呂昂樹

生化科技學系微生物學組專題討論
題目: K + channel selectivity depends on kinetic as well as thermodynamic factors
作者:Michael Grabe, Delphine Bichet, Xiang Qian, Yuh Nung Jan, and Lily Yeh Jan
文章來源:Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of
America September 26, 2006 vol. 103 no. 39 14361–14366
演講人:OngShu Lu 呂昂樹 B95B02005
指導老師:Kuo Kan Liang PhD 梁國淦 博士
演講日期:April 13th, 2010
演講地點:The 6th classroom
摘要
鉀離子通道是細胞膜上重要離子通道之一,可以維持膜電位以及產生作用電
位,其主要功能可使鉀離子由膜外進入膜內,且防止其他離子進入細胞中。普遍
認為,鉀離子通道對於離子的選擇性是由於通道中的 selectivity filter 可以利
用靜電力使進入通道中的 dehydrated ion 穩固。經過實驗證實,在 Kir3.2 鉀
離子通道中,若將面向通道內的胺基酸突變為酸性胺基酸,可以使此通道對於鉀
離子的選擇性增加。以此實驗為基礎,作者建立了一個多離子模型,藉以計算胺
基酸突變對於整體通道在鈉鉀離子的選擇性上的變化。又從模型之中發現,將胺
基酸突變為帶有負電的胺基酸,是一種沒有選擇性的增加離子在通道中的穩定
性,但此種非選擇性的穩定性增加卻可以使整體通道對於鉀離子選擇性增加。此
種發現突顯了鉀離子通道的選擇性不只與 selectivity filter 有關,而是整體通
道的性質都有影響。
Keywords:electrostatics / model / potassium channel / simulation /
ion permeation
前言
本研究之重要性
鉀離子通道存在常見大部份的生物上,在動物體內常見的作用有胰島素的調
節、心臟跳動速率的控制以及神經傳導,這一切都仰賴鉀離子通道對鉀離子的
高度選擇性。同時,喪失鉀離子通道的選擇性將會造成嚴重的疾病。因此,鉀
離子通道選擇性背後的機制是什麼,一直是很重要的課題。
前人做過的研究
鉀離子通道能夠在一秒鐘內使數百萬的鉀離子進入細胞膜內,同時也阻擋了接
近千倍的鈉離子流進膜內 [1] ,如何保持對於鉀離子的選擇性以及高速的流動一
直是鉀離子通道研究者主要的課題。研究發現在通道內部除了擁有選擇性的離
子結合位置之外 (selectivity filter),也有非選擇性的離子結合位置,經過突

變後發現,非選擇性結合位置的突變也會影響通道整體的選擇性。例如 :
Kir3.2 如果做了點突變 S177W,就會破壞其選擇性。不過最近研究也指出,
在 S177W 突變株上的非選擇性位置突變也可使通道選擇性回復 [2][3][4] 。
作者為何要作本研究
離子在通道中的運動模式無法只用結構或者是電壓電流的測量解釋,因此作者
利用動力學模擬期望將離子通道真正的運作模式模擬出來。
本研究欲完成之項目
期望以動力學模型模擬離子在通道中運動的模式,並解釋 S177W – N184D
突變株能夠回復選擇性的原因。
材料與方法
Constructs and oocyte expression
Kir3.2 的基因以 PCR 做 site-directed mutagenesis,接著做出 cRNA 並
接上 5’ cap,注射進第 5~6 期的 Xenopus laevis 卵細胞表現。
Electrophysiology
以 two-electrode voltage clamp 技術,測量在不同溶液(90mM Na + 、
90mMK + ;以 tertiapin-Q 修正誤差)下的電流。
Permeability measurement
以不同溶液下測得的電流,搭配 Goldman-Hodgkin-Katz (GHK)
equation:
P:Permeability
R:Ideal gas constant
T:Temperature
z:Valence
F:Faraday constant
即可推算離子通透性之比值。
Modeling
以 KirBac1.1 作模板利用模型建構工具 Modeller8v0 建構出 Kir3.2 的同源
模型。

