Tesi dottorato Annabella Russo.pdf - OpenstarTs - Università degli ...
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Reagente Composizione<br />
Agarosio a normale punto<br />
di fusione<br />
Agarosio a basso punto di<br />
fusione<br />
Soluzione di della parete<br />
Soluzione di lisi della<br />
membrana cellulare<br />
(pH 10)<br />
Tampone pH>13 per<br />
elettroforesi<br />
Soluzione di<br />
neutralizzazione<br />
1% Agarose NEEO (Roth)<br />
1% Agarose Low Melt (Roth)<br />
0.1 M acido citrico (Sigma)<br />
0.5 % Tween 20 (Sigma)<br />
2.5 M NaCl (Carlo Erba)<br />
100mM Na2EDTA (Sigma)<br />
10 mM Trizma base (Sigma)<br />
0.1 M NaOH (Sigma)<br />
300 mM NaOH (Sigma)<br />
1 mM Na2EDTA (Sigma)<br />
0.4 M Tris HCl (Sigma)<br />
Alcool etilico 70% Alcool etilico (Euroclone)<br />
Sonda fluorescente FLUOplus DNA stain (IKZUS Environment)<br />
Tab. 8. Reagenti utilizzati per eseguire il Comet test.<br />
Le fasi del test si possono schematizzare come segue:<br />
• Preparazione dei vetrini con gel di agarosio<br />
• Estrazione dei nuclei dagli apici radicali di V. faba<br />
• Precorsa<br />
• Elettroforesi<br />
• Osservazione al microscopio a fluorescenza<br />
• Analisi delle comete<br />
• Analisi dei dati<br />
E’ estremamente importante eseguire le fasi del protocollo in condizioni di scarsa<br />
illuminazione o sotto luce gialla e a basse temperature, nonché utilizzare reagenti<br />
purissimi. Luce e calore, infatti, danneggiano il DNA. Per tali motivi tutte le operazioni si<br />
conducono sotto luce gialla e mantenendo vetreria e reagenti a 4°C fino al loro utilizzo,<br />
allo scopo di evitare un danno aggiuntivo allo scheletro fosfodiesterico.<br />
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