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張詠寧

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微生物與生化學研究所微生物學組專題討論<br />

題目:Production of functional bacteriorhodopsin by an Escherichia coli cell-free<br />

protein synthesis system supplemented with steroid detergent and lipid<br />

作者:Kazumi Shimono, Mie Goto, Takashi Kikukawa, Seiji Miyauchi, Mikako<br />

Shirouzu, Naoki Kamo, Shigeyuki Yokoyama<br />

文章來源:Protein Science, 2009 Oct 18(10): 2160-71<br />

演講人:Yung-Ning, Chang <strong>張詠寧</strong><br />

指導老師:Chii-Shen, Yang PhD 楊啟伸 博士<br />

演講日期:November 2, 2009<br />

演講地點:The 6 th classroom<br />

摘要<br />

近年來無細胞蛋白質合成系統 ( Cell-free protein synthesis system )有極大的<br />

發展與突破。此系統能避開表現系統細胞環境對異源蛋白質大量表現的影響,也<br />

可自行添加提高蛋白質表現量的有效物質;對於一些傳統上難以大量表現的目標<br />

蛋白質 ( 如膜蛋白質 ),有潛力利用此系統提高表現效率。本篇作者利用古生<br />

菌的氫離子幫浦細菌視紫質 ( bacteriorhodopsin, BR )作為模式膜蛋白質,建構出<br />

一個無細胞蛋白質合成系統,與透析方式結合後可讓膜蛋白質成功表現並立即受<br />

到微脂體( liposome )包裹。作者測試多種不同界面活性劑 ( detergent ),發現在<br />

系統中同時使用類固醇界面活性劑與磷脂基膽鹼 ( egg phosphatidylcholine, egg<br />

PC )可得到最高量且具有功能性之細菌視紫質。在經過純化及光週期與氫離子幫<br />

浦能力測試,最終純度及具功能性蛋白質比例均可達到 80 %以上。<br />

Keywords:cell-free protein expression, membrane protein, bacteriorhodopsin, steroid<br />

