徐詩媁 - 黃慶璨研究室

生化科技研究所微生物與細胞專題討論
題目 : A Pseudomonas aeruginosa Toxin that Hijacks the Host Ubiquitin Proteolytic System
作者:Jennifer M. Bomberger, Siying Ye, Daniel P. MacEachran, Katja Koeppen,
Roxanna L. Barnaby, George A. O'Toole, Bruce A. Stanton
文章來源:PLoS Pathogens 7(3):e1001325, 2011.
演講人:Shih-Wei Hsu 徐詩媁 R00B22006
指導老師:Li-Kwan Chang, PhD 張麗冠 博士
演講日期:December 5, 2011
演講地點:The 6th Classroom
摘要
綠膿桿菌 (P. aeruginosa)是一種伺機性病原體,常見於具有慢性阻塞性肺病
(COPD)、肺炎、囊腫性纖維化 (CF)及支氣管擴張症疾病患者的肺部感染。CFTR
(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)是一個穿膜通道蛋白質,能幫助
細胞中氯離子的排出,有利於清除呼吸道黏液,引起免疫反應。由綠膿桿菌外膜囊
泡 (outer membrane vesicles, OMV)所分泌出的一種細菌毒素 Cif 會影響 CFTR 調節
氯離子的能力,進而影響黏液纖毛清除功能 (Mucociliary clearance)。本篇研究主要
探討 Cif 如何影響 CFTR 的功能。作者發現 Cif 能藉由穩定去泛素酵素 USP10 與
G3BP1 之間的結合,而使 USP10 失去活性,降低了 USP10 對 CFTR 的去泛素作用,
造成被泛素修飾的 CFTR 經內吞作用後,由原本的 recycling endosomes 轉向到溶體
而最終被降解。本篇研究首次提出細菌毒素具有調節宿主細胞 DUB 活性的能力,
其對於 P. aeruginosa 感染人體的機制將有更進一步的了解。
Key words: P. aeruginosa、CFTR、Cif、USP10、G3BP1
本研究之重要性
前言
P. aeruginosa 為伺機性病原體,與呼吸道的感染以及肺部疾病相關。常會造成有肺
部疾病的患者更加嚴重的肺部感染。本研究是第一個發現細菌所分泌的毒素具有調
節宿主細胞 DUB 活性的能力,有助於了解 P. aeruginosa 感染人體細胞的機制。
前人作過的研究
先前的研究已提出 Cif 能藉由影響 CFTR 經內吞作用後內體 (endosomes)的循環路
徑,造成 CFTR 轉向到溶體降解,而大幅降低了 CFTR 在呼吸道上皮細胞的表現量。
(1)另外先前的研究也已經指出 USP10 能將 CFTR 去泛素化,因此能減少 CFTR 在
溶體的降解(2)。

作者為何要作本研究
綜合先前的研究了解了 USP10 能降低 CFTR 的降解使其能回到細胞膜表現,但 P.
aeruginosa 所分泌的 Cif 卻使得 CFTR 的降解增加,降低了 CFTR 的表現。雖然 Cif
與 USP10 同時作用在 CFTR 上,但兩者之間的相互關係並不清楚。
本研究欲完成之項目
本篇研究作者將探討細菌毒素 Cif 與 USP10 對 CFTR 在內體循環影響的機制,進而
了解抑制 P. aeruginosa 對宿主感染的方式。
細胞株
材料與方法
實驗中所使用的細胞為 CFBE41o,是一種不能表現正常 CFTR 的人類呼吸道上皮細
胞,作者在此細胞中穩定表現 wt-CFTR,以觀察 Cif 在 CFTR 降解中所扮演的角色。
DUBs 活性分析
將 0.1g 的 HA-UbVME 探針加入細胞溶解上清液或 CFBE 細胞的早期內體分離層,
HA-UbVME 會與具有活性的 DUBs 形成不可逆的共價鍵結,接著利用抗 HA 抗體
進行免疫沉澱分離 HA-UbVME-DUB 複合體,並以 DUBs 抗體進行西方點墨法偵測。
早期內體 (early endosome)之分離
將 CFBE 細胞回溶於 600 ul 的 HEPES buffer (250mM sucrose,10mM HEPES,0.5mM
EDTA pH7.4)中,以 Dounce homogenizer 將細胞均質化,以低轉速(3000 x g)離心後,
將上清以 1:1 的比例稀釋於含 62%蔗糖的 HEPES buffer 中,將其放入 4.4ml 超高速
離心管的底部,接著依序加入 1.5ml 含 35%、25%蔗糖的 HEPES buffer,最後加入
0.5ml 的 HEPES buffer,以 167,000 x g 於 4°C 離心 75 分鐘。離心後分離出的梯度
以 Rab5a 做為早期內體分離層的指標。
細胞膜內體、溶體胞器之分離
利用不同的離心轉速及 Optiprep 濃度梯度分離細胞中的細胞膜、內體以及溶體。並
以不同的蛋白質做為各分離層的指標 (細胞膜-Na/K ATPase,內體-EEA-1, 溶體-
LAMP-1)。
泛素化修飾分析
將細胞回溶於 boiling lysis buffer (2%SDS,1mMEDTA,50mM sodium fluoride)中,並
於 100℃加熱 10 分鐘,冷卻至室溫後加入 4 倍體積的 dilution buffer (2.5%
TritonX-100, 12.5mM Tris, pH7.5, 187.5 mM NaCl),加入 5g 的抗 CFTR 抗體進行免
疫沉澱,並以抗 ubiquitin 抗體進行西方點墨法分析,以偵測 CFTR 的泛素化修飾。
RNA 干擾
將 0.1X10 6 的呼吸道上皮細胞培養於 24mm 的 Transwell permeable membrane,在第
四天時將 siRNA 以 HiPerfect 轉染試劑轉染至細胞中。

