA e rRNA. La tecnica DGGE permette di
identificare ceppi senza il bisogno di isolarli dal substrato (coltura-indipendente). Per
identificare i ceppi attivi in tutte le fasi della fermentazione gli autori amplificarono
l’rRNA, che poi era tradotto in rDNA attraverso trascrittasi inversa (RT-PCR). In questa
maniera la tecnica permise di identificare ceppi, che pur rimanendo attivi fino a fine
fermentazione del mosto, non erano evidenziabili attraverso l’isolamento in piastra.
Infatti gli autori identificarono un ceppo di Candida spp. solo con RT-PCR; Candida,
estremamente fruttosofila, non è evidenziabile tramite coltura in piastra. Di conseguenza
conclusero che le tecniche coltura-dipendenti e indipendenti debbono essere associate
ai fini di ottenere un quadro reale e generale dei ceppi che intervengono in fermentazioni
sia guidate che spontanee.
Ai fini di identificare rapidamente lieviti vinari, Guillamon e coll. (1998) utilizzarono
la tecnica della RFLP (restrizione enzimatica) applicata a prodotti PCR ottenuti
amplificando le regioni ITS1 e ITS4 del rDNA. Gli enzimi di restrizione utilizzati
comprendevano CfoI, HaeIII e HinfI. La tecnica era altamente discriminativa e permetteva

92
G. COMI
di separare nettamente, in base al numero e al peso dei frammenti ottenuti dalla digestione
degli ampliconi, le diverse specie di non-Saccharomyces e Saccharomyces isolate dai
vini. Pertanto gli autori proposero la RFLP-PCR per monitorare la presenza di lieviti
durante fermentazioni spontanee.
2.2.4.Analisi del fingerprinting tramite l’amplificazione di sequenze ripetute di
DNA o di microsatelliti o RAPD-PCR (Random Amplified Polimorphic-DNA),
REP, ERIC.
Tecniche basate sull’amplificazione di DNA tramite primers in grado di legarsi a
sequenze ripetute lungo i cromosomi dei microrganismi. Esse sono poco ripetibili e
riproducibili e talvolta non producono alcuna discriminazione. Tuttavia trovano largo
impiego nella caratterizzazione intraspecifica di microrganismi o popolazioni microbiche
presenti nei diversi substrati alimentari.
Fig. 2 - Studio tramite FISH (Fluorescence in situ hybridization) dell’evoluzione di specie
fungine in mosti a fermentazione naturale (A) ed a fermentazione con aggiunta di
S. cerevisiae starter (B) (Xufre et al., 2006).

LIEVITI APICULATI D’INTERESSE ENOLOGICO 93
Legenda: Sonde di S. cerevisiae (Sce); Candida stellata (Cst); Hanseniaspora uvarum (Huv); Hanseniaspora
guilliermondii (Hgu); Kluyveromyces thermotolerans (Kth); Kluyveromyces marxianus (Kma);
Torulaspora delbrueckii (Tde); Pichia melibiosa (Pme); Pichia anomala (Pan); eumiceti (generale - EUK).
Fig. 3- Identificazione tramite FISH (Fluorescence in situ hybridization) di specie fungine di
mosti (Xufre et al., 2006).

94
Caruso e coll. (2002) utilizzarono microsatelliti (GAC)5 e (GTG)5 per tipizzare
ceppi di Saccharomyces cerevisiae e Kloeckera apiculata isolati da uve ‘Aglianico’. La
tecnica permise di ottenere ottimi risultati nella discriminazione di ceppi di S. cerevisiae;
viceversa fallì a livello di ceppi di Kloeckera apiculata.
Risultati simili vennero ottenuti da Bujdoso e coll. (2001), che caratterizzarono
tramite tecniche molecolari ceppi di Hanseniaspora uvarum e H. osmophila. Le tecniche
utilizzate comprendevano RAPD-PCR, microsatelliti (PCR) e ITS-PCR. I prodotti
ITS-PCR vennero tagliati con DdeI. Tramite ITS, i ceppi di H. uvarum presentavano lo
stesso numero di bande ed erano indistinguibili tra loro e distinguibili da H. osmophila.
Invece tramite microsatelliti e RAPD-PCR i diversi ceppi di H. uvarum erano
distinguibili tra loro e da H. osmophila.
