林修平

微生物與生化學研究所微生物學組專題討論
題目: Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory
作者:Shah AS, Ben-Shahar Y, Moninger TO, Kline JN, Welsh MJ
文章來源:Science. 2009 Aug 28;325(5944):1131-4.
演講人:Hsiu-Ping, Lin 林修平 R97B47403
指導老師:Chii-Shen, Yang 楊啟伸 助理教授
演講日期:October 26, 2009
演講地點:The 6 th classroom
摘要
纖毛是真核細胞中微小的突起狀胞器,依其功能分為初級纖毛和運動纖毛兩種。
初級纖毛就如同細胞的天線一樣,其上表現有多種的蛋白質受體,負責偵測外在
環境的刺激;而運動纖毛則產生運動的機械力,位於人體呼吸道上皮細胞的運動
纖毛可藉其擺動,避免吸入的有害物質進入肺部。本篇研究發現呼吸道的上皮細
胞可在其運動纖毛上表現數種偵測苦味的蛋白質受體,苦味的分子刺激細胞的訊
息傳遞,增加胞內鈣離子的含量,並增加運動纖毛的擺動速率。作者推測,由於
這些運動纖毛除了本身的運動之外,亦可偵測外界有害分子並增加擺動的頻率,
顯示呼吸道上皮細胞對環境存在一「細胞自發性的防禦」現象,同時也證明了運
動纖毛像初級纖毛一樣能偵測到環境的刺激。
Keywords:chemosensory、chemotaxis、cilia、human
本研究之重要性
前言
呼吸道上皮細胞由於不斷接觸到人類呼吸所吸入的空氣,也因此環境中若有各
式各樣的汙染物,包括毒化物、懸浮微粒、病毒顆粒或細菌等,最先感受到的
就是這群上皮細胞。而呼吸道本身會藉由分泌黏液,將這些有害物質給包裹起
來,經由纖毛的運動送出體外,這也是為什麼我們吸入髒空氣,會感受到呼吸
道不舒服而想要咳嗽的原因,然而人類對於這些細胞是如何感受到有害物質,
並給予適當回應的相關機制卻仍不十分明瞭,本篇研究將有助於釐清此一問
題。
前人作過的研究
纖毛依其功能可分為初級纖毛和運動纖毛兩種[1,2,3],初級纖毛上有表現多種
受體,可偵測各種不同的刺激[1],然而一個細胞通常只會有產生一個初級纖
毛,其結構為 9+0 的纖毛軸絲;相反的,一個細胞可產生數十至上百個運動纖
毛,而運動纖毛的結構則為 9+2 的纖毛軸絲[1,2,3]。初級纖毛和運動纖毛雖然
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在功能上有所不同,但這兩種纖毛在結構上和其分子層次的細節上仍有其相似
之處[3],體染色體隱性遺傳疾病 Bardet-Biedl Syndrome 會同時影響兩種纖毛
的正常功能,更顯示其在演化上的關連性[4]。
作者為何要作本研究
過去有研究發現,有些初級纖毛除了偵測外界環境外,還可旋轉的運動[5],
但目前仍未發現運動纖毛可如同初級纖毛般,具有偵測外界環境的功能。此外,
作者認為,呼吸道上皮細胞對有害物質的偵測與防禦是維持人體健康一道不可
或缺的防線,而這些大量存在於細胞上的運動纖毛應該要具有偵測這些物質的
能力,如此一來方可解釋細胞對於環境刺激的高靈敏度。
本研究欲完成之項目
作者藉由前人所做的 DNA 微陣列分析[6],發現呼吸道上皮細胞會表現一些
T2R 系列的苦味分子受體蛋白,因此作者挑選了數個此類蛋白為標的,利用抗
體標定、免疫螢光染色及共軛焦顯微鏡,取得二維空間的圖片,並組合成三維
空間立體影像,證實蛋白質在細胞中的表現分布位置。此外,作者也將用一些
苦味分子去刺激這些細胞,並偵測其胞內鈣離子的濃度變化,以期得到訊息傳
遞的相關證據。
細胞株
材料與方法
細胞株來自捐獻者的氣管及支氣管上皮細胞,由 University of Iowa In Vitro
Models and Cell Culture Core 提供。在抗體標定及免疫螢光呈色的實驗中,細
胞生長於膠原蛋白覆蓋的濾材上,處於一氣液交面的環境。這些上皮細胞經過
14 天的培養,分化成具有纖毛的上皮細胞、分泌黏液的杯狀細胞、基底細胞
或不具有纖毛的柱狀細胞。而在測量胞內鈣離子變化的實驗中,細胞則是培養
於 transwell 中進行實驗。
Microarray 及 RT-PCR
Microarray 的數據資料來自前人所做的研究分析。RT-PCR 的模版 RNA 是使用
RNeasy Plus Miniprep kit ( Qiagen Inc, Valencia, CA ) 自培養的細胞株中抽取,
並使用 T2 first strand kit ( SABiosciences, Frederick, MD ) 將其反轉錄成 cDNA,
最後設計各種 primer 並使用 PCR Supermix (Invitrogen, Carlsbad, CA) 放大目標
序列進行分析。
免疫螢光染色分析
細胞以 4%的 para-formaldehyde 固定,並使用 0.1%的 Triton X-100 處理 15 分
鐘,接著使用 PBS 溶液清洗三次。使用 Superblock ( Thermo Manuscript
1173869-revised Scientific, Rockford, IL ) 處理樣本一小時以避免抗體的非專一
性結合,接著加入抗目標蛋白的一次抗體於 4℃作用隔夜,後以 PBS清洗三次,
並加入抗 acetylated α-tubulin 的一次抗體於 37℃作用一小時。接著以 PBS 清洗
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細胞四至五次,後選用適當的二次抗體 ( Alexa fluorophores, Invitrogen ) 作用
後,將 sample 置於含有 DAPI 染劑的 Vectashield ( Vector Labs, Burlingame, CA )
中將核染色並防止螢光染劑的褪色,如此即完成螢光呈色的樣本製備。
使用 Olympus FluoView1000 共軛焦顯微鏡 ( Center Valley, PA. ) 成像,得到
的影像以 Olympus FluoView software 或 NIH ImageJ software 進行影像分析。
