馮資惠 - 黃慶璨研究室

生化科技研究所微生物與細胞專題討論
題目: Herpesvirus Tegument Protein UL37 Interacts with Dystonin/BPAG1 To
Promote Capsid Transport on Microtubules during Egress
作者:David Pasdeloup, Marion McElwee, Frauke Beilstein, Marc Labetoulle and
Frazer J. Rixon
文章來源:Journal of Virology 87(5):2857-2867, 2013.
演講人:Tzu-hui Feng 馮資惠 R01b22045
指導老師:Li‐Kwan Chang, PhD 張麗冠 博士
演講日期:April 15, 2013
演講地點:The 6th Classroom
摘要
Herpes simplex virus 1 (HSV-1)屬於皰疹病毒科,可感染人類上皮或是神經細胞,
並利用細胞中的微管系統,於細胞間作有效率轉移。HSV-1 病毒顆粒在感染細胞
後,透過負責與目標蛋白質結合而帶往運輸路徑的分子馬達(microtubule motors),
ex: dynein、kinesins,與病毒外鞘(capsid)結合,再與微管網絡結合,送入細胞核;
相對的,組裝好的病毒顆粒也可藉微管送出細胞外(egress),然而,其詳細機制
仍不明朗。而先前研究發現,HSV-1 的一種與外鞘蛋白質結合的鞘間蛋白質
(tegument protein),UL37,會協助病毒顆粒的 egress,但機制並不清楚。本篇研
究中,作者將研究 UL37 在病毒顆粒出膜時所調控的微管運輸機制。首先,作者
以 UL37 為餌,透過酵母菌雙雜合系統(Yeast-Two-Hybrid) 發現一類 spectraplakin
蛋白質,dystonin/ BPAG1,會與 UL37 結合,而在細胞中,dystonin/ BPAG1 扮
演著連結、組織細胞骨架(微管與肌動蛋白)的角色,因此,作者進一步研究
dystonin/BPAG1 與 UL37 結合時於外鞘運輸中的角色。若將 dystonin/BPAG1 抑
制表現,可發現病毒複製將降低;透過影像顯微鏡,可發現病毒外鞘至膜外的運
輸將會嚴重受阻,而在 UL37 受到抑制的情形下也有相同的結果。本研究指出,
病毒離開細胞時,外鞘會辨識鞘間蛋白質 UL37,再透過 UL37 與 dystonin/ BPAG1
之間的結合,而令外鞘可沿著微管運輸,令病毒顆粒得以釋出細胞。本發現為病
毒顆粒於細胞中的運輸提出更為詳細的機制,且 dystonin/ BPAG1 是首例非屬病
毒蛋白質或是細胞分子馬達的蛋白質,在病毒運輸中扮演關鍵角色的發現。
Keywords: Microtubules, Dystonin, Herpesvirus capsid egress, Tegument proteins

前言
本研究之重要性
HSV-1 是人類皰疹病毒科中的一類,由於其能利用人類細胞的微管系統,於
細胞間作有效率轉移(特別是感覺神經元細胞),而廣受注意。而目前對於 HSV-1 於細胞
內的運輸方式仍不甚明瞭,僅知可透過病毒外鞘與微管結合進而入核或出膜。而本研究
更進一步提出一種作為細胞骨架的 crosslinker,dystonin/BPAG1,證實將透過與鞘間蛋
白質 UL37 的相互作用而協助病毒顆粒出膜,是第一個提出非病毒蛋白質以及細胞分子
馬達蛋白質而能於病毒運輸中扮演關鍵角色的發現,為病毒於細胞中的運輸做一更深入
且新穎的解釋。
前人作過的研究
HSV-1為一類嗜神經性人類病毒,常透過微管網絡於細胞中轉移運輸[1, 2]。當感
染細胞時,病毒外鞘會從細胞膜處送入核膜中,並於核中釋出病毒基因,此過程被稱為
逆向運輸(retrograde transport)。在感染成功後,病毒大量複製時,病毒外鞘會於核內組
裝,透過正向運輸(anterograde transport/ plus-end-directed transport)送離核外。由於感染
神經元細胞之間的轉移需透過一段漫長的細胞本體到達突觸之間的輸送,因此,有效率
的病毒運輸在神經元細胞中更顯重要[3, 4]。目前研究指出,HSV-1 的外鞘(含鞘間蛋白
質)會與微管組織中的分子馬達,dynein 以及 kinesin-1/-2 結合[5],dynein 的複合體在外
鞘的運輸上扮演著必要的角色[6],而 kinesin-1 也參與在外鞘出膜的過程中[7]。另外,
研究也發現,HSV-1 的鞘間蛋白質 pUL36、37 也參與病毒顆粒的轉移[1]。然而,至今
除了病毒外鞘相關蛋白質以及細胞的分子馬達外,仍未有其他細胞蛋白質被發現可參與
病毒外鞘的出膜運輸中。
作者為何要作本研究
目前雖知 HSV-1 會感染神經細胞,並透過外鞘包覆基因,送入細胞核中,感染細胞
並製造病毒顆粒,再以相反的路徑組裝後出膜,但其具體的運輸路徑仍不明瞭,而由於
先前研究指出 UL37 雖然屬於鞘間蛋白質,卻會協助外鞘蛋白質的出核運輸,作者希望
更進一步探討 UL37 是如何參與外鞘蛋白質的出膜,透過酵母菌雙雜合系統,找出細胞
中可能與之作用參與外鞘運輸的蛋白質,以對外鞘的運輸有著更為詳盡的認識。
本研究欲完成之項目
本研究首先透過酵母菌雙雜合系統找尋與 HSV-1 之鞘間蛋白質,UL37,結合並可
能參與外鞘運輸的蛋白質,dystonin/ BPAG1,進一步找出兩者相互結合的部位。而後,
抑制 dystonin/ BPAG1 的表現,觀察 HSV-1 釋出的病毒顆粒數目是否改變。觀察 dystonin/
BPAG1 是否與病毒的外鞘蛋白質有著共同分布,而後,將更進一步利用活體顯微鏡觀
察 dystonin/BPAG1 與病毒外鞘的運輸的關聯,藉此確認 dystonin/ BPAG1 於病毒外鞘運
輸中扮演的重要性。

