陳佳文 - 黃慶璨研究室

生化科技學系微生物學組專題討論
題目:Proteomic Analysis of Extracellular Proteins from Aspergillus oryzae Grown
under Submerged and Solid-Sate Culture Conditions
作者:Ken Oda, Dararat Kakizono, Osamu Yamada, Haruyuki Iefuji, Osamu Akita,
and Kazuhiro Iwshita
文章來源:Applied and Environmental Microbiology 72(5): 3448-3457, 2006.
演講人:Chia-wen Chen 陳佳文 B93605003
指導老師:Huang, Ching-Tsan 黃慶璨 博士
演講日期:October 30th, 2007
演講地點:The 6th classroom
摘要
絲狀真菌是一種同源蛋白質及異源蛋白質常用的表現系統。其中,Aspergillus
oryzae 因為可以用固態發酵的方法表現異源蛋白質而備受重視。本研究比較細
胞外蛋白質在固態發酵及液態發酵的差異,也就是以蛋白質體學的方法,探討
A. oryzae 在固態培養時,外泌蛋白質的情況。將 A. oryzae 分別以固態及液態,
培養 40 小時,於 0、12、24、32 及 40 小時個別取樣,進行二維電泳分析。於
40 時所取的樣品,利用介質輔助雷射脫附游離飛行時間式質譜儀(MALDI-TOF
MS),使用(Peptide Mass Fingerprinting)此法和現有資料庫互相比對判定胞外
蛋白質及液態培養中與細胞壁結合的蛋白質種類。固態培養部分研究二維電泳
上 85 個點,液態培養部分研究 110 個點,一共辨別出 29 個蛋白質的身分,
可分為 4 大類。第一類為只在固態培養產生的胞外蛋白質,如 glucoamylase B
及 alanyl dipeptidyl peptidase。第二類為只在液態培養產生之胞外蛋白質,如
glucoamylase A (GlaA)及 xylanase G2 (XynG2),第三類蛋白質在兩種培養基中
皆會產生,例如 xylanase G1。第四類蛋白質在固態培養時可外泌至培養基中,
液態培養時卻會被細胞壁隔絕而無法外泌。如 α-amylase (TAA)、β-glucosidse
(BgI)。利用北方雜合分析(Northern analysis)以上 7 個基因,可發現 GlaA、
XynG2 在固態培養情形,於轉錄後才調控其表現,而 TAA、BgI 則藉由細胞壁
隔絕,在液態培養下調控。
前言
♦ 本研究之重要性
Aspergillus oryzae,是一種食品工業上常用之真菌。數千年以來,人們利
用它製作清酒、味噌、燒酎,因此美國 FDA 視為 GRAS(generally regarded
as safe)。A. oryzae 可將大量且多種的酵素分泌至環境中,自身蛋白質及重
組蛋白質皆能商業量產。由於上述兩種特性,A. oryzae 和 A. niger、A. sojae
皆被認為是同源(1)及異源蛋白質(2)表達之良好宿主。固態培養是較

接近真菌自然生長狀況的培養方式,酵素的分泌也較接近自然形式, A.
oryzae 在固態培養中蛋白質的分泌情形,可作為許多絲狀真菌的模型。同
時,觀察發現絲狀真菌在固態培養時,酵素分泌量通常大於液態培養(3)。
由於固態發酵較接近自然狀態,產量也較高,因此成為許多分子生物學家
之研究主題。
♦ 前人作過的研究
前人發現兩個只在固態發酵時表現的基因,glaB 及 pepA。glaB 啟動子的
cis element 於固態培養時可被誘導(4)。此啟動子有兩個 heat shock element
motif 及一個 GC-rich motif(GC box)。此 GC box 可能對 glaB gene 的調控
有所影響。pepA 可表現出酸性蛋白酶,啟動子區域無 GC box,但有 heat
shock element,會受溫度影響表現,受固態培養誘導基因表現的機制可能
非常複雜。subtractive hybridization 可知液態和固態發酵基因表現的差異性
(5)。固態發酵時,醣解作用及檸檬酸循環相關酵素產量降低,代謝產物的
抑制減少,水解酵素的產量因而增加。
♦ 作者為何要作本研究
前人對絲狀真菌於液態培養分泌之蛋白質已有詳盡研究,但對於固態培養
之蛋白質外泌仍未深入探討。由於蛋白質體學的進展,轉錄分析,A. oryzae
之 expressed sequence tags (ESTs)及基因圖譜的解碼,使我們能分析 A.
oryzae 固態培養下的胞外蛋白質。
♦ 本研究欲完成之項目
比較固態培養及液態培養時,胞外蛋白質之差異,並了解蛋白質分泌之情
形。
材料與方法
♦ 菌種及培養基
A. oryzae strain RIB40(培養、抽取蛋白質及分離 total RNA)
Wheat bran with 100% water content (solid-state medium)
1.0*10 8 conidia/g wheat bran (50 g solid-state medium)
♦ 蛋白質之萃取
蛋白質以 Bradford method 定量。固態培養產物以緩衝液及蛋白酶抑制劑
萃取,離心後取上清液過濾,再經硫酸銨過夜、去鹽化,而可以二維電泳
分析。液態培養之產物離心後過濾,再以硫酸銨過夜、去鹽化以二維電泳
分析。液態培養時位於細胞壁之蛋白質則加入緩衝液均質化,離心並去鹽
後,以二維電泳處理。
♦ 二維電泳分析
使用 IPG pH 4-7,先進行等電點分析,再以 coomassie brilliant blue 染色。
HPLC 使用的管柱為 Phenyl 5-PW column。
♦ MALDI-TOF mass spectrometry

