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生化科技研究所微生物與細胞專題討論<br />
題目:Analysis and regulation of amoeboid-like cell motility using synthetic<br />
Ca 2+ -sensitive proteins<br />
作者:Evan Mills, Kevin Truong<br />
文章來源:Cell Calcium 53(3): 231–240, 2013.<br />
演講人:Yi-An Han <strong>韓怡安</strong> R01B22044<br />
指導老師:Chii-Shen Yang, PhD 楊啓伸 博士<br />
演講日期:April 15, 2013<br />
演講地點:The 6th Classroom<br />
摘要<br />
最近的研究報告已經證實利用經過基因工程改造的蛋白質 (engineered<br />
proteins) 能夠控制細胞的移動特性 (cell motility),這項重要的技術有可能運用在<br />
特定的細胞中當作疾病的治療劑。RhoA 是一種控制細胞骨架張力的蛋白質,作<br />
者過去已經提出經過基因改造的 RhoA ,可以用來調控 blebbing cell (圖一)的細<br />
胞形態。在本篇研究當中,作者進一步證實基因改造後的 RhoA 能夠調控細胞<br />
的移動特性。首先,在分析 blebbing cell 和正常細胞 (wild type morphology) 的<br />
移動特性後,發現 blebbing cell 和正常細胞相比,有較快移動速度 (speed) 和<br />
行走軌跡呈現較低直線性 (linearity) 之現象;接著,進一步發現,在用特定波長<br />
之光線活化細胞內改造後的 RhoA 後,可以改變細胞的外觀形態,並進一步改<br />
變其移動速度和直線性;最後,利用先前基因改造可被鈣離子活化的 CaRQ 和<br />
所植入在細胞膜上,能夠感應外界環境刺激而釋放鈣離子的離子通道蛋白質,可<br />
以共同來調控細胞的移動特性和外形。這項研究證實,藉由控制 RhoA 之活性,<br />
能夠指定細胞的移動特性,也指出細胞形態變化和移動特性之間是有相關的。<br />
Keywords:Cell motility, Ca 2+ networks, RhoA, Blebbing<br />
本研究之重要性<br />
前言<br />
利用哺乳動物細胞作為疾病的治療平台是未來的發展趨勢,這項技術的發展,<br />
必須要在細胞上建立良好的控制系統,指揮細胞進行有效的生理功能(例如:定<br />
向的移動、蛋白質分泌)以執行複雜的任務(例如:尋找和摧毀腫瘤細胞)。細胞<br />
的移動是其中一種基本且具有運用潛力的發展特點,目前已有研究發展出,經過<br />
基因改造的 RhoA 蛋白質 [1],可以用來調控細胞的移動性和細胞骨架 [2][3]。<br />
1
先前作過的研究<br />
作者在過去已經提出兩種經過基因改造的 RhoA (CaM-RhoA, CaRQ) (圖二、<br />
表一),搭配細胞膜上可以感應不同外界環境刺激(包括 blue light, acetylcholine,<br />
VEGF-A)的蛋白質 [4],共同調控細胞形態。這種 RhoA 和其下游的 kinase<br />
(Rho-associated protein kinase;ROCK) 主要負責轉換細胞形態 (wild type<br />
morphology or blebbing morphology)。<br />
作者為何要作本研究<br />
作者想要證實基因改造的 RhoA 可以用來控制細胞的移動特性,使得以<br />
programming cells 當作治療應用的技術更進一步發展。<br />
本研究欲完成之項目<br />
本篇研究以能夠感應 Ca 2+ 訊號的 CaM-RhoA 和 CaRQ 這兩種基因改造<br />
的 RhoA 來調控細胞的移動特性。細胞感應外界刺激之後,引發 Ca 2+ 產生,<br />
Ca 2+ 和 RhoA 結合後,細胞形態產生變化,並改變細胞移動特性。作者分別針<br />
對移動速度和行走軌跡直線性進行分析,指出細胞形態和移動特性之間的相關<br />
性。<br />
細胞株<br />
HEK293 cells 以及 Jurkat cells。<br />
材料與方法<br />
單一細胞遷移實驗 (Single-cell migration assay)<br />
細胞經過轉移感染之後以胰蛋白酶處理,接著以 1:10 比例稀釋,重新接種<br />
在含有 DMEM+1% FBS 的 Mattek glass-bottom dishes 上,經過四小時之後再進<br />
行影像紀錄,每五秒鐘拍一張照片,實驗結束之後,再將實驗過程中所拍攝的照<br />
