陳佳文 - 黃慶璨研究室

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接近真菌自然生長狀況的培養方式,酵素的分泌也較接近自然形式, A. oryzae 在固態培養中蛋白質的分泌情形,可作為許多絲狀真菌的模型。同時,觀察發現絲狀真菌在固態培養時,酵素分泌量通常大於液態培養(3)。由於固態發酵較接近自然狀態,產量也較高,因此成為許多分子生物學家之研究主題。 ♦ 前人作過的研究前人發現兩個只在固態發酵時表現的基因,glaB 及 pepA。glaB 啟動子的 cis element 於固態培養時可被誘導(4)。此啟動子有兩個 heat shock element motif 及一個 GC-rich motif(GC box)。此 GC box 可能對 glaB gene 的調控有所影響。pepA 可表現出酸性蛋白酶,啟動子區域無 GC box,但有 heat shock element,會受溫度影響表現,受固態培養誘導基因表現的機制可能非常複雜。subtractive hybridization 可知液態和固態發酵基因表現的差異性 (5)。固態發酵時,醣解作用及檸檬酸循環相關酵素產量降低,代謝產物的抑制減少,水解酵素的產量因而增加。 ♦ 作者為何要作本研究前人對絲狀真菌於液態培養分泌之蛋白質已有詳盡研究,但對於固態培養之蛋白質外泌仍未深入探討。由於蛋白質體學的進展,轉錄分析,A. oryzae 之 expressed sequence tags (ESTs)及基因圖譜的解碼,使我們能分析 A. oryzae 固態培養下的胞外蛋白質。 ♦ 本研究欲完成之項目比較固態培養及液態培養時,胞外蛋白質之差異,並了解蛋白質分泌之情形。材料與方法 ♦ 菌種及培養基 A. oryzae strain RIB40(培養、抽取蛋白質及分離 total RNA) Wheat bran with 100% water content (solid-state medium) 1.0*10 8 conidia/g wheat bran (50 g solid-state medium) ♦ 蛋白質之萃取蛋白質以 Bradford method 定量。固態培養產物以緩衝液及蛋白酶抑制劑萃取,離心後取上清液過濾,再經硫酸銨過夜、去鹽化,而可以二維電泳分析。液態培養之產物離心後過濾,再以硫酸銨過夜、去鹽化以二維電泳分析。液態培養時位於細胞壁之蛋白質則加入緩衝液均質化,離心並去鹽後,以二維電泳處理。 ♦ 二維電泳分析使用 IPG pH 4-7,先進行等電點分析,再以 coomassie brilliant blue 染色。 HPLC 使用的管柱為 Phenyl 5-PW column。 ♦ MALDI-TOF mass spectrometry
利用上述二維電泳產物,以 in-gel deglycosylation 方法處理,也就是先加入 glycopeptidase F 去醣基,再加入 trypsin 水解,得到產物再進行分析, 偵測 800-3500 Da 之 peptide,利用 NCBI 資料庫進行蛋白質身份判定。 ♦ RNA 萃取及北方分析用 Isogen 萃取 RNA,再利用前人(5)之方法萃取固態發酵之 RNA,用甲醇洋菜膠片電泳,再用 PCR digoxigenin probe synthesis kit,detection starter kit II 進行北方雜合分析。結果與討論 ♦ 液態培養及固態培養時胞外蛋白質之差異利用培養 32 時及 40 小時之樣品,進行每單位乾重產量之比較。結果顯示第 32 及 40 小時固態培養產量為 53.7±1.36、77.3±2.6 mg protein/g dry mycelium,液態培養時分別為 13.2 ± 2.60 及 11.9 ± 0.89 mg protein/g dry mycelium。菌絲在固態培養基中濃度在第 32 及 40 小時為 75.4 ± 2.78 與 70.9 ± 4.19 mg/g,液態培養基中為 6.26 ± 0.67 and 6.57 ± 0.51 mg/ml(圖一), 固態培養蛋白質產量約為液態培養基的 4.0-6.4 倍。固態發酵之胞外蛋白質等電點皆在 4-7,大部分位於 4.5-5.5 之間,因此利用 pH 4-7 IPG strips 進行二維電泳。二維電泳圖案與培養條件及時間有關。有些二維電泳上的點會因醣基化而有些許擴散,有些α-amylase 的點在固態發酵中會隨著時間而增加,在液態發酵中則無法觀察出此一現象。圖二顯示出兩種培養方式,蛋白質不同的分泌方式。 ♦ 辨認培養 40 小時後,液態發酵與固態發酵之胞外蛋白質身份大部分絲狀真菌所產生的蛋白質皆有醣基化的現象。N-linked 寡醣因分子量太大難以觀察,但因去醣基會導致蛋白質在二維電泳無法溶解,所以改用 in-gel deglycosylation。因為培養 40 時以後可偵測的較多蛋白質,所以利用這一片二維電泳圖進行分析。觀察兩種發酵下,電泳圖上可被質譜儀重覆偵測到的點,固態發酵有 85 點,液態發酵中有 110 點(圖三)。其中有 8 種蛋白質兩種培養基皆可偵測到,有 11 種蛋白質只在固態發酵中偵測到,另有 11 種蛋白質只在液態發酵中觀察到。只可在固態發酵中觀察到 glucoamylase B (為固態發酵時獨有之 expression marker),formamidase, alanyl dipeptidyl peptidase (圖三);至於液態發酵部分,則可觀察到α -glucosidase 及β-galactosidase 這些獨有的蛋白質。為了明白固態發酵中大量產生α-amylase 之影響,作者利用疏水性管柱,HPLC 的方法分離胞外蛋白質,再利用 SDS-PAGE,得到 110 個條帶,再利用質譜儀分析(圖四)。 ♦ 受細胞壁隔絕之蛋白質有些蛋白質在兩種培養條件時皆會分泌,但在液態培養下會被細胞壁隔絕而無法分泌出來。由二維電泳及質譜儀找出這些蛋白質的身分,可推知α -glucosidase 及β-galactosidase 皆屬於此類蛋白質(圖三)
Page 1: 生化科技學系微生物學組
Page 5 and 6: 圖表圖一. 比較外泌蛋白

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