洪佳麟 - 黃慶璨研究室

微生物與生化研究所微生物組專題報告
題目 : The use of chitosan to damage Cryptococcus neoformans biofilms
作者:Cale N. Street, Aaron Gibbs, Lisa Pedigo, Dane Andersen and Nicolas G. Loebel
文章來源:Biomaterials 31 (2010) 669–679
演講人:Jia-Lin Hong 洪佳麟 R98B47416
指導老師:Ching-Tsan Huang, PhD 黃慶璨 教授
演講日期:May 3, 2010
演講地點:The 6 th Classroom
摘要
植入型醫療器材(如心律調節器、導尿管或人工關節)經常被微生物感染,感染的微生
物形成生物膜後,對殺菌劑及宿主防禦機制的抗性皆會上升。本文研究甲殼素(chitosan,
從甲殼類的外骨骼分離出的聚合物)對於 Cryptococcus neoformans 所形成生物膜的傷害能
力。利用 XTT 還原分析、CFU 測定,發現甲殼素可有效地減少生物膜代謝活性及其細胞
的存活力。利用共軛焦及掃描式電子顯微鏡,也證實甲殼素能穿透生物膜,對真菌細胞
造成傷害。值得注意的是,C. neoformans 的重要致病因素,黑色素化(melanization)也不
會降低甲殼素的抑菌作用。此研究中使用的甲殼素濃度對 C. neoformans 有傷害,但對人
類內皮細胞則無毒性。本研究顯示,甲殼素可傷害 C. neoformans 的生物膜,為植入型醫
療器材的真菌感染問題,提供新的解決方法。
本研究之重要性
前言
生物膜是微生物附著於物體表面、利用周遭養分生長並分泌胞外聚合物之後所形成
的構造,如果人工瓣膜、人工關節等物體表面形成生物膜,將會造成急性或慢性感染,
常見的處理辦法,就是以手術將感染的人工植入物取出。後來有人將植入物包覆上一層
抗生素或殺菌劑,希望減少生物膜的形成,但效果不彰[1]。以甲殼素(chitosan)來對抗生
物膜之研究,或許能提供一個植入型醫療器材表面形成生物膜問題的解決方法。
前人做過的研究
甲殼素是一種便宜、無毒的聚合物,且具有抗微生物的功能[2]。前人曾以Klebsiella
pneumoniae、Staphylococcus epidermidis、S. aureus、S. mutans、S. oralis等細菌為對象,
研究甲殼素對其形成生物膜之影響。發現甲殼素對生物膜之形成及細菌細胞的生長,皆
有抑制的效果[1, 3]。
作者為何要作本研究
前人的研究多以細菌生物膜為主,作者想探討甲殼素對於真菌之生物膜是否有抑制
作用,因而以 Cryptococcus neoformans 為研究對象。

本研究欲完成之項目
本研究欲測試甲殼素對 C. neoformans 生物膜形成之抑制作用,比較生物膜與懸浮細
胞對甲殼素敏感性的不同,及 C. neoformans 產生黑色素是否會影響其對甲殼素的抗性。
材料與方法
1.菌株:C. neoformans B3501,以 Sabouraud dextrose broth 於 30 o C 培養 24 小時備用。
2.生物膜培養:培養真菌細胞後離心收集之,以 PBS 洗兩次,重新懸浮,濃度為 10 7
cells/cm 2 ,將菌液加入 96 孔盤中,於 37 o C 靜置培養,48 小時形成生物膜,以 96 孔盤清
洗器清洗,餘下吸附其上的生物膜。
3. XTT (2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino) carbonyl]- 2Htetrazolium-hydroxide)reduction
assay:在含有菌液的96孔盤中加入XTT溶液,於37 o C培
養5小時。細胞的mitochondrial dehydrogenase會將XTT tetrazolium salt還原成橘紅色XTT
formazan。以microtiter reader測量顏色變化,以反應細胞活性。
4.真菌細胞黑色素化:以含有 1 mM L-dopa 的 minimal medium broth 培養生物膜 7 天,對
照組則是以無 L-dopa 的 minimal medium broth 培養生物膜 7 天。
5. 甲殼素對 C. neoformans 生物膜的影響:於形成生物膜的 wells 中加入 200 μl 含有不同
濃度甲殼素的 PBS 作用 1 分鐘,於 37 o C 培養 0.5、1 小時,進行 XTT reduction 及 CFU
測量。
6.莢膜大小測量:10 μL細胞與India ink混合,以Olympus AX70 microscope觀察並測算莢
膜大小。
7. ELISA spot:以96孔盤培養生物膜,用microtiter plate washer以含0.05% Tween 20的TBS
洗三次,再以200 ml含有1% BSA的PBS清洗。此後加入2 mg/mL GXM
(glucuronoxylomannan)binding MAb 18B7 接著加入1 mg/mL of biotin-labeled goat
anti-mouse (GAM) IgG1。以含0.05% Tween 20的TBS清洗後,加入50 ml BCIP
(bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) ,於37 o C培養1小時,以無菌水沖洗5次後風乾。
8.多醣分子大小計算:以90Plus/BI-MAS Multi Angle Particle Sizing analyzer內建的quasy
elastic light scattering (QE LS)來分析所分離多醣分子的大小。
9. Zeta potential測量:以Zeta potential analyzer分析樣本粒子的zeta potential,以得知細胞
表面電位。