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)共軛焦顯微技術
將 YN-USP10 與 YC-G3BP1 轉染於 0.1X10 6 CFBE 細胞,兩天後再以能表現
RFP-Rab5a 的 baculovirus 感染細胞,接著將細胞培養於含有或缺乏 Cif 的 OMV 環
境下 15 分鐘,並以 4%的 paraformaldehyde 固定後以 Nikon Sweptfield 共軛焦顯微
鏡偵測影像。
Cif 促進 CFTR 走向溶體降解的路徑
結果與討論
為了瞭解 CFTR 在上皮膜減少的機制,作者一開始以 Cif 影響細胞不同時間下後檢
查 CFTR 在細胞膜上總量的變化。作者首先從 P. aeruginosa 分離出含 Cif 細菌毒素
的 OMV,後以 OMV 與上皮膜細胞共同作用後以西方點墨法分析整體細胞以及在
上皮細胞膜中 CFTR 的量,實驗結果顯示 Cif 可以快速的降低 CFTR 在細胞中整體
以及細胞膜上的量。另外從被 P. aeruginosa 感染的臨床檢體分離出的 OMV 也能使
CFTR 降低,但若 OMV 中不含 Cif 則對 CFTR 的量沒有影響。因先前研究已指出
Cif 可以減少 CFTR 的內體循環 (endosome recycle)回到細胞膜的路徑(1),故為了釐
清 Cif 是如何改變 CFTR 運輸的機制,作者利用密度梯度純化的方式,純化出上皮
膜細胞的內體並以含有 Cif 的 OMV 或 Cif 突變株的 OMV 與其共同作用後利用不
同細胞內分隔區內上所表現不同的蛋白質做標示 (early endosomal-Rab5a,recycling
endosomal -Rab11a,late endosomal-Rab7a)以共免疫沉澱法確認 CFTR 在細胞內運輸
的情形。實驗結果證實 Cif 能使 CFTR 從原本朝循環內體回到細胞膜的路徑改變成
走向溶體降解的路徑。另外作者也利用不同的離心轉速及 Optiprep 濃度梯度分離細
胞中的細胞膜、內體以及溶體並分析在經 OMV 作用後 CFTR 在各區域表現的情形,
實驗結果顯示當細胞經 Cif 作用後 CFTR 在細胞膜及內體的表現量大量下降,在溶
體的量則增加。而控制組細胞的 CFTR 則大多出現在細胞膜區域及內體區域,只有
少數的出現在溶體部份。這項結果也顯示 Cif 能藉由改變 CFTR 從原本朝循環內體
回到細胞膜的路徑轉為走向溶體降解的路徑而造成細胞膜上的 CFTR 降低。
Cif 增加 CFTR 的泛素修飾並使 CFTR 到溶體降解
因先前的研究已經指出被泛素修飾的 CFTR 會經由溶體路徑降解(2, 3),為了提出更
多的證據證實 Cif 確實能促使 CFTR 更走向溶體裂解的路徑,作者以 OMV 與細胞
共同作用並分別以 proteasome 抑制劑或溶體的抑制劑處理細胞,結果顯示以溶體抑
制劑處理的細胞因 Cif 作用而造成 CFTR 降解作用的情形降低,證明了 Cif 是影響
CFTR 由溶體降解的路徑而使得 CFTR 的表現量下降。另外以 Cif 作用並以溶體抑
制劑處理的細胞,以免疫沉澱法及利用泛素抗體進行西方點墨法分析後實驗結果顯
示 Cif 會增加 CFTR 的泛素修飾而使得 CFTR 整體的量降低。