材料與方法
細胞株
非洲綠猿腎臟(Vero),293T,幼倉鼠腎細胞(BHK),人類胎兒包皮纖維細胞(HFFF2)培養
於含有 8% 小牛血清(FCS)的 DMEM 中。
活體顯微鏡 (Live-cell microscopy)
先將 HFFF2 細胞以 1 PFU/cell 的比例於室溫下感染 1 小時,在 37 度下培養 24 小時作為
前處理。首先,先設定在 37 度下,外鞘會透過 600ms 單位視窗,以平均距離~1.3μm,
~2μm/s 的速度移動。而這樣的條件僅容許小量的外鞘於大空間中移動。在一般感染條
件下,無數移動中的外鞘將會存在於小空間中,導致難以偵測。因此,活體顯微鏡將設
定在 25 度下觀察,而影片皆以 55~60 秒為一單位,平均曝光時間為 200ms。
外鞘追蹤(Capsid tracking)
外鞘以 Particles Detector&Tracker plug-in (version 1.5)追蹤。根據每一影片的質量,偵測
參數設定為半徑 3 or 5, cutoff 3.0 或 0.0, percentile 0.6 to 1.5%; 連結參數為 連結範
圍 2 而 displacement 10 to 20。外鞘運動將透過軟體分析,而外鞘追蹤時間由外鞘進入
視野後直到離開視野或是目標範圍後停止。
Single-step virus growth
將培養於 35mm 圓孔中分別表現 shControl、shDyst1、以及未送 shRNA 的 HFFF2 細胞
以 5 PFU/cell 的 HSV-1strain 17+ 感染,37 度下待 1 小時,再以低 pH 清洗後,加入 1 ml
DMEM,於 37 度下培養。於感染後 6、12、24、48 小時後分別收取時間點,離心後取
上清,測定病毒顆粒數量。
Yeast two-hybrid assay
將 pLexA-UL37 HSV-1 透過醋酸鋰轉型入 L40 菌株中,再以 tryptophane-deleted agar plate
做篩選;另一方面,以 pGAD-GH 轉殖入 PC12 細胞所抽取的 cDNA library 作為轉殖菌
株,以參考文獻所示,進行篩選,共計 127000 個轉型株中,有 27 個呈現正向反應。
結果與討論
UL37 會與 dystonin 的 plakin 區塊相互結合
首先,透過酵母菌雙雜合系統,以 pLexA-UL37 為餌,自 127000 種蛋白質中測試
是否會與 UL37 結合且參與外鞘運輸的蛋白質,從中找到一種蛋白質 dystonin,結果顯
示,UL37 會與 dystonin 的 plakin 區塊結合,並透過免疫沉澱法證實。由於其一般情況
下具有與微管結合以及協助正向以及負向運輸的功能,且表皮以及神經細胞於受到
HSV-1 感染時,也被發現會被誘導表現,因此,作者決定就 dystonin 做更進一步的探討。

