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Comet test
Tra i test di mutagenesi a breve termine un ruolo di rilievo è affidato al Comet test
detto anche Elettroforesi su Singola Cellula (SCGE, Single Cell Gel Electrophoresis). E’
considerato un’importante alternativa ai test citogenetici poiché presenta alcune
caratteristiche: è sensibile anche nel caso in cui il DNA abbia subito un danneggiamento
lieve, prevede l’analisi di un modesto numero di cellule (da alcune centinaia a poche
migliaia), è relativamente rapido da svolgere e in grado di dare dei risultati sulla
compromissione di una matrice in tempi brevi (TICE ET AL., 2000).
Tale test permette di valutare il danno al DNA rilevato come rotture dirette dello
scheletro fosfodiesterico in nuclei di cellule eucariotiche. Le cellule esposte a sostanze
genotossiche sono sospese in agarosio, stratificate su un vetrino portaoggetti da
microscopia e lisate con detergenti e soluzioni saline. Al materiale nucleare così ottenuto
si applica un campo elettrico. Il DNA, essendo carico negativamente per la presenza dei
gruppi fosfato, migra verso l’anodo. Dopo la corsa elettroforetica e previa colorazione è
possibile osservare con il microscopio ottico a fluorescenza la disgregazione del DNA
che assume la tipica morfologia di una cometa.
In condizioni elettroforetiche neutre è possibile evidenziare rotture a doppia elica;
in condizioni alcaline (pH 12,1) si evidenziano le rotture a singolo filamento poiché
vengono a rompersi i legami H tra le basi azotate. A pH maggiori si possono evidenziare
anche i siti labili agli alcali che in condizioni di elevato pH (> 13) vanno incontro a rottura.
Si possono utilizzare diversi parametri per descrivere le comete partendo dal
presupposto che la lunghezza della coda della cometa è proporzionale al danno subito
dalla cellula. Tali parametri si determinano con l’ausilio di specifici software collegati ad
analizzatori di immagini.
Tale tecnica sperimentale può essere teoricamente applicata a tutti i tipi di tessuti
dai quali si possa ottenere con facilità una sospensione di cellule isolate. E’ abitualmente
utilizzata su leucociti umani (POLI ET AL., 1999; SINGH ET AL., 1988), su cellule di emolinfa
provenienti da molluschi quali Mytilus edulis (MAMACA ET AL., 2005) e Mytilus
galloprovincialis (MACHELLA ET AL., 2006) o da pesci quali Symphodus melops (MAMACA
ET AL., 2005), e Cyprinus carpio (BUSCHINI ET AL., 2004).
In ambito vegetale il Comet test è applicato a cellule estratte da apici radicali o
foglie di piante superiori. Tra le specie più utilizzate si ricorda: Nicotiana tabacum
(RESTIVO ET AL., 2002), Allium cepa (POLI ET AL., 1999), Impatiens balsamina (POLI ET AL.,
1999), Vicia faba (KOPPEN ET VERSCHAEVE, 2001).
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