2.2.5.Analisi FISH (Fluorescence In Situ Hybridization).
Tale tecnica permette di analizzare popolazioni microbiche attraverso l’impiego di
sonde oligonucleotidiche fluorescenti specie-specifiche. Queste si legano al segmento
complementare del DNA delle cellule bersaglio specifiche, che sono osservate al
microscopio a epifluorescenza.
Xufre e coll. (2006) analizzarono la popolazione di lieviti Saccharomyces e non-
Saccharomyces isolati da vini attraverso l’impiego di sonde oligonucleotidiche marcate
con fluoresceina che ibridavano i domini D1/D2 della regione 26S rRNA. La tecnica
permise di identificare Candida stellata, Hanseniaspora guilliermondii, H. uvarum,
Kluyveromyces marxianus, Kl. thermotolerans, Pichia anomala, P. membranifaciens,
Saccharomyces cerevisiae e Torulaspora delbrueckii. L’identificazione era a livello di
specie e non intraspecifica o di ceppo. Tuttavia gli autori poterono seguire l’andamento
di fermentazioni spontanee e guidate (figg. 2 e 3).
3. CONCLUSIONI
G. COMI
Gli apiculati Kloeckera apiculata, Hanseniaspora guilliermondii e H. uvarum sono
lieviti considerati poco interessanti ai fini enologici. Intervengono solo nei primi stadi
della fermentazione e producono poco etanolo, al massimo il 6-8 %, e alte concentrazioni
di acidità volatile (0,5-1 ‰). Tuttavia recentemente sono stati riscoperti e si ritiene che in
fermentazioni spontanee e controllate possano arricchire il fermentato di aromi costituiti
da composti sia volatili che non volatili (esteri, acidi). Essi vengono caratterizzati attraverso
studi fenotipici e genotipici. I primi si basano sullo studio delle caratteristiche morfologiche,
fermentative e ossidative nei confronti di composti organici quali zuccheri o acidi,
mentre i secondi si basano sull’analisi del genoma attraverso studi del cariotipo, del
DNA ribosomiale, del DNA mitocondriale e del fingerprinting. I metodi tradizionali
richiedono tempi lunghi di risposta, viceversa quelli molecolari sono più rapidi e non
obbligano l’isolamento della colonia, essendo coltura-indipendenti.

LIEVITI APICULATI D’INTERESSE ENOLOGICO 95
In particolare i metodi molecolari permettono la caratterizzazione del ceppo a livello
intra- e interspecie, e, di conseguenza, sono utili per l’identificazione con o senza isolamento,
per studi sull’ecologia e di popolazioni e per la scelta di starter per fermentazioni guidate.
Attualmente vengono prodotti e ottimizzati prevalentemente metodi molecolari per
caratterizzare i ceppi di S. cerevisiae e S. bayanus, le due principali specie utili ai fini
enologici. Tuttavia parallelamente sono descritti metodi molecolari per caratterizzare e
tipizzare lieviti apiculati, con lo scopo di avere sempre un quadro completo e reale
delle fermentazioni spontanee e guidate del vino.
In futuro si spera che detti metodi possano permettere di comprendere il reale
significato dei lieviti apiculati nella produzione vinaria.
Riassunto
I lieviti apiculati, Kloeckera apiculata, Hanseniaspora guilliermondii e H. uvarum, sono
presenti sulle bacche e nel mosto, e intervengono nei primi stadi della fermentazione vinaria.
Essi vengono caratterizzati attraverso studi fenotipici e genotipici. I primi si basano sullo studio
delle caratteristiche morfologiche, fermentative e ossidative nei confronti di composti organici
quali zuccheri o acidi, mentre i secondi si basano sull’analisi del genoma attraverso studi del
cariotipo, del DNA ribosomiale, del DNA mitocondriale e del fingerprinting.
PHYSIOLOGICAL AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF APICULATE
YEASTS FROM MUSTS AND WINES
Abstract
The apiculate yeasts, Kloeckera apiculata, Hanseniaspora guilliermondii and H. uvarum, are
present on grapes and in grape juices. In traditional winemaking they produce spontaneous
fermentation during the first stage, then die off with the increasing of ethanol concentration,
being replaced by Saccharomyces cerevisiae. Apiculate yeasts are characterized by traditional
and molecular methods, including karyotyping analysis, PCR-DGGE, PCR-TGGE, mit-DNA,
rDNA, and fingerprinting-analysis.