結果與討論
通道中的靜電作用力可以增強對於鉀離子的選擇性
上一篇研究中指出,Kir3.2 的 S177W 突變株對鉀離子是沒有選擇性的,且
N184 則是使 S177W 回復選擇性的關鍵。經過測量突變株對於鈉鉀離子的相
對通透性,代表通道對鉀離子的選擇性 (PNa/PK),作者發現 N184D, E 可以
有效回復選擇性 (圖一 A)。接著利用 Kir3.2 同源模型計算離子在突變株中的
靜電穩定程度 (圖一 B)。發現 D, E 確實可以使離子在通道中較穩定,但以鈉
離子實驗也得到類似結果。因此,作者想探討沒有選擇性的離子穩定性增加是
如何導致整體通道選擇性增加。
離子擴散模型
建構出離子擴散模型之後,可計算出擴散速率常數,藉由常數推測比較離子在
通道中的運動模式 (圖二 A)。圖二 A 是利用 knock out model 建構出的多
個同種離子在通道中的運動模式。與 KcsA 結構比較之後則建構出更精細的模
型 (圖二 B)。
以分子實驗計算推測模型的擴散速率
以建構出的分子模型計算搭配實驗結果校正,得到兩種離子路徑在各個通道中
間位置時的速率常數。並加入鈉鉀離子同時存在的狀況,歸類出三十二種
state。(圖三)
動力學解釋了鉀離子選擇性的回復
動力學模型預測離子在通道中的能量越高、越不穩定時,通道整體的選擇性下
降,反之上升。此預測與 S177W – N184X 的實驗結果相似 (圖四 A)。除
此之外,作者也利用 model 預測鈉鉀兩種離子在通道中各個位置的能量差 (圖
四 B)。搭配圖二、圖三的兩種離子移動路徑,作者推測 N184D 突變株以高低
能量差的不同路徑使對鉀離子的選擇性回復。(圖六)
突變造成的選擇性消失與鉀離子選擇性的回覆無關
作者利用 S177G 以及 S177G – V188D 突變株證明。S177 的突變以及第二
點突變對通道的影響是各自獨立的。(圖五)
參考文獻
1. Hille B (2001) Ion Channels of Excitable Membranes (Sinauer,
Sunderland, MA), 3rd Ed.
2. Brelidze TI, Niu X, Magleby KL (2003) Proc Natl Acad Sci USA
100:9017–9022
3. Zhang Y, Niu X, Brelidze TI, Magleby KL (2006) J Gen Physiol
128:185–202
4. Fujiwara Y, Kubo Y (2006) J Gen Physiol 127:401–419.

圖表
圖一、將 S177W 的 N184 做突變,計算鈉鉀離子相對通透性以及正離子在通道中
的能量。
A. 帶負電性的替代胺基酸可以回復鉀離子選擇性。
B. 帶負電性的替代胺基酸可以增加正離子在通道中的穩定性。
圖二、單一種離子擴散模型。綠色的離子進入通道之
後會使原本來通道中的離子位移,將靠近出口的離子
擠入細胞膜內。
A. 簡易的代表模型。
B. 更加精確的模型。

圖三、各種不同的離子擴散模型
A. 可逆的鉀離子通透模型。
B. 通道中同時含有鈉鉀離子的可逆性擴散模型。
圖四、以動力學模型預測實驗測量的相對擴散性。
A. 實線為預測的相對擴散性對 cavity energy。方塊代表實測值。
B. 鈉離子 (紅色) 鉀離子 (藍色) 在通道中六個結合位置的能量。

圖五、S177G 突變株的非選擇性可以被
V188D 回復。
圖六、通道中離子的穩定程度影響鈉鉀離子移動時的 rate limiting step。
A. 鈉鉀離子在 S177W 中的 rate limiting step 是 b to e (path 2)。
B. 鈉鉀離子在 S177W – N184D 的 rate limiting step 是 a to d (path 1)。