張詠寧

微生物與生化學研究所微生物學組專題討論
題目:Production of functional bacteriorhodopsin by an Escherichia coli cell-free
protein synthesis system supplemented with steroid detergent and lipid
作者:Kazumi Shimono, Mie Goto, Takashi Kikukawa, Seiji Miyauchi, Mikako
Shirouzu, Naoki Kamo, Shigeyuki Yokoyama
文章來源:Protein Science, 2009 Oct 18(10): 2160-71
演講人:Yung-Ning, Chang 張詠寧
指導老師:Chii-Shen, Yang PhD 楊啟伸 博士
演講日期:November 2, 2009
演講地點:The 6 th classroom
摘要
近年來無細胞蛋白質合成系統 ( Cell-free protein synthesis system )有極大的
發展與突破。此系統能避開表現系統細胞環境對異源蛋白質大量表現的影響,也
可自行添加提高蛋白質表現量的有效物質;對於一些傳統上難以大量表現的目標
蛋白質 ( 如膜蛋白質 ),有潛力利用此系統提高表現效率。本篇作者利用古生
菌的氫離子幫浦細菌視紫質 ( bacteriorhodopsin, BR )作為模式膜蛋白質,建構出
一個無細胞蛋白質合成系統,與透析方式結合後可讓膜蛋白質成功表現並立即受
到微脂體( liposome )包裹。作者測試多種不同界面活性劑 ( detergent ),發現在
系統中同時使用類固醇界面活性劑與磷脂基膽鹼 ( egg phosphatidylcholine, egg
PC )可得到最高量且具有功能性之細菌視紫質。在經過純化及光週期與氫離子幫
浦能力測試,最終純度及具功能性蛋白質比例均可達到 80 %以上。
Keywords:cell-free protein expression, membrane protein, bacteriorhodopsin, steroid
detergent, liposome, dialysis, photochemical reaction
本研究之重要性
前言
膜蛋白質掌握著與細胞向外溝通的管道,一直是科學界的重點研究之ㄧ。
然而大量表現及純化膜蛋白質並非易事,原因在於其表現條件與表現量難以掌
握。無細胞蛋白質合成系統 ( Cell-free protein synthesis system ) 的發展及應
用,可望在膜蛋白質的表現上有所突破。本研究改善現有系統,透過透析,將
反應中原有界面活性劑與脂質混合微胞 ( micelle )中之界面活性劑慢慢移除,
使膜蛋白質進入微脂體中,可獲得較高量且具有功能的目標蛋白質產物。
前人作過的研究
無細胞表現系統基本上可稱為 in vitro translation 或 transcription/translation
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system。因此反應混合物中必須包含所有轉譯及轉錄所需的分子,如 tRNA、
RNA polymerase 及 ribosome,及維持酵素活性的輔酶等等。基本上大部分的分
子都存在於細胞萃取物 ( cell extract )中,目前常用的有 E.coli S30 extract 及
wheat germ extract;除了細胞萃取物外,還要外加許多反應物如胺基酸 (見本
篇材料與方法)。模板 DNA 部分,可以選擇質體或 PCR 產物,以現有系統來
說,兩者的蛋白質產量差異不大。同樣地,DNA 模板的設計除了目標基因外,
也必須包含和轉錄、轉譯過程相關的所有區域 ( 如下圖一[1] )。
圖一 DNA template for cell-free expression
整個無細胞合成反應即是將 DNA 模板加入 reaction mixture ( RM,包含轉
譯轉錄過程必需的所有分子 ) 中,在適當溫度下培養數個小時至過夜,讓蛋
白質合成。以上所述是最簡單的無細胞合成系統裝置,稱為 batch system,所
有合成步驟都在 RM 中進行。但後續研究發現,在蛋白質生成過程中產生的抑
制物明顯影響反應進行,而導致蛋白質產量減少。為了解決此問題,科學家建
立另一種 CECF ( continuous exchange cell-free system ) 系統。CECF 系統將 RM
以透析膜和 feeding mixture ( FM,大致成分和 RM 相同但不含 DNA 模板 ) 隔
開,如此一來造成影響的抑制分子便可透過透析模擴散至 FM 中,且不足的胺
基酸也可由 FM 中獲得補充,使蛋白質的總產量大幅增加。( 如下圖二[2] )
在合成膜蛋白質的無細胞表現系統
中還必須加入界面活性劑,以有效穩定
高疏水性的膜蛋白質;除了界面活性劑
外也可以加入脂質,如圖二下半部所