detergent, liposome, dialysis, photochemical reaction<br />

本研究之重要性<br />

前言<br />

膜蛋白質掌握著與細胞向外溝通的管道,一直是科學界的重點研究之ㄧ。<br />

然而大量表現及純化膜蛋白質並非易事,原因在於其表現條件與表現量難以掌<br />

握。無細胞蛋白質合成系統 ( Cell-free protein synthesis system ) 的發展及應<br />

用,可望在膜蛋白質的表現上有所突破。本研究改善現有系統,透過透析,將<br />

反應中原有界面活性劑與脂質混合微胞 ( micelle )中之界面活性劑慢慢移除,<br />

使膜蛋白質進入微脂體中,可獲得較高量且具有功能的目標蛋白質產物。<br />

前人作過的研究<br />

無細胞表現系統基本上可稱為 in vitro translation 或 transcription/translation<br />

1


system。因此反應混合物中必須包含所有轉譯及轉錄所需的分子,如 tRNA、<br />

RNA polymerase 及 ribosome,及維持酵素活性的輔酶等等。基本上大部分的分<br />

子都存在於細胞萃取物 ( cell extract )中,目前常用的有 E.coli S30 extract 及<br />

wheat germ extract;除了細胞萃取物外,還要外加許多反應物如胺基酸 (見本<br />

篇材料與方法)。模板 DNA 部分,可以選擇質體或 PCR 產物,以現有系統來<br />

說,兩者的蛋白質產量差異不大。同樣地,DNA 模板的設計除了目標基因外,<br />

也必須包含和轉錄、轉譯過程相關的所有區域 ( 如下圖一[1] )。<br />

圖一 DNA template for cell-free expression<br />

整個無細胞合成反應即是將 DNA 模板加入 reaction mixture ( RM,包含轉<br />

譯轉錄過程必需的所有分子 ) 中,在適當溫度下培養數個小時至過夜,讓蛋<br />

白質合成。以上所述是最簡單的無細胞合成系統裝置,稱為 batch system,所<br />

有合成步驟都在 RM 中進行。但後續研究發現,在蛋白質生成過程中產生的抑<br />

制物明顯影響反應進行,而導致蛋白質產量減少。為了解決此問題,科學家建<br />

立另一種 CECF ( continuous exchange cell-free system ) 系統。CECF 系統將 RM<br />

以透析膜和 feeding mixture ( FM,大致成分和 RM 相同但不含 DNA 模板 ) 隔<br />

開,如此一來造成影響的抑制分子便可透過透析模擴散至 FM 中,且不足的胺<br />

基酸也可由 FM 中獲得補充,使蛋白質的總產量大幅增加。( 如下圖二[2] )<br />

在合成膜蛋白質的無細胞表現系統<br />

中還必須加入界面活性劑,以有效穩定<br />

高疏水性的膜蛋白質;除了界面活性劑<br />

外也可以加入脂質,如圖二下半部所<br />

示。由於無細胞表現系統的便利性,近<br />

年來被認為可應用於膜蛋白質大量表<br />

現。用以測試的膜蛋白質除了本篇使用<br />

的細菌視紫質外,也包括真核生物 G 蛋<br />

白質耦合受器 ( GPCR )。目前已有多種<br />

膜蛋白質成功由無細胞系統大量表現,<br />

也有因此得到蛋白質 X 光繞射結構的例<br />

子。<br />

2<br />

圖二 Versatility of CF expression systems for the production of MPs


作者為何要作本研究<br />

在無細胞表現系統中,由於膜蛋白質本身疏水性較高,一被轉譯出來很容<br />

易聚集沉澱。為了避免此問題,在反應混合物中加入界面活性劑微胞,使蛋白<br />

質合成過程中可以受界面活性劑穩定。近年來,以脂質取代界面活性劑的系統<br />

已被研發;若可讓膜蛋白質在合成過程中進入微脂粒中,只要選擇適當的脂<br />

質,便能讓膜蛋白質處於較接近自然環境的膜系,對於功能性研究也有很大幫<br />

助。Nozawa 等人利用 wheat-germ 無細胞表現系統合成植物 transporter [3],發<br />

現若同時加入微脂粒和界面活性劑 Brij35,可成功得到包埋於微脂粒中且有功<br />

能的蛋白質。本篇作者嘗試改良原有的 E.coli 膜蛋白質無細胞表現系統,希望<br />

在與透析方法結合後也能達到同樣目標,並進一步提高表現產量。<br />

本研究欲完成之項目<br />

本篇作者調整原有的 E.coli 膜蛋白質無細胞表現系統,以細菌視紫質作為<br />

模式蛋白質,透過測試不同種類界面活性劑和磷脂基膽鹼混合微胞,找出最佳<br />

的反應系統條件。此外經由光週期與氫離子幫浦活性測試,確定合成蛋白質具<br />

有正常功能。最後將再次純化後的蛋白質進行養晶,也得到細菌視紫質的微晶<br />

體,顯示其純度足以進行結構解析。<br />

建構表現質體<br />

材料與方法<br />

利用兩步 PCR 反應在細菌視紫質蛋白質基因 ( 由已建構於 pET vector 裡<br />

的基因以 PCR 反應放大 ) 前加上 T7 promoter,N 端 His tag 與 TEV cleavage<br />

site,在其後加上 T7 terminater sequence [4]。最後將 PCR 產物放入 pCR2.1-TOPO<br />

質體中。<br />

無細胞表現<br />

本實驗使用透析模 ( cut-off 為 15 kDa ) 分隔 reaction solution mixture (RM)<br />

和 feed solution mixture(FM)。RM 中包含 10 g/mL plasmid,10 mM Mg(OAc)2,<br />

60 mM HEPES-KOH buffer (pH 7.5),4% PEG8000,200 mM potassium<br />

glutamate,1.9 mM DTT,1.3 mM ATP,0.9 mM GTP,0.9 mM CTP,0.9 mM<br />

UTP,35.8 mg/mL folic acid,0.66 mM cAMP,27.6 mM ammonium acetate,80<br />

mM creatine phosphate,0.25 mM creatine kinase,0.25 mg/mL E.coli total tRNA,<br />