片去除背景之後再進行分析,利用 ImageJ 計算細胞的核心移動距離和速度。<br />
1. 速度 (Speed)<br />
特定時間內所移動的距離。<br />
2. 直線性 (Linearity)<br />
一段直線距離除以總移動距離 (圖三),直線性範圍分布在 1 (代表細胞呈直<br />
線移動)到 0 (代表細胞經過移動之後仍然停在起始點)之間。<br />
群體細胞遷移實驗 (Transwell assay)<br />
加入 100 uL 含有細胞的 DMEM+1% FBS 到 insert 當中,相同體積的細胞<br />
懸浮液加入 well 內當作正控制組 (well 內不含有 insert)。接著在 well 底部加入<br />
650 uL DMEM+1% FBS 以及實驗組所需的抑制劑或是化學誘導劑,實驗照光組<br />
2
部分,將 24 孔盤放在黑暗的培養箱內,24 孔盤底部以 iPod 3G 照射藍光 (445 nm;<br />
電源輸出功率 1mW/cm 2 ) (圖四)。經過 24 小時之後,拿起 well 中的 insert 並<br />
去除頂部多餘的細胞,再將 insert 泡在 PBS 中並以胰蛋白酶作用半小時,使細<br />
胞從 insert 底部分離,再計算遷移指數 (migration index)。<br />
1. 遷移指數 (migration index)<br />
泳動到 well 底部的細胞數除以正控制組 well 內的總細胞數。遷移指數範<br />
圍分布在 1 (代表所有的細胞都泳動到 well 底部)到 0 (代表沒有細胞泳動到<br />
well 底部)之間<br />
結果與討論<br />
Blebbing cells 和 wild type cells 相比,有較低的移動直線性和較高的移動速<br />
度。<br />
此實驗利用表達不同蛋白質的四種 HEK 293 細胞進行比較,如下表:<br />
基因型 YFP CaM-RhoA(DP) CaRQ RhoA(DP)<br />
細胞形態 wild type blebbing wild type blebbing<br />
經過兩個小時的單一細胞遷移實驗,影像紀錄經過分析,blebbing cells (表現<br />
CaM-RhoA 或 RhoA)比 wild type cells (表現 YFP 或 CaRQ)有更高的移動速度,<br />
但是從移動軌道記錄分析卻顯示,blebbing cells 的移動直線性較低。<br />
CaM-RhoA(DP) 融合蛋白在 Ca 2+ 誘導下,會改變細胞的移動特性。<br />
1. 表現 CaM-RhoA(DP) 的細胞在 ionomycin (與鈣離子有極高的親和力,<br />
在細胞膜上可形成鈣離子通道)與 Ca 2+ 同時存在的條件之下,細胞形態<br />
從 blebbing 轉成 not blebbing,且細胞移動直線性上升,移動速度下降。<br />
由此結果觀察出,細胞形態和細胞移動特性之間的轉變是同時發生的。<br />
2. 表現 CaM-RhoA(DP) 的細胞在只有 ionomycin 的誘導條件下,細胞形<br />
態沒有改變,顯示 Ca 2+ 是調控 CaM-RhoA(DP) 的主要因素。<br />
3. Ca 2+ 的傳遞也可以透過其他膜蛋白質的作用,例如:LOVS1K/Orai1,<br />
當細胞同時表現 CaM-RhoA(DP) 和 LOVS1K/Orai1,在藍光 (445nm)<br />
照射之下,LOVS1K 活化而和 Orai1 膜蛋白鈣離子通道結合,引起<br />
Ca 2+ 進入細胞內和 CaM-RhoA(DP) 作用,造成細胞形態和移動特性改<br />
變。<br />
4. LOVS1K/Orai1 在紅光 (580nm)照射之下,LOVS1K 無法被紅光活化,<br />
沒有 Ca 2+ 進入細胞內和 CaM-RhoA(DP) 作用,因此沒有細胞形態改<br />
變。<br />
CaRQ 融合蛋白在 Ca 2+ 誘導下,也會改變細胞的移動特性。<br />
1. 當細胞同時表現 CaRQ 和 LOVS1K/Orai1,在藍光 (445nm)照射之下,<br />
3
LOVS1K 活化而和 Orai1 膜蛋白鈣離子通道結合,引起 Ca 2+ 進入細<br />
胞內和 CaRQ 作用,細胞形態從 not blebbing 轉成 blebbing,同時觀<br />
察到細胞移動直線性下降,移動速度上升。<br />
2. 若在相同的實驗當中,將紅光取代藍光,或是將有活性的 RhoA 突變<br />
成沒有活性的 RhoA (T19N),或是加入蛋白質抑制劑 (Y-27632、<br />
blebbistatin),細胞形態和細胞移動性則沒有產生變化,顯示活化<br />
LOVS1K 的波長、RhoA 和 ROCK 活性都是調控因素。<br />