Bibliografia
Barre P., Vezinhet F. – 1984 - Evolution towards fermentation with pure culture yeasts in
wine-making. Microbial Science, 1, 159-163.
Bujdoso G., Egli C.M., Henick-Kling T. – 2001 – Characterization of Hanseniaspora
(Kloeckera) strains isolated in Finger Lakes wineries using physiological and molecular
techniques. Food Technol. Biotechnol., 39, 83-91.
Caruso M., Capece A., Salzano G., Romano P. – 2002 – Typing of Saccharomyces cerevisiae

96
G. COMI
and Kloeckera apiculata strains from Aglianico wine. Letters in Applied Microbiology,
34, 323-328.
Castelli T. – 1969 - Il vino al microscopio. Luigi Scialpi Editore, Roma, I, pp. 180.
Cocolin L., Manzano M., Rebecca S., Comi G. – 2002 - Monitoring of yeast population
changes during a continuous wine fermentation by molecular methods. Am. J. Enol. Vitic., 53,
1, 24-27.
Cocolin L., Rantsiou K., Iacumin L., Zironi R., Comi G. – 2004 - Molecular detection and
identification of Brettanomyces/Dekkera bruxellensis and Brettanomyces/Dekkera anomalus in
spoiled wines. Appl. Environ. Microbiol., 70, 3, 1347-1355.
Comi G., Traldi C. – 1982 - Differenze fermentative tra lieviti isolati da uve e da ambienti
(cantine) della zona di produzione del vino “Riviera” limitata al territorio della Valtenesi. Ind.
Bevande, 2, 235-240.
Comi G., Maifreni M., Marino M., Croattini I., Zironi R. – 1997 - Study on oenological
characteristics of commercial dry yeasts. J. Wine Research, 8, 2, 81-86.
Comi G., Romano P., Cocolin L., Fiore C. – 2001 - Production of secondary compounds by
Kloeckera apiculata from Friuli region in North Italy. World J. Microb. Biotechn., 17, 391-394.
Comi G., Manzano M., Cocolin L. – 2005 – Le alterazioni microbiche dei vini. In: M.
Vincenzini, P. Romano, G.A. Farris (eds.) Microbiologia del vino. Casa Editrice Ambrosiana,
Milano, I, 315-346.
Delfini C. - 1995 - Scienza e tecnica di microbiologia enologica. Edizioni “Il Lievito”, Asti,
I. pp. 631.
Delteil D., Aizac T. – 1988 - Comparison of yeast inoculation techniques by the use of a
“marked” yeast strain. Aust. N.Z. Wine Ind. J., 3, 3, 53-56.
Esteve-Zarzoso B., Peris-Toran M.J., Ramòn D., Querol A. – 2001 - Molecular characterization
of Hanseniaspora species. Antonie Van Leeuwenhoek, 80, 85-92.
Fleet G.H., Lafon-Lafourcade S., Ribéreau-Gayon P. – 1984 - Evolution of yeast and lactic
acid bacteria during fermentation and storage of Bordeaux Wines. Appl. Environ. Microb., 48,
5, 1034-1038.
Fleet G.H. – 1989 - Which yeast species really conducts the fermentation. Proc. 7th Aust.
Wine Ind. Techn. Conf., Adelaide, South Aus., AUS, 13-17 Aug., 153-156.
Fregoni M., Fregoni C., Ferrarini R., Spagnolli F. – 2004 – Chimica viticolo-enologica.
Reda Edizioni, Torino, I, pp. 233.
Gao C., Fleet G.H. – 1988 - The effects of temperature and pH on ethanol tolerance in the
wine yeasts, Saccharomyces cerevisiae, Candida stellata and Kloeckera apiculata. J. Appl.
Bacteriol., 65, 405-410.
Guillamon J.M., Sabatè J., Barrio E., Cano J., Querol A. – 1998 – Rapid identification of wine
yeast species based on RFLP analysis of the ribosomal ITS region. Arch. Microbiol., 169, 387-392.
Heard G.H., Fleet G.H. -1986- Occurrence and growth of yeast species during fermentation
of some Australian wines. Food Technology Australian, 38, 22-25.
Heard G.H., Fleet G.H. -1987 - Occurrence and growth of killer yeast during wine fermentation.