利用上述二維電泳產物,以 in-gel deglycosylation 方法處理,也就是先加
入 glycopeptidase F 去醣基,再加入 trypsin 水解,得到產物再進行分析,
偵測 800-3500 Da 之 peptide,利用 NCBI 資料庫進行蛋白質身份判定。
♦ RNA 萃取及北方分析
用 Isogen 萃取 RNA,再利用前人(5)之方法萃取固態發酵之 RNA,用甲醇
洋菜膠片電泳,再用 PCR digoxigenin probe synthesis kit,detection starter kit
II 進行北方雜合分析。
結果與討論
♦ 液態培養及固態培養時胞外蛋白質之差異
利用培養 32 時及 40 小時之樣品,進行每單位乾重產量之比較。結果顯示
第 32 及 40 小時固態培養產量為 53.7±1.36、77.3±2.6 mg protein/g dry
mycelium,液態培養時分別為 13.2 ± 2.60 及 11.9 ± 0.89 mg protein/g dry
mycelium。菌絲在固態培養基中濃度在第 32 及 40 小時為 75.4 ± 2.78 與 70.9
± 4.19 mg/g,液態培養基中為 6.26 ± 0.67 and 6.57 ± 0.51 mg/ml(圖一),
固態培養蛋白質產量約為液態培養基的 4.0-6.4 倍。固態發酵之胞外蛋白質
等電點皆在 4-7,大部分位於 4.5-5.5 之間,因此利用 pH 4-7 IPG strips 進
行二維電泳。二維電泳圖案與培養條件及時間有關。有些二維電泳上的點
會因醣基化而有些許擴散,有些α-amylase 的點在固態發酵中會隨著時間
而增加,在液態發酵中則無法觀察出此一現象。圖二顯示出兩種培養方
式,蛋白質不同的分泌方式。
♦ 辨認培養 40 小時後,液態發酵與固態發酵之胞外蛋白質身份
大部分絲狀真菌所產生的蛋白質皆有醣基化的現象。N-linked 寡醣因分子
量太大難以觀察,但因去醣基會導致蛋白質在二維電泳無法溶解,所以改
用 in-gel deglycosylation。因為培養 40 時以後可偵測的較多蛋白質,所以
利用這一片二維電泳圖進行分析。觀察兩種發酵下,電泳圖上可被質譜儀
重覆偵測到的點,固態發酵有 85 點,液態發酵中有 110 點(圖三)。其中有
8 種蛋白質兩種培養基皆可偵測到,有 11 種蛋白質只在固態發酵中偵測
到,另有 11 種蛋白質只在液態發酵中觀察到。只可在固態發酵中觀察到
glucoamylase B (為固態發酵時獨有之 expression marker),formamidase,
alanyl dipeptidyl peptidase (圖三);至於液態發酵部分,則可觀察到α
-glucosidase 及β-galactosidase 這些獨有的蛋白質。為了明白固態發酵中大
量產生α-amylase 之影響,作者利用疏水性管柱,HPLC 的方法分離胞外
蛋白質,再利用 SDS-PAGE,得到 110 個條帶,再利用質譜儀分析(圖四)。
♦ 受細胞壁隔絕之蛋白質
有些蛋白質在兩種培養條件時皆會分泌,但在液態培養下會被細胞壁隔絕
而無法分泌出來。由二維電泳及質譜儀找出這些蛋白質的身分,可推知α
-glucosidase 及β-galactosidase 皆屬於此類蛋白質(圖三)

♦ 由 A. oryzae 產生胞外蛋白質之分類
已知固態培養及液態培養條件下,胞外蛋白質產生之差異。加上細胞壁上
蛋白質的分析,可將蛋白質分成四大類(圖五):在固態培養下表現、在液
態培養下表現、在兩種培養條件皆表現、在兩種培養條件下皆表現但在液
態培養中無法外泌。
♦ 分析兩種培養條件下上述四群蛋白質之基因表現
利用北方分析,研究 glaB、dppV、glaA、xynG2、TAA、bgI、xynG1 的表
現,而 glaB、dppV 只於固態培養下表現,glaA、xynG2 在兩種培養條件下
皆表現但產量不同,TAA、bgI、xynG 在兩種培養條件下也會表現,但後
面兩種酵素無法外泌於液態培養基中。
參考文獻
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solid-state culture and liquid (submerged) culture. Curr. Genet. 41:275-281.

圖表
圖一. 比較外泌蛋白質量,以 100 毫升培養液及 10 克 wheat bran 分析。
圖二. 0-40 時培養,蛋白質表現之差異,以 CBB 染色,比較液態及固態培養。
圖三. 依 MALDI-TOF MS 分析二維電泳上亮點,得到可辨認身分之蛋白質,
液態及固態發酵之差異。上至下分別為固態發酵、液態發酵、在液態發
酵時被細胞壁隔絕之蛋白質。

圖四. 用 A280nm 疏水性管柱、α-amylase 活性進行固態培養時蛋白質之分析。
右圖為可用 MALDI-TOF MS 分析的蛋白質,二維電泳上的位置。
圖五. 將蛋白質依外泌的特性分成四大類
圖六. 北方雜合分析固態及液態培養中 total RNA 之表現,B 圖為利用 EtBr 染
色定量。