韓怡安

生化科技研究所微生物與細胞專題討論
題目:Analysis and regulation of amoeboid-like cell motility using synthetic
Ca 2+ -sensitive proteins
作者:Evan Mills, Kevin Truong
文章來源:Cell Calcium 53(3): 231–240, 2013.
演講人:Yi-An Han 韓怡安 R01B22044
指導老師:Chii-Shen Yang, PhD 楊啓伸 博士
演講日期:April 15, 2013
演講地點:The 6th Classroom
摘要
最近的研究報告已經證實利用經過基因工程改造的蛋白質 (engineered
proteins) 能夠控制細胞的移動特性 (cell motility),這項重要的技術有可能運用在
特定的細胞中當作疾病的治療劑。RhoA 是一種控制細胞骨架張力的蛋白質,作
者過去已經提出經過基因改造的 RhoA ,可以用來調控 blebbing cell (圖一)的細
胞形態。在本篇研究當中,作者進一步證實基因改造後的 RhoA 能夠調控細胞
的移動特性。首先,在分析 blebbing cell 和正常細胞 (wild type morphology) 的
移動特性後,發現 blebbing cell 和正常細胞相比,有較快移動速度 (speed) 和
行走軌跡呈現較低直線性 (linearity) 之現象;接著,進一步發現,在用特定波長
之光線活化細胞內改造後的 RhoA 後,可以改變細胞的外觀形態,並進一步改
變其移動速度和直線性;最後,利用先前基因改造可被鈣離子活化的 CaRQ 和
所植入在細胞膜上,能夠感應外界環境刺激而釋放鈣離子的離子通道蛋白質,可
以共同來調控細胞的移動特性和外形。這項研究證實,藉由控制 RhoA 之活性,
能夠指定細胞的移動特性,也指出細胞形態變化和移動特性之間是有相關的。
Keywords:Cell motility, Ca 2+ networks, RhoA, Blebbing
本研究之重要性
前言
利用哺乳動物細胞作為疾病的治療平台是未來的發展趨勢,這項技術的發展,
必須要在細胞上建立良好的控制系統,指揮細胞進行有效的生理功能(例如:定
向的移動、蛋白質分泌)以執行複雜的任務(例如:尋找和摧毀腫瘤細胞)。細胞
的移動是其中一種基本且具有運用潛力的發展特點,目前已有研究發展出,經過
基因改造的 RhoA 蛋白質 [1],可以用來調控細胞的移動性和細胞骨架 [2][3]。
1

先前作過的研究
作者在過去已經提出兩種經過基因改造的 RhoA (CaM-RhoA, CaRQ) (圖二、
表一),搭配細胞膜上可以感應不同外界環境刺激(包括 blue light, acetylcholine,
VEGF-A)的蛋白質 [4],共同調控細胞形態。這種 RhoA 和其下游的 kinase
(Rho-associated protein kinase;ROCK) 主要負責轉換細胞形態 (wild type
morphology or blebbing morphology)。
作者為何要作本研究
作者想要證實基因改造的 RhoA 可以用來控制細胞的移動特性,使得以
programming cells 當作治療應用的技術更進一步發展。
本研究欲完成之項目
本篇研究以能夠感應 Ca 2+ 訊號的 CaM-RhoA 和 CaRQ 這兩種基因改造
的 RhoA 來調控細胞的移動特性。細胞感應外界刺激之後,引發 Ca 2+ 產生,
Ca 2+ 和 RhoA 結合後,細胞形態產生變化,並改變細胞移動特性。作者分別針
對移動速度和行走軌跡直線性進行分析,指出細胞形態和移動特性之間的相關
性。
細胞株
HEK293 cells 以及 Jurkat cells。
材料與方法
單一細胞遷移實驗 (Single-cell migration assay)
細胞經過轉移感染之後以胰蛋白酶處理,接著以 1:10 比例稀釋,重新接種
在含有 DMEM+1% FBS 的 Mattek glass-bottom dishes 上,經過四小時之後再進
行影像紀錄,每五秒鐘拍一張照片,實驗結束之後,再將實驗過程中所拍攝的照
片去除背景之後再進行分析,利用 ImageJ 計算細胞的核心移動距離和速度。
1. 速度 (Speed)
特定時間內所移動的距離。
2. 直線性 (Linearity)
一段直線距離除以總移動距離 (圖三),直線性範圍分布在 1 (代表細胞呈直
線移動)到 0 (代表細胞經過移動之後仍然停在起始點)之間。
群體細胞遷移實驗 (Transwell assay)
加入 100 uL 含有細胞的 DMEM+1% FBS 到 insert 當中,相同體積的細胞
懸浮液加入 well 內當作正控制組 (well 內不含有 insert)。接著在 well 底部加入
650 uL DMEM+1% FBS 以及實驗組所需的抑制劑或是化學誘導劑,實驗照光組
2

