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Fig. 7. Semi di Vicia faba in germinazione all’interno di un vaso di vetro. In questo caso i tempi di germinazione sono più lunghi: per ottenere un apice di V. faba di 1.5 – 2 cm sono necessari almeno 20 giorni. Per confrontare i risultati che si ottengono con le due metodologie è importante che i tempi di esposizione ai terreni contaminati siano gli stessi. Tuttavia lasciare i semi su capsule Petri per 20 giorni porta allo sviluppo di abbondanti muffe che compromettono la riuscita del test. Per ovviare a questo problema tutti i semi vengono inizialmente lasciati germinare in capsule Petri, su sabbia di quarzo preventivamente sterilizzata. Nelle capsule Petri gli apici germinano più velocemente che in terra. Dopo 4 giorni i semi germinanti vengono spostati nei vasi di vetro o in altre capsule Petri contenenti i terreni contaminati e lasciati in esposizione per 10 giorni. Con questo accorgimento si rispettano le tempistiche di esposizione e si limita la comparsa delle muffe. Protocollo Il protocollo seguito in questo studio è stato elaborato partendo da quello usato presso l’<strong>Università</strong> <strong>degli</strong> Studi del Piemonte Orientale (sede di Alessandria) dalla dott.ssa Patrizia Cesaro (comunicazione personale), confrontandolo con i lavori di Singh et al. (1988) e Tice et al. (2000) e prevede l’utilizzo dei reagenti elencati in Tab. 8. 28
Reagente Composizione Agarosio a normale punto di fusione Agarosio a basso punto di fusione Soluzione di della parete Soluzione di lisi della membrana cellulare (pH 10) Tampone pH>13 per elettroforesi Soluzione di neutralizzazione 1% Agarose NEEO (Roth) 1% Agarose Low Melt (Roth) 0.1 M acido citrico (Sigma) 0.5 % Tween 20 (Sigma) 2.5 M NaCl (Carlo Erba) 100mM Na2EDTA (Sigma) 10 mM Trizma base (Sigma) 0.1 M NaOH (Sigma) 300 mM NaOH (Sigma) 1 mM Na2EDTA (Sigma) 0.4 M Tris HCl (Sigma) Alcool etilico 70% Alcool etilico (Euroclone) Sonda fluorescente FLUOplus DNA stain (IKZUS Environment) Tab. 8. Reagenti utilizzati per eseguire il Comet test. Le fasi del test si possono schematizzare come segue: • Preparazione dei vetrini con gel di agarosio • Estrazione dei nuclei dagli apici radicali di V. faba • Precorsa • Elettroforesi • Osservazione al microscopio a fluorescenza • Analisi delle comete • Analisi dei dati E’ estremamente importante eseguire le fasi del protocollo in condizioni di scarsa illuminazione o sotto luce gialla e a basse temperature, nonché utilizzare reagenti purissimi. Luce e calore, infatti, danneggiano il DNA. Per tali motivi tutte le operazioni si conducono sotto luce gialla e mantenendo vetreria e reagenti a 4°C fino al loro utilizzo, allo scopo di evitare un danno aggiuntivo allo scheletro fosfodiesterico. 29
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