示。由於無細胞表現系統的便利性,近
年來被認為可應用於膜蛋白質大量表
現。用以測試的膜蛋白質除了本篇使用
的細菌視紫質外,也包括真核生物 G 蛋
白質耦合受器 ( GPCR )。目前已有多種
膜蛋白質成功由無細胞系統大量表現,
也有因此得到蛋白質 X 光繞射結構的例
子。
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圖二 Versatility of CF expression systems for the production of MPs

作者為何要作本研究
在無細胞表現系統中,由於膜蛋白質本身疏水性較高,一被轉譯出來很容
易聚集沉澱。為了避免此問題,在反應混合物中加入界面活性劑微胞,使蛋白
質合成過程中可以受界面活性劑穩定。近年來,以脂質取代界面活性劑的系統
已被研發;若可讓膜蛋白質在合成過程中進入微脂粒中,只要選擇適當的脂
質,便能讓膜蛋白質處於較接近自然環境的膜系,對於功能性研究也有很大幫
助。Nozawa 等人利用 wheat-germ 無細胞表現系統合成植物 transporter [3],發
現若同時加入微脂粒和界面活性劑 Brij35,可成功得到包埋於微脂粒中且有功
能的蛋白質。本篇作者嘗試改良原有的 E.coli 膜蛋白質無細胞表現系統,希望
在與透析方法結合後也能達到同樣目標,並進一步提高表現產量。
本研究欲完成之項目
本篇作者調整原有的 E.coli 膜蛋白質無細胞表現系統,以細菌視紫質作為
模式蛋白質,透過測試不同種類界面活性劑和磷脂基膽鹼混合微胞,找出最佳
的反應系統條件。此外經由光週期與氫離子幫浦活性測試,確定合成蛋白質具
有正常功能。最後將再次純化後的蛋白質進行養晶,也得到細菌視紫質的微晶
體,顯示其純度足以進行結構解析。
建構表現質體
材料與方法
利用兩步 PCR 反應在細菌視紫質蛋白質基因 ( 由已建構於 pET vector 裡
的基因以 PCR 反應放大 ) 前加上 T7 promoter,N 端 His tag 與 TEV cleavage
site,在其後加上 T7 terminater sequence [4]。最後將 PCR 產物放入 pCR2.1-TOPO
質體中。
無細胞表現
本實驗使用透析模 ( cut-off 為 15 kDa ) 分隔 reaction solution mixture (RM)
和 feed solution mixture(FM)。RM 中包含 10 g/mL plasmid,10 mM Mg(OAc)2,
60 mM HEPES-KOH buffer (pH 7.5),4% PEG8000,200 mM potassium
glutamate,1.9 mM DTT,1.3 mM ATP,0.9 mM GTP,0.9 mM CTP,0.9 mM
UTP,35.8 mg/mL folic acid,0.66 mM cAMP,27.6 mM ammonium acetate,80
mM creatine phosphate,0.25 mM creatine kinase,0.25 mg/mL E.coli total tRNA,
0.3 volume E.coli S30 extract, 3 mg/mL T7 RNA polymerase,1.5% NaN3,0.28
mg/mL tyrosine。其他 19 種胺基酸 ( 除 tyrosine 外 ) 濃度皆為 1.5 mM。
此外外加 6.7 mg/mL egg PC 之 MLV ( multilamellar vesicles ) 或 SUV( small
unilamellar vesicles )和 100 M all-trans retinal (溶於 EtOH )。用以測試的界面活
性劑種類如下:。n-octyl-b-D-glucoside ( OG ),Triton X-100,Brij58,digitonin,
n-dodecyl-b-D-maltoside ( DDM ),sodium cholate,CHAPS,lauryl sarcosine,
sodium deoxycholate,pentadecafluorooctanoic acid,sodium dodecyl sulfate。
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調整RM與FM的比值為1比10,FM成份與RM大致相同但不含模板DNA、
creatine kinase、tRNA、S30 extract、detergent及lipid。此外FM中再加入60 mM
KOAc, 10 mM Tris-OAc buffer ( pH 8.2 ), 16 mM Mg(OAc)2及8.94 mM DTT。
RM總體積為0.9或4.5 mL,在30℃反應6小時。
檢驗細菌視紫質蛋白質折疊是否完全
將無細胞系統合成後之沉澱物懸浮於 high-salt buffer 中(含 50mM Tris-HCl
與 400 mM NaCl ),加入 1% DDM 後以 20,400g 離心 5 分鐘,上清液進行全光
