陳佳文 - 黃慶璨研究室

利用上述二維電泳產物,以 in-gel deglycosylation 方法處理,也就是先加
入 glycopeptidase F 去醣基,再加入 trypsin 水解,得到產物再進行分析,
偵測 800-3500 Da 之 peptide,利用 NCBI 資料庫進行蛋白質身份判定。
♦ RNA 萃取及北方分析
用 Isogen 萃取 RNA,再利用前人(5)之方法萃取固態發酵之 RNA,用甲醇
洋菜膠片電泳,再用 PCR digoxigenin probe synthesis kit,detection starter kit
II 進行北方雜合分析。
結果與討論
♦ 液態培養及固態培養時胞外蛋白質之差異
利用培養 32 時及 40 小時之樣品,進行每單位乾重產量之比較。結果顯示
第 32 及 40 小時固態培養產量為 53.7±1.36、77.3±2.6 mg protein/g dry
mycelium,液態培養時分別為 13.2 ± 2.60 及 11.9 ± 0.89 mg protein/g dry
mycelium。菌絲在固態培養基中濃度在第 32 及 40 小時為 75.4 ± 2.78 與 70.9
± 4.19 mg/g,液態培養基中為 6.26 ± 0.67 and 6.57 ± 0.51 mg/ml(圖一),
固態培養蛋白質產量約為液態培養基的 4.0-6.4 倍。固態發酵之胞外蛋白質
等電點皆在 4-7,大部分位於 4.5-5.5 之間,因此利用 pH 4-7 IPG strips 進
行二維電泳。二維電泳圖案與培養條件及時間有關。有些二維電泳上的點
會因醣基化而有些許擴散,有些α-amylase 的點在固態發酵中會隨著時間
而增加,在液態發酵中則無法觀察出此一現象。圖二顯示出兩種培養方
式,蛋白質不同的分泌方式。
♦ 辨認培養 40 小時後,液態發酵與固態發酵之胞外蛋白質身份
大部分絲狀真菌所產生的蛋白質皆有醣基化的現象。N-linked 寡醣因分子
量太大難以觀察,但因去醣基會導致蛋白質在二維電泳無法溶解,所以改
用 in-gel deglycosylation。因為培養 40 時以後可偵測的較多蛋白質,所以
利用這一片二維電泳圖進行分析。觀察兩種發酵下,電泳圖上可被質譜儀
重覆偵測到的點,固態發酵有 85 點,液態發酵中有 110 點(圖三)。其中有
8 種蛋白質兩種培養基皆可偵測到,有 11 種蛋白質只在固態發酵中偵測
到,另有 11 種蛋白質只在液態發酵中觀察到。只可在固態發酵中觀察到
glucoamylase B (為固態發酵時獨有之 expression marker),formamidase,
alanyl dipeptidyl peptidase (圖三);至於液態發酵部分,則可觀察到α
-glucosidase 及β-galactosidase 這些獨有的蛋白質。為了明白固態發酵中大
量產生α-amylase 之影響,作者利用疏水性管柱,HPLC 的方法分離胞外
蛋白質,再利用 SDS-PAGE,得到 110 個條帶,再利用質譜儀分析(圖四)。
♦ 受細胞壁隔絕之蛋白質
有些蛋白質在兩種培養條件時皆會分泌,但在液態培養下會被細胞壁隔絕
而無法分泌出來。由二維電泳及質譜儀找出這些蛋白質的身分,可推知α
-glucosidase 及β-galactosidase 皆屬於此類蛋白質(圖三)