0.3 volume E.coli S30 extract, 3 mg/mL T7 RNA polymerase,1.5% NaN3,0.28<br />

mg/mL tyrosine。其他 19 種胺基酸 ( 除 tyrosine 外 ) 濃度皆為 1.5 mM。<br />

此外外加 6.7 mg/mL egg PC 之 MLV ( multilamellar vesicles ) 或 SUV( small<br />

unilamellar vesicles )和 100 M all-trans retinal (溶於 EtOH )。用以測試的界面活<br />

性劑種類如下:。n-octyl-b-D-glucoside ( OG ),Triton X-100,Brij58,digitonin,<br />

n-dodecyl-b-D-maltoside ( DDM ),sodium cholate,CHAPS,lauryl sarcosine,<br />

sodium deoxycholate,pentadecafluorooctanoic acid,sodium dodecyl sulfate。<br />

3


調整RM與FM的比值為1比10,FM成份與RM大致相同但不含模板DNA、<br />

creatine kinase、tRNA、S30 extract、detergent及lipid。此外FM中再加入60 mM<br />

KOAc, 10 mM Tris-OAc buffer ( pH 8.2 ), 16 mM Mg(OAc)2及8.94 mM DTT。<br />

RM總體積為0.9或4.5 mL,在30℃反應6小時。<br />

檢驗細菌視紫質蛋白質折疊是否完全<br />

將無細胞系統合成後之沉澱物懸浮於 high-salt buffer 中(含 50mM Tris-HCl<br />

與 400 mM NaCl ),加入 1% DDM 後以 20,400g 離心 5 分鐘,上清液進行全光<br />

譜掃描,以 560 nm 吸收值估計正確摺疊的 BR 量。BR 總分子量約 31.4 kDa,<br />

molar extinction coefficient 為 42,000。<br />

Sucrose density gradient sedimentation analysis<br />

將無細胞系統合成後之沉澱物以 PBS 清洗後懸浮於 high salt buffer 中,超<br />

音波震盪共 45 秒,以 5000 rpm 離心 5 分鐘,上清液進行梯度離心。梯度:50%<br />

( 2.5 mL ) 40% ( 2 mL ) 30% ( 2 mL ) 10% ( 2.5 mL ) ( sucrose 濃度: w/w )離心<br />

100,000g 共 12 小時。<br />

脂質定量<br />

利用Fiske-Subbarow method定量。將樣本中的磷脂質以同體積的氯仿與甲<br />

醇萃取出,經離心後取氯仿層並乾燥,即得到乾燥磷脂質。將乾燥磷脂質溶於<br />

100 L純水中,加入250 L 10N H2SO4後於170℃加熱2小時。冷卻後加入100 L<br />

含有5% ammonium molybdate、2.2 mL of H2O與 100 L Fiske-Sabbarow reagent<br />

( 0.125 g 1-amino-2-naphthol-4-sulfonic acid, 0.25 g sodium sulfite, 7.5 g sodium<br />

