陳建炘 - 國立臺灣大學

國立臺灣大學微生物與生化學研究所微生物學組專題討論
題目:Repulsion of superinfecting virions: a mechanism for rapid virus spread
作者:Virginie Doceul, Michael Hollinshead, Lonneke van der Linden, Geoffrey L. Smith
文章來源:Science 327: 873-6, 2010
演講人: Chien-Sin Chen 陳建炘 R98B47402
指導老師:Li-Kwan Chang Ph.D. 張麗冠 博士
演講日期:Mar. 29 th 2010
演講地點:The 6 th classroom
摘要
病毒引發的疾病毒性與其傳播能力息息相關,而目前對病毒傳播的分子機制知之尚淺。
「複製」往往是病毒從感染到傳播中最耗時的步驟,一般認為這也限制了傳播速率。Vaccinia
virus 由感染到複製約需 6 小時,而本研究卻在測定溶菌斑時發現該病毒大約 75 分鐘就能穿
越一個細胞。利用刪除突變的病毒株做溶菌斑測定,發現 vaccinia virus 中會誘導宿主 actin tails
產生的基因對病毒快速傳播的性質很重要,且 actin tails 被誘導產生的時間早於病毒複製。又
以重組病毒及刪除突變株證明 vaccinia virus 膜蛋白質 A33R、A36R 必須在感染「初期」表現
才能維持溶菌斑正常的大小。若僅將 A33R、A36R 同時表現,就足以讓 HeLa 細胞在有病毒
顆粒刺激時產生 actin tails。另外,利用活細胞顯微攝影,也觀察到 actin tails 連續推擠 vaccinia
virus 病毒顆粒的動態。因此推論 A33R、A36R 為病毒在已感染細胞上的標記,一旦與胞外病
毒顆粒接觸,此複合體便誘發 actin 聚合形成 actin tails 並推擠病毒顆粒,使得病毒越過此已
感染細胞,該機制應為 vaccinia virus 傳播速率得以超越複製速率的原因。
keywords: vaccinia virus, actin tails, dissemination
前言
病毒的生理特性及傳播能力會決定病毒對宿主的危害程度。截至目前為止的科學研究對
各種病毒的生理特性雖然有一定的了解,但是對病毒傳播分子機制的了解卻相對貧乏許多。
近年來科學家發現 vaccinia virus 的病毒顆粒釋放需要 Abl-family kinase 參與,以 Gleevec
(Abl-family kinase inhibitor, 本為治療 myelogenous leukemia 的上市藥品)處理後可抑制病毒擴
散,使得實驗老鼠免於死亡[1]。因此,了解病毒快速傳播機制,將有助於開發新的藥物標的,
無論在預防感染或是感染後的擴散控制都有極大的助益。
十五年前 vaccinia virus 被報導能誘導宿主 actin 聚合,在細胞表面造成突起的 actin tails,
進而促進病毒顆粒傳播[2]。Vaccinia virus 陸續被發現有蛋白質與 actin tails 生成有關,其中
A33R 蛋白質刪除突變株感染細胞後,會導致溶菌斑面積縮小[3]。而 A36R 突變,病毒就不
再能誘導宿主的 actin 聚合與 actin tails 的形成[4]。十年前發現 A33R 能將 A36R 導引至正確
位置,如此,A36R 的 tyrosine 就能被磷酸化,可能作為 actin 聚合的訊號[5]。近年這項假設
也被證實,研究發現磷酸化的 A36R 會活化細胞中參與 actin 聚合的蛋白質 Arp2/3[6]。另外、
在會感染細胞的細菌中,有些菌體受已感染細胞表面突起骨架推擠,類似的例子,幾十年來
不斷地被報導[7]。暗示細胞骨架似乎對胞內病原體的傳播能力扮演重要角色。