Cif 能降低 USP10 的活性
Cif 可能是透過活化 CFTR 的 E3 ligase 或是抑制 DUB 的活性而使得 CFTR 的泛素修
飾增加並使其在溶體降解,作者在先前的研究已經指出 DUB USP10 能將 CFTR 去
泛素化(2),為了瞭解 Cif 是否藉由抑制 USP10 的活性使得 CFTR 的泛素修飾增加,
作者利用去泛素化活性測試 (DUB activity assay)去測量 USP10 在 Cif 影響下在 early
endosome (EE)中的活性,實驗結果顯示 Cif 能抑制 49±4%的 USP10 活性,而 Cif
卻無法抑制其他同時也存在在 EE 的其他 DUBs,顯示 Cif 對 USP10 有專一性的作
用。另外作者使用 siUSP10 將 USP10 抑制後發現實驗結果與細胞經 Cif 作用後相同,
與對照組相比皆使 CFTR 的泛素修飾增加。
Cif 藉由穩定 USP10 與 G3BP1 的結合以抑制 USP10 的活性
接著作者想了解 Cif 是如何去抑制 USP10 的活性。因先前研究指出 USP10 和 G3BP1
有相互結合關係(4, 5),且在 U2OS 細胞 USP10 和 G3BP1 的結合會使 USP10 的去泛
素酵素活性消失(5),另外作者也曾發現 Cif 與 G3BP1 有相互結合關係,根據這幾項
證據,作者推測 Cif 是藉由穩定 USP10 與 G3BP1 的結合以抑制 USP10 的活性,故
作者去測試了 Cif 是否會穩定 USP10 與 G3BP1 的結合而使得 USP10 與 CFTR 的結
合下降造成 USP10 對 CFTR 的作用降低,結果顯示 Cif 能使 USP10 與 G3BP1 的結
合增加 210±12%此外 Cif 也使得 USP10 與 CFTR 的結合下降 50±6%。另外作者也利
用 BiFC 共軛顯微技術確認 USP10 和 G3BP1 在 early endosome 中有相互結合關係,
且在 Cif 的作用下能使 BiFC 的訊號增強 4.35±0.30 倍顯示 Cif 確實能穩定 USP10
和 G3BP1 的結合。最後為了更加確認 G3BP1 在其中扮演的角色,作者以 RNAi 的
方式將 G3BP1 的表現降低後再去觀察 Cif 影響 CFTR 的變化,結果顯示當 G3BP1
被抑制後,Cif 抑制 USP10 活性的能力即消失,且 Cif 造成 CFTR 泛素修飾的能力
也會受阻也使得 CFTR 經由溶體裂解的現象減少。
參考文獻
1. A. Swiatecka-Urban et al., Am J Physiol Cell Physiol 290, C862 (Mar, 2006).
2. J. M. Bomberger, R. L. Barnaby, B. A. Stanton, J Biol Chem 284, 18778 (Jul
10, 2009).
3. M. Sharma et al., J Cell Biol 164, 923 (Mar 15, 2004).
4. M. Cohen, F. Stutz, C. Dargemont, J Biol Chem 278, 51989 (Dec 26, 2003).
5. C. Soncini, I. Berdo, G. Draetta, Oncogene 20, 3869 (Jun 28, 2001).

圖表
Cif 藉由抑制 USP10 活性而導致 CFTR 在上皮膜細胞減少
細胞在未受感染下 (左圖),CFTR 藉由經過早期內體及 recycling endosome 維持穩
定的循環回到細胞膜上,但在有 P. aeruginosa 感染下 (右圖),細菌所分泌的毒素
Cif 會穩定 G3BP1 與 USP10 的結合,而減少 USP10 與 CFTR 之間的相互關係,使
得 CFTR 回到細胞膜的路徑降低,趨向到溶體裂解的路徑。