MICOBATTERI - Sezione di Microbiologia

Facoltà di Medicina e Chirurgia Università di Genova
TUBERCOLOSI
MICOBATTERI
prof. Oliviero E. Varnier
WWW.MICROBIOLOGIA.UNIGE.IT
Sezione di Microbiologia – Dipartimento di Scienze Chirurgiche Diagnostiche Integrate (DISC)
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CLASSIFICAZIONE
CLASSIFICAZIONE
Il genere comprende oltre 100 specie che si presentano come cellule di
forma bacillare, lunghe dai 2 ai 4 µm e con un diametro tra i 0,3-0,5 µm.
I micobatteri appartengono alla famiglia delle Mycobacteriaceae e sono
inclusi, assieme a corinebatteri, nocardie e ad altri batteri, nell’ordine
degli Actinomycetales.
Del genere Mycobacterium fanno parte importanti patogeni per l’uomo
e gli animali e numerosi batteri ambientali, alcuni dei quali in particolari
circostanze possono causare patologie nell’ospite immunocompromesso.
Storicamente sono sempre stati considerati dei batteri aerobi, tuttavia
recentemente è stata dimostrata la presenza di una completa batteria di
enzimi coinvolti nel metabolismo anaerobio e si ritiene quindi che possano
essere considerati aerobi/anaerobi facoltativi.
Sono immobili, asporigeni e presentano una caratteristica parete cellulare,
ricca in lipidi complessi, polisaccaridi e glicolipidi.
Esternamente alla membrana plasmatica troviamo lo strato di
peptidoglicano, cui sono legati covalentemente polisaccaridi a
lunga catena come arabinogalattani, lipoarabinomannani (LAM)
e lipomannani che formano un ponte tra il peptidoglicano e gli acidi
micolici.
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CLASSIFICAZIONE
Figura 23.1 Ultrastruttura di Mycobacterium tuberculosis e struttura della parete cellulare.
A. Microfotografi a al microscopio elettronico a trasmissione, con ingrandimento della zona
corrispondente alla parete cellulare.
FATTORE
CORDALE
CLASSIFICAZIONE
Gli acidi micolici, che costituiscono i principali costituenti della parete
esterna, sono acidi grassi a lunga catena (fino a 70 atomi di carbonio) la
cui testa polare è rivolta verso la membrana plasmatica, e la porzione
apolare verso l’esterno, dove interagisce con altri glicolipidi di piccole
dimensione che rivestono la parete.
Esternamente alla parete ritroviamo zuccheri che costituiscono una
struttura simil-capsulare, in associazione con lipidi e glicolipidi che sono
rilasciati dal batterio e che interagiscono direttamente con la cellula.
È stato dimostrato che molti componenti della parete cellulare
presentano un’attività biologica essenziale per i micobatteri patogeni umani
come Mycobacterium tuberculosis.
B. Rappresentazione schematica della parete cellulare. MP,
membrana plasmatica; PG, peptidoglicano; AG, arabinogalattano;
ME, membrana esterna; LAM, lipoarabinomannano; AM, acidi
micolici; TDIM, trealosio dimicolato (fattore cordale); GL, glicolipidi.
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La parete dei micobatteri è quindi costituita da un doppio strato lipidico,
assimmetrico e complesso, che definisce una struttura funzionalmente
simile alla membrana esterna dei batteri gram-negativi.
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CLASSIFICAZIONE
Le caratteristiche della parete fanno sì che i micobatteri non si colorino
con la colorazione di Gram ma mediante la colorazione Ziehl-Nielsen,
che evidenzia le proprietà tintoriali note come acido-alcol resistenza.
Tale proprietà consiste nella capacità dei batteri di trattenere, una volta
colorati con carbolfucsina, la colorazione rossa anche quando
sottoposti a trattamenti decoloranti energici con acidi e alcol.