結果與討論
1. 甲殼素對生物膜形成之影響
在培養基中加入甲殼素,發現生物膜活性隨甲殼素濃度增高而降低。以 SEM 觀察到
加甲殼素的組別,細胞外多醣量明顯減少。
2. 甲殼素對於莢膜多醣釋放之影響
以 ELISA spot 測試生物膜生成時,莢膜多醣的釋放情況,發現加入甲殼素的組別,
其標定到的多醣較多,但大小遠不如對照組。這說明甲殼素會影響細胞釋放多醣至周圍,
可能因此阻礙生物膜的附著。
3. 甲殼素對成熟生物膜的影響
將甲殼素加入成熟生物膜中,發現生物膜細胞活性及存活率皆隨甲殼素的濃度和處
理時間的增加而減少,SEM 及 confocal microscope 的觀察結果則說明加入甲殼素後,其
胞外多醣量及細胞活性皆減少。
4. 甲殼素對懸浮細胞的影響
將甲殼素加入懸浮細胞,發現細胞活性及存活率皆隨甲殼素的濃度增加而減少。跟
生物膜比起來,懸浮細胞對甲殼素的敏感度顯然比較高。SEM 可觀察到因加入甲殼素而
破損的細胞。
5. 甲殼素對莢膜多醣的影響
加入甲殼素培養新型隱球菌細胞,其莢膜明顯變小,且上清液中多醣含量明顯比對
照組多,說明甲殼素或許可將莢膜多醣截切,免疫螢光染色及 SEM 的觀察也顯示同樣的
清況。
6. 甲殼素對胞外多醣及莢膜多醣結構的影響
以 QE LS 儀器測量多醣分子的大小,發現加入甲殼素的組別,其莢膜多醣分子較小,
而胞外多醣分子較大,與上述實驗相符。
7. 甲殼素對 C. neoformans 的 zeta potential 之影響
由於莢膜及黑色素的影響,菌體本身帶負電,經過甲殼素處理後,細菌表面帶有強
力的正電,或許是電性的轉換,造成細胞膜受損。

8. 甲殼素對黑色素化的 C. neoformans 生物膜之影響
當 C. neoformans 產生黑色素後,對免疫細胞的攻擊、氧化壓力的耐受性皆會提高
[4]。而此實驗發現,黑色素化的 C. neoformans 生物膜對甲殼素的耐受性的確比對照組
高,但實驗結果同時也說明,C. neoformans 所產生的黑色素並不會影響甲殼素的抑菌效
果。
參考文獻
1. Carlson RP, Taffs R, Davison WM, Stewart PS. Anti-biofilm properties of chitosan-
coated surfaces. J Biomater Sci Polym Ed 2008;19:1035–46.
2. Rabea EI, Badawy ME, Stevens CV, Smagghe G, Steurbaut W. chitosan as
antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules
2003;4:1457–65.
3. Busscher HJ, Engels E, Dijkstra RJ, van der Mei HC. Influence of a chitosan on
oral bacterial adhesion and growth in vitro. Eur J Oral Sci 2008;116:493–5.
4. Nosanchuk JD, Casadevall A. Cellular charge of Cryptococcus neoformans:
contributions from the capsular polysaccharide, melanin, and monoclonal
antibody binding. Infect Immun 1997;65:1836–41.