利用螢光蛋白質與活細胞顯微攝影,能達成「細胞培養」且「即時」、「長時間」、「非侵
入式」偵測,能觀測病毒在活細胞傳播的動力學。本研究即以活細胞顯微攝影,觀測 vaccinia
virus 在宿主細胞間的傳播速率,並以螢光標定 actin 及病毒顆粒,推論病毒快速傳遞的機制。
材料與方法
病毒株
vaccinia virus 的 western reserve (WR) strain 為野生型病毒株。製作 vΔA33R、vΔA36R、vΔB5R、
vΔA34R、vΔA56R、vΔF12L、vΔF13L 突變株;再將 GFP 接在晚期基因 A5L 前製成 vEGFPA5L(形
成綠色病毒顆粒與 viral factories)、vΔA36R-EGFPA5L 及 vΔA33R-EGFPA5L。又將 A33R、
A36R、B5R,接到晚期啟動子 4b,製成 v4b-A33、v4b-A36、v4b-B5,v4b-A33-EGFPA5L 及
v4b-A36-EGFPA5L 等重組病毒。本篇使用的 HSV-1 為表現 GFP-VP-22 的重組病毒。
質體
CherryFP-actin 表現質體可表現 cherryFP-actin 的融合蛋白。將 A33R、A36R 分別接入質體
pdlNot’MCS’R’PK,形成可表現 A33R-v5 與 A36R-v5 融合蛋白質 lentiviral 載體。
細胞株
BSC -1 細胞為非洲綠猴腎臟上皮細胞,作為本篇研究中 vaccinia virus 的宿主細胞株。HeLa
細胞為人類子宮頸癌上皮細胞所建立的細胞株,在本篇用來表現病毒重組蛋白質。
病毒顆粒的製備與感染
收取受病毒感染細胞的培養液,以 1000 g 在 4℃下離心十分鐘後可得病毒顆粒。將上清與未
感染細胞(液態培養)於 4℃混合三十分鐘,再將 37℃ medium 加入,並轉至 37℃培養三十分
鐘,便可進行染色。或以病毒液感染後,將固態培養的細胞以半固態培養基(1.5%
carboxymethylcellulose, CMC)覆蓋,培養後可進行染色或溶菌斑觀測。
免疫螢光染色
細胞以 phosphate-buffered saline(PBS)清洗,再以 4%PFA 固定。完成固定的細胞以 TritonX-100
處理以增加細胞膜通透性。再以 0.5% bovine serum albumin 處理一小時後,加入特定一級抗
體、二級抗體。最後以 PBS 清洗,然後封片,於螢光顯微鏡下觀察。
活細胞攝影
將受感染的細胞覆蓋上 1.5% CMC 培養基後,置於顯微鏡下的恆溫培養箱培養並攝影記錄。
西方點墨法
將細胞打破後以離心收集上清液,再用蛋白質變性膠體電泳分離,將蛋白質由膠體轉印至尼
龍膜後,再分別以一級抗體及二級抗體偵測欲觀察之蛋白質。
結果與討論
Vaccinia virus 的傳播速率高於預期
以病毒顆粒感染 BSC-1 細胞後,培養三天並觀察溶菌斑。作者發現溶菌斑直徑約 2.90 mm,
而經過測量,該次實驗的細胞核間距離約 37.26 μm。如此,病毒傳播速度約為 32.36 μm/hr,
即每 1.2 小時病毒就能跨越一個細胞。此結果與先前文獻中的描述,病毒感染後 5 至 6 小時
始產生病毒顆粒的速度快上四倍。故作者推測存在一個機制可使病毒傳播加速。
Actin tails 的生成可能與 vaccinia virus 的傳播有關
Vaccinia virus 蛋白質 A33R、A34R、A36R、B5R、F12L 與 F13L,都與宿主 actin tails 生成有

關[8]。將這些蛋白質突變後的重組病毒分別感染 BSC-1 細胞,發現溶菌斑縮小,換言之病毒
傳播速率變慢。而與 actin tail 生成無關的 A56R 若發生突變,溶菌斑大小則無顯著差異。
細胞表面 actin tails 形成早於病毒 DNA 複製,並推擠病毒顆粒以加速傳播
Vaccinia virus DNA 複製和病毒顆粒組裝時,相關蛋白質(包括 A5L)會聚集形成 viral factories
構造。Phalloidin 或 CherryFP-actin 標定 actin,在 vEGFPA5L 重組病毒感染 BSC-1 下,用螢光
顯微鏡觀察,發現宿主內即使沒有 viral factories,仍有 virion-tipped actin tails。該宿主在 actin
tails 形成後才出現 viral factories。證明 actin tails 上的病毒顆粒並非由該細胞重新合成。同時
以螢光顯微攝影觀察到病毒顆粒被 actin tails 推擠,一旦病毒顆粒重新接觸,actin tails 就會重
新合成,並再次推擠病毒顆粒,推測病毒可能藉由此機制加速傳播。
表現於感染初期的 A33R、A36R 對 vaccinia virus 的傳播扮演重要角色
若 actin tails 會將病毒顆粒推擠向四周以加速傳播,則很有可能引發該機制相關蛋白質表現於
感染初期,也就是溶菌斑的外緣。利用免疫螢光染色,發現 A33R,A36R 布滿溶菌斑外緣,
而 A34R 則與晚期基因 A5L 分布位置相同。另外,以 vΔA33R、vΔA36R(刪除突變株)或
v4b-A33、v4b-A36R(晚期表現株)感染 BSC-1 細胞,都會使溶菌斑縮小。由此推論,A33R、
A36R 的早期表現對 vaccinia virus 的傳播扮演重要角色。
A33R、A36R 的同時表現為促使宿主形成 actin tails 的充要條件
先將 A33R、A36R 以 lentiviral 載體表現於 HeLa 細胞,再加入病毒顆粒,使用 phalloidin 和
B5 抗體染色後以螢光顯微鏡觀察。結果發現在 A33R、A36R 都表現時,病毒顆粒能誘導 actin
tails 產生。若單獨表現其中一種,或以其他種類病毒顆粒處理,則幾乎不產生 actin tails。由
此推論 A33R、A36R,為宿主 actin tails 產生的關鍵,也是 vaccinia virus 快速傳播機制的核心。
參考文獻
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