Appl. Environ. Microbiol., 53, 9, 2171-2174.

LIEVITI APICULATI D’INTERESSE ENOLOGICO 97
Heard G.H., Fleet G.H. - 1988a - The effect of temperature and pH on the growth of yeast
species during fermentation of grape juice. J. Appl. Bacteriol., 65, 23-78.
Heard G.H., Fleet G.H. - 1988b - The effect of sulphur dioxide on yeast growth during natural
and inoculated wine fermentation. Aust. N.Z. Wine Ind. J., 3 3, 57-60.
Herraiz T., Martin-Alvarez P.J., Reglero G., Herraiz M., Cabezudo M.D. - 1989 -
Differences between wines fermented with and without SO 2 using various selected yeasts. J.
Sci. Food Agric., 49, 249-258.
Herraiz T., Reglero G., Herraiz M., Martin-Alvarez P.J., Cabezudo M.D. - 1990 - The
influence of the yeast and type of culture on the volatile composition of wine fermented without
SO 2 . Am. J. Enol. Vitic., 41, 4, 313-318.
Kunkee R.E., Amerine M.A. - 1970 - Yeasts in winemaking. In: Rose A.H., Harrison J.S.
(eds.) The yeasts and yeast technology. Academic Press, London, GB, pp. 910.
Lafon-Lafourcade S., Ribéreau-Gayon P. - 1984 - Developments in the microbiology of
wine production. In: M.E. Bushell (ed.) Progress in industrial microbiology, vol. 19, 1-45:
Modern applications of traditional biotechnologies. Elsevier Publishing Co., Oxford, GB.
Mannazzu I., Budroni M. - 2005 - Identificazione e caratterizzazione molecolare dei lieviti
vinari. In: M. Vincenzini, P. Romano, G.A. Farris (eds.) Microbiologia del vino. Casa Editrice
Ambrosiana, Milano, I, 393-434.
Manzano M., Cocolin L., Longo B., Comi G. - 2004 - PCR-DGGE differentiation of
Saccharomyces sensu stricto strains. Antonie van Leeuwenhoek, 85, 23-27.
Mills D.A., Johannsen E.A., Cocolin L. – 2002 – Yeast diversity and persistence in Botrytisaffected
wine fermentations. Appl. Environ. Microbiol., 68, 10, 4884-4893.
Ribéreau-Gayon P., Dubourdieu D., Donèche B., Lonvaud A. – 2004 – Trattato di enologia.
Edagricole, Bologna, I, pp. 537.
Rodriguez M.E., Lopes C.A., van Broock M., Valles S., Ramòn D., Caballero A.C. – 2004 –
Screening and typing of Patagonian wine yeasts for glycosidase activities. J. Appl. Microb., 96, 84-95.
Romano P., Suzzi G., Comi G., Zironi R. - 1992 - Higher alcohol and acetic acid production
by apiculate wine yeasts. J. App. Bacteriol., 73, 126-130.
Romano P., Suzzi G., Zironi R., Comi G. - 1993 - Biometric study of acetoin production in
Hanseniaspora guilliermondii and Kloeckera apiculata. Appl. Environ. Microb., 59, 6, 1838-1841.
Romano P., Suzzi G., Comi G., Zironi R., Maifreni M. – 1997 - Glycerol and other fermentation
products in apiculate wine yeasts. J. Appl. Microb., 82, 1, 615-618.
Xufre A., Albergaria H., Inàcio J., Spencer-Martins L., Girio F. – 2006 - Application of
fluorescence in situ hybridisation (FISH) to the analysis of yeast population dynamics in winery
and laboratory grape must fermentation. Int. J. Food Microb., 108, 376-384
Zambonelli C. – 2005 - Microbiologia e biotecnologia dei vini. Edagricole, Bologna, I, pp. 230.
Zironi R., Romano P., Suzzi G., Battistutta F., Comi G. - 1993 - Volatiles metabolites produced
in wine by mixed and sequential of Hanseniaspora guilliermondii or Kloeckera apiculata or
Saccharomyces cerevisiae. Biotech. Lett., 15, 3, 235-238.
Zohre D.D., Erten H. - 2002 - The influence of Kloeckera apiculata and Candida pulcherrima
on wine fermentation. Process Biochem., 38, 319-324.