bisulfite per 50 mL ) 混合後於100℃加熱5分鐘。冷卻後測量750 nm吸光值。<br />

Flash photolysis and photoelectrochemical measurements<br />

使用雷射光為Nd-YAG雷射 ( 波長532 nm,一次打7 ns,約5 mJ/pulse )。<br />

記錄380, 410, 450, 500, 550, 570, 610, 650與680 nm下的吸光值改變。此外將50<br />

L樣本置於SnO2電極上乾燥,測量氫離子幫浦能力。<br />

細菌視紫質純化<br />

將 BR 樣本置於含 50 mM Tris buffer,100 mM NaCl 及 1% DDM 溶液中過<br />

夜。以超高速離心去除沉澱,上清部分以 HisTrap column 純化,之後以 TEV<br />

protease 切除 N 端 tag 並透析過夜。再將樣本通過 HisTrap column 去除 TEV<br />

protease,流出液濃縮後進行 size-exclusion chromatography。<br />

結果與討論<br />

加入 cholate 與 egg PC 所形成的混合微胞最適於大量表現 BR<br />

為了避免新合成蛋白質聚集沉澱,作者在 reaction mixture 中加入界面活性<br />

劑與 eggPC 形成的混合微胞,提供新生蛋白質適當的疏水環境。經由測試不<br />

同種類界面活性劑,發現使用 cholate 和 CHAPS 可獲得較多正確摺疊的蛋白<br />

質。由於 cholate 的 cmc ( critical micelle concentration ) 較高且形成之微胞較<br />

小,有利於後續分析,本研究採用 cholate 與 eggPC 形成的混合微胞。<br />

4


合成出的 BR 蛋白質確實包埋於微胞中<br />

為了確定合成出的 BR 是否有效進入微胞,作者將合成反應後的可溶部分<br />

進行 sucrose density gradient centrifugation,分析不同密度層之脂質濃度與正確<br />

摺疊蛋白質濃度之間的相關性。發現正確摺疊的 BR 和 lipid 幾乎處於同一個<br />

密度層中,顯示 BR 的確包埋於微胞中。<br />

包埋於微胞中的 BR 蛋白質具有正常光週期與氫離子幫浦活性<br />

作者將由嗜鹽菌紫膜 ( purple membrane ) 萃取出的 native BR 置換至 egg<br />

PC liposome 中,和無細胞合成得到的 BR-liposome 進行光週期性質及氫離子<br />

幫浦活性測量。結果顯示無細胞合成的 BR-liposome 和 native BR-liposome 光<br />

週期性質幾乎相同。利用 SnO2 電極也可測量到 BR 在光照下具有運送氫離子<br />

的能力,顯示此無細胞合成系統所得的蛋白質具有正常活性。<br />

經過純化可得到正確摺疊比率大於 80 %的 BR 蛋白質<br />

為了去除未折疊的 BR 並得到更高純度的蛋白質,作者將反應完之 reaction<br />

mixture 以 HisTrap column 純化,再以 TEV protease 切去 N 端 tag 並經 HisTrap<br />

column 去除 protease 後,通過尺寸大小排除層析法純化,蛋白質最終濃度約為<br />

10 mg/mL,測試發現其正確摺疊比率可達 80%至 100%。作者並將此樣本進行<br />

蛋白質結晶,可成功得到 BR 的微結晶 ( microcrystal ),顯示無細胞合成的蛋<br />

白質經由再次純化,可達到解析結構所要求的純度。<br />

參考文獻<br />

1. Schwarz D, Junge F, Durst F, Frolich N, Schneider B, Reckel S, Sobhanifar S,<br />

Dotsch V, Bernhard F (2007)Preparative scale expression of membrane proteins<br />

in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nat<br />

Protoc :2945–2957.<br />

2. Daniel S, Volker D, Frank B (2008)Production of membrane proteins using<br />

cell-free expression systems. Proteomics : 8,3933-3946<br />

3. Nozawa A, Nanamiya H, Miyata T, Linka N, Endo Y, Weber APM, Tozawa Y<br />

(2007) A cell-free translation and proteoliposome reconstitution system for<br />

functional analysis of plant solute transporters. Plant Cell Physiol 48:1815–1820.<br />

4. Yabuki T, Motoda Y, Hanada K, Nunokawa E, Saito M, Seki E, Inoue M, Kigawa<br />

T, Yokoyama S (2007) A robust two-step PCR method of template DNA<br />

production for high-throughput cell-free protein synthesis. J Struct Funct<br />

Genomics 8:173–191.<br />

5. Mingyue He (2008) Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and<br />

biotechnology. New Biotechnology 25 No.2/3: 126-130<br />

5

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