HFFF 細胞中降低 dystonin 的表現,並觀察其分布狀況
作者在 HFFF2 細胞中透過 shRNA 靜默技術抑制 dystonin 的產生,並以 RT-PCR 偵
測 dystonin 的 mRNA 含量,以免疫螢光法觀察 dystonin 的分布。結果可發現 dystonin
多沿著微管分布,且位置與微管正端的蛋白質 EB3 吻合,證實 dystonin 確實為分布於微
管的正端。另一方面,作者也證實,在 HSV-1 感染 16 小時的細胞中,微管的分布較不
具有組織性。
Dystonin 參與 HSV-1 的病毒顆粒釋出
為了確認 dystonin 是否會參與病毒顆粒釋出,作者對比抑制 dystonin 與否的組別,
在不同時間點(6,12,24,48 小時),收取上清偵測病毒數量,繪成病毒顆粒釋出的趨
勢圖,結果可發現,在 24 小時之內,dystonin 受到抑制的組別其病毒顆粒的釋出也顯著
的低於不受到抑制的組別。且另一方面,作者在同樣條件下,外送一類微管抑制藥物,
Nocodazole,結果發現,病毒顆粒的釋出也有下降,且病毒顆粒生成趨勢與 dystonin 受
到抑制時的趨勢相似。綜合以上結果,dystonin 會參與 HSV-1 的病毒釋出,且可能與微
管有關。
Dystonin 透過 UL37 而能與病毒的外鞘蛋白共同分布
為了探討 dystonin 是如何參與 HSV-1 egress 時的運輸,作者首先將探討 dystonin 與病毒
外鞘蛋白質之間的關聯性。作者在外送 HSV-1 的外鞘蛋白質 VP26 的 HFFF2 細胞中,
對比在 UL37 表現與否的細胞中,觀察內生的 dystonin 的分布。結果可見,僅有在表現
UL37 的細胞中,dystonin 才會與病毒的外鞘蛋白質共同分布,且時間極為短暫。表示
dystonin 需要藉由 UL37 才能辨識病毒外鞘蛋白質的位置,並與之共同分布,然而,這
樣的結合可能是過渡性瞬時的。
Dystonin 在病毒 egress 時扮演著關鍵的角色
藉由前述發現,作者認為 dystonin 可能是藉由參與外鞘蛋白質的運輸,協助病毒顆
粒的 egress。為了測試該假設,作者利用可表現病毒外鞘的的細胞,偵測 dystonin 受到
抑制時,其外鞘的運輸是否受到影響。結果可發現,在 dystonin 受到抑制的細胞中,外
鞘參與 anterograde 運輸的比例從原先的 50%下降至 0%,且外鞘最長移動距離由原先的
5.6μm 下降為 0.54μm,速度則由 0.95μm/s 降為 0.19μm/s,且在外加微管抑制藥物,
nocodazole 時,也有相似的結果,此外,在不表現鞘間蛋白質 UL37 時,也觀察到如
dystonin 被抑制時的結果。
由本處結果可知,dystonin 在病毒 egress 時,在外鞘的運輸上,扮演著主要的角色。
Dystonin 並非透過協助微管穩定而參與至病毒外鞘的 egress
由於 HSV-1 已被報導會在感染末期引發微管系統的重組,而在正常情形下,dystonin
則具有將微管帶往與肌動蛋白組成的細胞骨架結合,穩定微管的結構的功能。作者擔心
是否在實驗過程中,在 HSV-1 感染的條件下,又抑制了 dystonin 的合成,而令細胞骨架
不穩定,因此造成先前實驗所見,在抑制 dystonin 時病毒運輸受到抑制的現象。為排除
此因素,作者在正常細胞中,對比外加微管干擾藥物與 dystonin 抑制條件下,觀察微管
以及 F-actin 的分布。結果發現,對比外加微管干擾藥物,nocodazole,會令微管解構的
現象,dystonin 的抑制並不會影響微管的結構組成,僅會於核內造成微管較為密集的分

布;而在感染 HSV-1 時,雖然微管的分布較為失序,但對比 dystonin 存在與否下,微管
的分布並不像外加微管干擾藥物般,微管聚合體受到解構。由上測試可知,dystonin 的
抑制並不會像外加 nocodazole 般,干擾微管網絡的分布。
參考文獻
1. Antinone, S.E. and G.A. Smith, Retrograde axon transport of herpes simplex virus
and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. J Virol, 2010. 84(3): p.
1504-12.
2. Lyman, M.G. and L.W. Enquist, Herpesvirus interactions with the host cytoskeleton. J
Virol, 2009. 83(5): p. 2058-66.
3. Mabit, H., et al., Intact microtubules support adenovirus and herpes simplex virus
infections. J Virol, 2002. 76(19): p. 9962-71.
4. Sodeik, B., M.W. Ebersold, and A. Helenius, Microtubule-mediated transport of
incoming herpes simplex virus 1 capsids to the nucleus. J Cell Biol, 1997. 136(5): p.
1007-21.
5. Radtke, K., et al., Plus- and minus-end directed microtubule motors bind
simultaneously to herpes simplex virus capsids using different inner tegument
structures. PLoS Pathog, 2010. 6(7): p. e1000991.
6. Dohner, K., et al., Function of dynein and dynactin in herpes simplex virus capsid
transport. Mol Biol Cell, 2002. 13(8): p. 2795-809.
7. Miranda-Saksena, M., et al., Herpes simplex virus utilizes the large secretory vesicle
pathway for anterograde transport of tegument and envelope proteins and for viral
exocytosis from growth cones of human fetal axons. J Virol, 2009. 83(7): p. 3187-99.