洪佳麟 - 黃慶璨研究室

本研究欲完成之項目
本研究欲測試甲殼素對 C. neoformans 生物膜形成之抑制作用,比較生物膜與懸浮細
胞對甲殼素敏感性的不同,及 C. neoformans 產生黑色素是否會影響其對甲殼素的抗性。
材料與方法
1.菌株:C. neoformans B3501,以 Sabouraud dextrose broth 於 30 o C 培養 24 小時備用。
2.生物膜培養:培養真菌細胞後離心收集之,以 PBS 洗兩次,重新懸浮,濃度為 10 7
cells/cm 2 ,將菌液加入 96 孔盤中,於 37 o C 靜置培養,48 小時形成生物膜,以 96 孔盤清
洗器清洗,餘下吸附其上的生物膜。
3. XTT (2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino) carbonyl]- 2Htetrazolium-hydroxide)reduction
assay:在含有菌液的96孔盤中加入XTT溶液,於37 o C培
養5小時。細胞的mitochondrial dehydrogenase會將XTT tetrazolium salt還原成橘紅色XTT
formazan。以microtiter reader測量顏色變化,以反應細胞活性。
4.真菌細胞黑色素化:以含有 1 mM L-dopa 的 minimal medium broth 培養生物膜 7 天,對
照組則是以無 L-dopa 的 minimal medium broth 培養生物膜 7 天。
5. 甲殼素對 C. neoformans 生物膜的影響:於形成生物膜的 wells 中加入 200 μl 含有不同
濃度甲殼素的 PBS 作用 1 分鐘,於 37 o C 培養 0.5、1 小時,進行 XTT reduction 及 CFU
測量。
6.莢膜大小測量:10 μL細胞與India ink混合,以Olympus AX70 microscope觀察並測算莢
膜大小。
7. ELISA spot:以96孔盤培養生物膜,用microtiter plate washer以含0.05% Tween 20的TBS
洗三次,再以200 ml含有1% BSA的PBS清洗。此後加入2 mg/mL GXM
(glucuronoxylomannan)binding MAb 18B7 接著加入1 mg/mL of biotin-labeled goat
anti-mouse (GAM) IgG1。以含0.05% Tween 20的TBS清洗後,加入50 ml BCIP
(bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) ,於37 o C培養1小時,以無菌水沖洗5次後風乾。
8.多醣分子大小計算:以90Plus/BI-MAS Multi Angle Particle Sizing analyzer內建的quasy
elastic light scattering (QE LS)來分析所分離多醣分子的大小。
9. Zeta potential測量:以Zeta potential analyzer分析樣本粒子的zeta potential,以得知細胞
表面電位。