部分,將 24 孔盤放在黑暗的培養箱內,24 孔盤底部以 iPod 3G 照射藍光 (445 nm;
電源輸出功率 1mW/cm 2 ) (圖四)。經過 24 小時之後,拿起 well 中的 insert 並
去除頂部多餘的細胞,再將 insert 泡在 PBS 中並以胰蛋白酶作用半小時,使細
胞從 insert 底部分離,再計算遷移指數 (migration index)。
1. 遷移指數 (migration index)
泳動到 well 底部的細胞數除以正控制組 well 內的總細胞數。遷移指數範
圍分布在 1 (代表所有的細胞都泳動到 well 底部)到 0 (代表沒有細胞泳動到
well 底部)之間
結果與討論
Blebbing cells 和 wild type cells 相比,有較低的移動直線性和較高的移動速
度。
此實驗利用表達不同蛋白質的四種 HEK 293 細胞進行比較,如下表:
基因型 YFP CaM-RhoA(DP) CaRQ RhoA(DP)
細胞形態 wild type blebbing wild type blebbing
經過兩個小時的單一細胞遷移實驗,影像紀錄經過分析,blebbing cells (表現
CaM-RhoA 或 RhoA)比 wild type cells (表現 YFP 或 CaRQ)有更高的移動速度,
但是從移動軌道記錄分析卻顯示,blebbing cells 的移動直線性較低。
CaM-RhoA(DP) 融合蛋白在 Ca 2+ 誘導下,會改變細胞的移動特性。
1. 表現 CaM-RhoA(DP) 的細胞在 ionomycin (與鈣離子有極高的親和力,
在細胞膜上可形成鈣離子通道)與 Ca 2+ 同時存在的條件之下,細胞形態
從 blebbing 轉成 not blebbing,且細胞移動直線性上升,移動速度下降。
由此結果觀察出,細胞形態和細胞移動特性之間的轉變是同時發生的。
2. 表現 CaM-RhoA(DP) 的細胞在只有 ionomycin 的誘導條件下,細胞形
態沒有改變,顯示 Ca 2+ 是調控 CaM-RhoA(DP) 的主要因素。
3. Ca 2+ 的傳遞也可以透過其他膜蛋白質的作用,例如:LOVS1K/Orai1,
當細胞同時表現 CaM-RhoA(DP) 和 LOVS1K/Orai1,在藍光 (445nm)
照射之下,LOVS1K 活化而和 Orai1 膜蛋白鈣離子通道結合,引起
Ca 2+ 進入細胞內和 CaM-RhoA(DP) 作用,造成細胞形態和移動特性改
變。
4. LOVS1K/Orai1 在紅光 (580nm)照射之下,LOVS1K 無法被紅光活化,
沒有 Ca 2+ 進入細胞內和 CaM-RhoA(DP) 作用,因此沒有細胞形態改
變。
CaRQ 融合蛋白在 Ca 2+ 誘導下,也會改變細胞的移動特性。
1. 當細胞同時表現 CaRQ 和 LOVS1K/Orai1,在藍光 (445nm)照射之下,
3