所得影像再以 Slidebook software ( Leedsmicro, Minneapolis, MI ) 等值曲面成
像進行 3-D 影像重組。
使用的一次抗體詳列於 ( 圖一 )。
胞內鈣離子濃度變化測定
細胞以 1µM Fura2-AM 染劑處理,此種染劑可進入細胞並偵測胞內鈣離子含
量。染過的細胞置於 300 µM CaCl2 溶液中於 37℃處理 15 分鐘。接著在不同時
間點加入各種苦味刺激分子 Denatonium, thujone, salicin, quinine,或 nicotine,做
濃度的遞增,觀察其 340 nm / 380 nm 的激發光強度比值。使用倒立式顯微鏡
( Nikon Eclipse TE200, Nikon Instruments Inc., Melville, NY ) 進行成像,所得數
據再以 NIS-Elements software ( Nikon ) 進行分析。
纖毛擺動頻率測定
細胞在 37℃下以多光子雷射共軛焦顯微鏡 Zeiss LSM 510 META NLO 進行觀
察。每 2 ms 截取所得影像,共截取 4s,因此每一組實驗數據總共是兩千張的
影像,這些影像數據最後由 NIH ImageJ software 進行分析及擺動頻率的量化。
結果與討論
人類呼吸道上皮細胞表現 T2R 系列的多種蛋白質受體
分析前人所做的微陣列數據及 RT-PCR 結果顯示,人類的呼吸道上皮細胞會表
現 T2R 家族的蛋白質,為偵測苦味分子的受體。人類的基因組中含有大約 25
個 T2R 系列的基因,有些 T2R 會偵測多種刺激分子,而有些刺激分子可同時
活化不同的 T2R,這一系列的 T2R 在我們舌頭上構成複雜的味覺系統,防止
我們將有苦味毒性物質吃下肚子中。
T2R 表現在呼吸道上皮細胞的運動纖毛上,且不同的 T2R 有不同的表現位置
利用免疫螢光染色的方式,發現 T2R4 及 T2R38 這兩個蛋白質受體表現於纖毛
的尖端,而 T2R43 及 T2R46 則是表現於纖毛的周邊,在空間分布上有著一些
差距,而染色結果也發現同一纖毛細胞會表現多種的 T2R,但非纖毛細胞並不
會表現這些 T2R。
纖毛細胞亦表現經由 T2R 傳遞的下游訊息蛋白 G protein a-gustducin 及
PLC-b2
經由 T2R 傳遞的下游訊息蛋白 G protein a-gustducin 及 PLC-b2 免疫染色的結
果發現了經由 T2R 所活化的訊息傳遞路徑下游的 G protein a-gustducin 和
phospholipase C–b2 (PLC-b2)蛋白質也會被呼吸道上皮纖毛細胞所表現。而 G
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protein a-gustducin 的表現位置和 T2R 類似,都在纖毛較尖端及邊緣的位置,
而 PLC-b2 則表現於纖毛的基底部。作者認為 T2R 和其下游蛋白質的訊息傳遞
可能會連結到其他訊息傳遞路徑刺激細胞,造成纖毛的擺動。
苦味分子的刺激使纖毛細胞胞內鈣離子濃度增加
鈣離子 T2R 所活化的訊息傳遞路徑的第二傳訊者,使用各種苦味刺激分子
Denatonium, thujone, salicin, quinine, nicotine 刺激纖毛細胞,發現胞內鈣離子的
濃度顯著增加,且此一增加是 dose-dependent 的。此外,非纖毛的上皮細胞亦
會受到刺激而導致胞內鈣離子濃度增加,但其受到刺激後到開始增加的時間明
顯比纖毛細胞慢了許多,顯示非纖毛細胞因為沒有表現 T2R 受體,因此受到
的刺激來自細胞間的 gap junctions,也因此造成活化時間上的延遲。
苦味分子 Denatonium 的刺激會增加運動纖毛擺動頻率
由於胞內鈣離子的增加,作者推測纖毛擺動的頻率將受到苦味分子的刺激而增
加。在實驗結果中,作者也證實了 denatonium 的刺激使得纖毛擺動的頻率較
未接受刺激的控制組增加了約 25%。
參考文獻
1. V. Singla, J. F. Reiter. The Primary Cilium as the Cell's Antenna: Signaling at a
Sensory Organelle, Science 313, 629 (2006).
2. W. F. Marshall, S. Nonaka. Cilia: tuning in to the cell's antenna Curr. Biol. 16,
R604 (2006).
3. M. Fliegauf, T. Benzing, H. Omran. When cilia go bad: cilia defects and
ciliopathies. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.8, 880 (2007).
4. A. S. Shah et al. Loss of Bardet–Biedl syndrome proteins alters the morphology
and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105,
3380 (2008).
5. N. Hirokawa, Y. Tanaka, Y. Okada, S. Takeda. Nodal flow and the generation of
left-right asymmetry.Cell 125, 33 (2006).
6. J. Zabner et al. CFTR DeltaF508 mutation has minimal effect on the gene
expression profile of differentiated human airway epithelia. Am. J. Physiol. Lung
Cell. Mol. Physiol. 289, L545 (2005).
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圖表
圖一:免疫染色所使用的一次抗體,其標定位置、來源及性質列表。
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