利用藍光、VEGF-A、acetylcholine (ACh) 誘導表現 CaRQ 的細胞向特定方<br />
向移動。<br />
1. 經過 24 小時的群體細胞遷移實驗 (transwell assay),分別表現 CaRQ/<br />
LOVS1K/Orai1、CaRQ/VEGFR2、CaRQ/nAChR-α4 的細胞,在藍光、<br />
VEGF-A、ACh 誘導之下,細胞會往帶有誘導物的 well 底部移動;當<br />
誘導物同時出現在 well 頂部和底部時,則沒有細胞移動的現象產生,<br />
結果顯示,誘導物是指引細胞移動的因素。<br />
2. 利用表現 CaRQ/ LOVS1K/Orai1 的 Jurkat cell 進行光源測試,在顯微<br />
鏡下觀察 90 分鐘,結果顯示細胞會往藍光光源的方向移動。<br />
參考文獻<br />
1. A. Hall, Rho GTPases and the actin cytoskeleton, Science 279 (1998)<br />
509–514.<br />
2. E. Mills, E. Pham, K. Truong, Structure based design of a Ca 2+ -sensitive<br />
RhoA protein that controls cell morphology, Cell Calcium 48 (2010) 195–<br />
201.<br />
3. E. Mills, K. Truong, Ca( 2+ )-mediated synthetic biosystems offer protein<br />
design versatility, signal specificity, and pathway rewiring, Chemistry and<br />
Biology 18 (2011) 1611–1619.<br />
4. E. Pham, E. Mills, K. Truong, A synthetic photoactivated protein to generate<br />
local or global Ca( 2+ ) signals, Chemistry and Biology 18 (2011) 880–890.<br />
4
圖表<br />
表一、HEK 293 細胞表現不同 RhoA 的細胞形態說明。<br />
基因建構描<br />
述<br />
無 Ca 2+ 誘導<br />
下的細胞形<br />
態<br />
Ca 2+ 誘導下<br />
的細胞形態<br />
RhoA(DP) CaM-RhoA(DP) CaRQ<br />
RhoA(DP) 是一個<br />
經過突變 (Q63L)<br />
能夠一直和 GTP<br />
結合而處於活化狀<br />
態的 RhoA。RhoA<br />
活化後會和下游的<br />
ROCK 結合,產生<br />
blebbing 的形態變<br />
化。<br />
CaM-RhoA(DP) 上<br />
的 CaM(Calmodulin)<br />
是攜鈣素,在有<br />
Ca 2+ 誘導環境下,<br />
CaM 會和 RhoA<br />
結合,使 RhoA 構<br />
型改變,失去活性而<br />
無法和 ROCK 作<br />
用。<br />
5<br />
CaM 在沒有 Ca 2+<br />
誘導環境下,CaM<br />
會和 RhoA 當中的<br />
IQp 片段結合,使<br />
RhoA 不活化;在有<br />
Ca 2+ 誘導環境下,<br />
CaM 會和 MLCKp<br />
片段結合,此時<br />
RhoA 構型不受影<br />
響,呈現活化狀態。<br />
Blebbing Blebbing No blebbing<br />
Blebbing No blebbing Blebbing<br />
圖一、左圖為正常形態的細胞 (wild type morphology);右圖則為 blebbing cell。<br />
當 RhoA/ROCK 活化之後會進一步使 actin-myosin 產生收縮增加細胞骨架的<br />
張力,此張力會使得細胞膜短暫地從細胞質上脫離,細胞膜突出,細胞表面呈現<br />
不規則的小泡突起,稱為 blebbing cell。<br />
圖二、左圖為 CaM-RhoA(DP) 的基因建構圖以及在 Ca 2+ 誘導之下<br />
RhoA/ROCK 所產生的不活化示意圖;右圖則為 CaRQ 的基因建構圖以及在<br />
Ca 2+ 誘導之下 RhoA/ROCK 所產生的活化示意圖。
圖三、直線性計算法,當一個細胞行經五個時間點的時候,左圖的直線性較高,<br />
而右圖的直線性較低。<br />
圖四、在 transwell assay 中,分別利用藍光、VEGF-A 以及 acetylcholine (ACh)<br />
來刺激細胞遷移。<br />
6