LOVS1K 活化而和 Orai1 膜蛋白鈣離子通道結合,引起 Ca 2+ 進入細
胞內和 CaRQ 作用,細胞形態從 not blebbing 轉成 blebbing,同時觀
察到細胞移動直線性下降,移動速度上升。
2. 若在相同的實驗當中,將紅光取代藍光,或是將有活性的 RhoA 突變
成沒有活性的 RhoA (T19N),或是加入蛋白質抑制劑 (Y-27632、
blebbistatin),細胞形態和細胞移動性則沒有產生變化,顯示活化
LOVS1K 的波長、RhoA 和 ROCK 活性都是調控因素。
利用藍光、VEGF-A、acetylcholine (ACh) 誘導表現 CaRQ 的細胞向特定方
向移動。
1. 經過 24 小時的群體細胞遷移實驗 (transwell assay),分別表現 CaRQ/
LOVS1K/Orai1、CaRQ/VEGFR2、CaRQ/nAChR-α4 的細胞,在藍光、
VEGF-A、ACh 誘導之下,細胞會往帶有誘導物的 well 底部移動;當
誘導物同時出現在 well 頂部和底部時,則沒有細胞移動的現象產生,
結果顯示,誘導物是指引細胞移動的因素。
2. 利用表現 CaRQ/ LOVS1K/Orai1 的 Jurkat cell 進行光源測試,在顯微
鏡下觀察 90 分鐘,結果顯示細胞會往藍光光源的方向移動。
參考文獻
1. A. Hall, Rho GTPases and the actin cytoskeleton, Science 279 (1998)
509–514.
2. E. Mills, E. Pham, K. Truong, Structure based design of a Ca 2+ -sensitive
RhoA protein that controls cell morphology, Cell Calcium 48 (2010) 195–
201.
3. E. Mills, K. Truong, Ca( 2+ )-mediated synthetic biosystems offer protein
design versatility, signal specificity, and pathway rewiring, Chemistry and
Biology 18 (2011) 1611–1619.
4. E. Pham, E. Mills, K. Truong, A synthetic photoactivated protein to generate
local or global Ca( 2+ ) signals, Chemistry and Biology 18 (2011) 880–890.
4

圖表
表一、HEK 293 細胞表現不同 RhoA 的細胞形態說明。
基因建構描
述
無 Ca 2+ 誘導
下的細胞形
態
Ca 2+ 誘導下
的細胞形態
RhoA(DP) CaM-RhoA(DP) CaRQ
RhoA(DP) 是一個
經過突變 (Q63L)
能夠一直和 GTP
結合而處於活化狀
態的 RhoA。RhoA
活化後會和下游的
ROCK 結合,產生
blebbing 的形態變
化。
CaM-RhoA(DP) 上
的 CaM(Calmodulin)
是攜鈣素,在有
Ca 2+ 誘導環境下,
CaM 會和 RhoA
結合,使 RhoA 構
型改變,失去活性而
無法和 ROCK 作
用。
5
CaM 在沒有 Ca 2+
誘導環境下,CaM
會和 RhoA 當中的
IQp 片段結合,使
RhoA 不活化;在有
Ca 2+ 誘導環境下,
CaM 會和 MLCKp
片段結合,此時
RhoA 構型不受影
響,呈現活化狀態。
Blebbing Blebbing No blebbing
Blebbing No blebbing Blebbing
圖一、左圖為正常形態的細胞 (wild type morphology);右圖則為 blebbing cell。
當 RhoA/ROCK 活化之後會進一步使 actin-myosin 產生收縮增加細胞骨架的
張力,此張力會使得細胞膜短暫地從細胞質上脫離,細胞膜突出,細胞表面呈現
不規則的小泡突起,稱為 blebbing cell。
圖二、左圖為 CaM-RhoA(DP) 的基因建構圖以及在 Ca 2+ 誘導之下
RhoA/ROCK 所產生的不活化示意圖;右圖則為 CaRQ 的基因建構圖以及在
Ca 2+ 誘導之下 RhoA/ROCK 所產生的活化示意圖。

圖三、直線性計算法,當一個細胞行經五個時間點的時候,左圖的直線性較高,
而右圖的直線性較低。
圖四、在 transwell assay 中,分別利用藍光、VEGF-A 以及 acetylcholine (ACh)
來刺激細胞遷移。
6