譜掃描,以 560 nm 吸收值估計正確摺疊的 BR 量。BR 總分子量約 31.4 kDa,
molar extinction coefficient 為 42,000。
Sucrose density gradient sedimentation analysis
將無細胞系統合成後之沉澱物以 PBS 清洗後懸浮於 high salt buffer 中,超
音波震盪共 45 秒,以 5000 rpm 離心 5 分鐘,上清液進行梯度離心。梯度:50%
( 2.5 mL ) 40% ( 2 mL ) 30% ( 2 mL ) 10% ( 2.5 mL ) ( sucrose 濃度: w/w )離心
100,000g 共 12 小時。
脂質定量
利用Fiske-Subbarow method定量。將樣本中的磷脂質以同體積的氯仿與甲
醇萃取出,經離心後取氯仿層並乾燥,即得到乾燥磷脂質。將乾燥磷脂質溶於
100 L純水中,加入250 L 10N H2SO4後於170℃加熱2小時。冷卻後加入100 L
含有5% ammonium molybdate、2.2 mL of H2O與 100 L Fiske-Sabbarow reagent
( 0.125 g 1-amino-2-naphthol-4-sulfonic acid, 0.25 g sodium sulfite, 7.5 g sodium
bisulfite per 50 mL ) 混合後於100℃加熱5分鐘。冷卻後測量750 nm吸光值。
Flash photolysis and photoelectrochemical measurements
使用雷射光為Nd-YAG雷射 ( 波長532 nm,一次打7 ns,約5 mJ/pulse )。
記錄380, 410, 450, 500, 550, 570, 610, 650與680 nm下的吸光值改變。此外將50
L樣本置於SnO2電極上乾燥,測量氫離子幫浦能力。
細菌視紫質純化
將 BR 樣本置於含 50 mM Tris buffer,100 mM NaCl 及 1% DDM 溶液中過
夜。以超高速離心去除沉澱,上清部分以 HisTrap column 純化,之後以 TEV
protease 切除 N 端 tag 並透析過夜。再將樣本通過 HisTrap column 去除 TEV
protease,流出液濃縮後進行 size-exclusion chromatography。
結果與討論
加入 cholate 與 egg PC 所形成的混合微胞最適於大量表現 BR
為了避免新合成蛋白質聚集沉澱,作者在 reaction mixture 中加入界面活性
劑與 eggPC 形成的混合微胞,提供新生蛋白質適當的疏水環境。經由測試不
同種類界面活性劑,發現使用 cholate 和 CHAPS 可獲得較多正確摺疊的蛋白
質。由於 cholate 的 cmc ( critical micelle concentration ) 較高且形成之微胞較
小,有利於後續分析,本研究採用 cholate 與 eggPC 形成的混合微胞。
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合成出的 BR 蛋白質確實包埋於微胞中
為了確定合成出的 BR 是否有效進入微胞,作者將合成反應後的可溶部分
進行 sucrose density gradient centrifugation,分析不同密度層之脂質濃度與正確
摺疊蛋白質濃度之間的相關性。發現正確摺疊的 BR 和 lipid 幾乎處於同一個
密度層中,顯示 BR 的確包埋於微胞中。
包埋於微胞中的 BR 蛋白質具有正常光週期與氫離子幫浦活性
作者將由嗜鹽菌紫膜 ( purple membrane ) 萃取出的 native BR 置換至 egg
PC liposome 中,和無細胞合成得到的 BR-liposome 進行光週期性質及氫離子
幫浦活性測量。結果顯示無細胞合成的 BR-liposome 和 native BR-liposome 光
週期性質幾乎相同。利用 SnO2 電極也可測量到 BR 在光照下具有運送氫離子
的能力,顯示此無細胞合成系統所得的蛋白質具有正常活性。
經過純化可得到正確摺疊比率大於 80 %的 BR 蛋白質
為了去除未折疊的 BR 並得到更高純度的蛋白質,作者將反應完之 reaction
mixture 以 HisTrap column 純化,再以 TEV protease 切去 N 端 tag 並經 HisTrap
column 去除 protease 後,通過尺寸大小排除層析法純化,蛋白質最終濃度約為
10 mg/mL,測試發現其正確摺疊比率可達 80%至 100%。作者並將此樣本進行
蛋白質結晶,可成功得到 BR 的微結晶 ( microcrystal ),顯示無細胞合成的蛋
白質經由再次純化,可達到解析結構所要求的純度。
參考文獻
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