CLASSIFICAZIONE
I micobatteri vengono suddivisi in due grandi gruppi: a lenta e a rapida
crescita (tab. 23.1).
I micobatteri a lenta crescita comprendono numerose specie di interesse
nella patologia umana e animale e tra queste le più importanti sono: M.
tuberculosis, M. leprae e M. ulcerans.
Alcune specie possono causare infezioni croniche granulomatose nell’ospite
immunocompetente, mentre l’ospite immunodepresso è esposto alla possibilità
di infezioni disseminate da parte di molti micobatteri, che si comportano da
opportunisti.
Le specie più frequentemente isolate sono: da M. avium intracellulare (MAI)
complex.
I micobatteri a rapida crescita comprendono specie prevalentemente
ambientali e non di interesse per la patologia umana, sebbene alcuni di
esse possano raramente causare patologia nell’uomo:
È il caso di: M. chelone, che può causare infezioni polmonari croniche; M.
fortuitum e M. abscessus, che possono causare infezione dei tessuti molli o
infezioni disseminate nell’ospite immunocompromesso.
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Tab 23.1 Micobatteri non tubercolari che possono essere isolati da
campioni clinici
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Mycobacterium tuberculosis è l’agente eziologico della tubercolosi (TB),
un’antica malattia polmonare cronica che ha accompagnato la storia
dell’uomo negli ultimi millenni.
Numerosi reperti archeologici come scheletri di oltre 8000 anni fa e
mummie degli Egizi e Inca hanno evidenziato lesioni ossee compatibili con
l’infezione tubercolare.
Nel corso dei secoli la TB è stata una minaccia costante per l’uomo, in
particolare nelle aree urbane e densamente popolate, dove si sono verificati
frequenti fenomeni epidemici responsabili della attuale pandemia.
M. tuberculosis appartiene al gruppo Mycobacterium tuberculosis
complex (MTBC), di cui fanno parte M. canettii, M. africanum, M. microti
e M. bovis. Per l’elevata omologia nucleotidica. il gruppo MTBC oggi è
considerato come singola specie e i suoi componenti come subspecie.
M. tuberculosis, M. canetti e M. africanum sono gli agenti eziologici della TB
nell’uomo.
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MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
M. bovis è l’agente eziologico della TB negli animali e ha uno spettro
d’ospite molto ampio, potendo infettare bovini, antilopi, foche, elefanti, leoni
ecc. Raramente causa patologia nell’uomo, che si infetta assumendo
alimenti contaminati, come il latte di bovini infetti.
M. microti è l’agente eziologico della TB nei roditori e non è patogeno per
l’uomo.
Nel 1998 è stato completato il sequenziamento del genoma di M.
tuberculosis H37Rv. Il genoma è costituito da 4 411 529 bp e
codifica per 3986 proteine.
Più recentemente è stato completato il genoma di un ceppo clinico di M.
tuberculosis (ceppo CDC1551) e quello di un ceppo di M. bovis.
Nel complesso è stato osservato che M. tuberculosis presenta:
un maggior numero di geni rispetto a quanto osservato per altri batteri patogeni,
un metabolismo più complesso di quanto fosse possibile ritenere in passato
e può essere considerato:
una specie geneticamente stabile con poca variabilità genetica.
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MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Analisi di genomica comparativa tra vari ceppi di MTBC hanno
permesso di individuare regioni in cui maggiori sono le differenze
tra questi e di definire in modo corretto i rapporti genetici e quindi
evolutivi tra le varie specie e/o sottospecie.
È stato possibile costruire un albero genealogico all’interno di MTBC
e di dimostrare come le varie subspecie si siano evolute attraverso
un processo di DELEZIONE GENICA, in cui frammenti di genoma
anche di diverse decine di kb SONO STATI PERSI.
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MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
EPIDEMIOLOGIA
È interessante notare come questo processo abbia avuto un effetto
sull’adattamento all’ospite/i mammifero.
Ad esempio, le tre subspecie che causano la TB nell’uomo, M. tuberculosis,
M. africanum e M. canettii, raramente o mai infettano gli animali.
M. microti è l’agente eziologico della TB nei roditori di campagna, ma è
assolutamente avirulento per l’uomo.
È interessante osservare inoltre come M. microti abbia perso per delezione
genica un frammento di genoma simile a quello responsabile della perdita di
virulenza del ceppo BCG.
M. bovis presenta il maggior numero di delezioni geniche e
paradossalmente presenta il più ampio spettro d’ospite.
Si stima che la TB uccida ogni giorno circa 5000 persone.
L’OMS indica
circa 1,5-2 milioni il numero di decessi all’anno,
8-10 milioni il numero di nuovi casi e
circa 30 milioni il numero di pazienti con TB attiva.
Il 95% dei casi si registra nei Paesi in via di sviluppo: Africa sub-sahariana e
alcuni Paesi del Sud-Est asiatico, dove l’incidenza della malattia è
nell’ordine dei 100-500/100.000 abitanti.
in questi Paesi la TB rappresenta un drammatico problema sanitario, sociale
ed economico.
Le nuove migrazioni, l’avvento dell’AIDS, la comparsa di nuove povertà
hanno determinato un riemergere dell’infezione anche nei paesi
industrializzati.
Per tali motivi l’OMS ha dichiarato nel 1993 la TB emergenza globale.
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QUIZ N° 41042
Si stima che la TB uccida ogni giorno circa 5000 persone.
L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) indica in circa 1,5-2
milioni il numero di decessi all’anno, in 8-10 milioni il numero di nuovi
casi e in circa 30 milioni il numero di pazienti con TB attiva. Il 95% dei
casi si registra nei Paesi in via di sviluppo, in particolare nell’Africa subsahariana
e alcuni Paesi del Sud-Est asiatico, dove l’incidenza della
malattia è nell’ordine dei 100-500/100.000 abitanti.
QUALE È L’EPIDEMIOLOGIA DELLA TUBERCOLOSI NEL MONDO
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QUIZ N° 41043
QUIZ N° 41045
Le nuove migrazioni, l’avvento della sindrome da immuno
deficienza acquisita (AIDS), la comparsa di nuove povertà hanno
determinato un riemergere dell’infezione anche nei paesi sviluppati
In Italia …La situazione è ancora sotto controllo (incidenza 5-
10/100 000 abitanti) e si stima che circa la metà dei pazienti con
TB sia rappresentata da emigrati provenienti da regioni ad alta
endemia di TB.
PER QUALI MOTIVI L’OMS HA DICHIARATO NEL 1993 LA TB
EMERGENZA GLOBALE
QUALE È L’EPIDEMIOLOGIA DELLA TUBERCOLOSI IN
ITALIA
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Malattie Frequenti
CARATTERISTICHE GENERALI
Mycobacterium tuberculosis è senza dubbio uno dei più antichi,
complessi ed evoluti agenti infettivi per l’uomo, e ha sviluppato nel corso
dell’evoluzione sofisticati meccanismi per evadere la risposta
immunita ria dell’ospite o per trarre vantaggio dalla stessa.
Una delle principali caratteristiche di M. tuberculosis è la sua capacità
di:
resistere all’azione battericida dei macrofagi, mediante un meccanismo
che prevede l’inibizione della fusione lisosoma-fagosoma.
Il micobatterio rimane così in un vacuolo non acidificato, in cui sono assenti
gli enzimi e molecole ad azione microbicida e dove il micobatterio è in grado
di replicarsi attivamente.
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Figura 23.2. Analisi microscopica di tessuto polmonare isolato da un topo
infettato Sperimentalmente con Mycobacterium tuberculosis
FATTORI di VIRULENZA
Non sono stati ancora identificati le proteine e i fattori di virulenza di
M. tuberculosis, sebbene si ipotizzi un diretto coinvolgimento delle
proteine codificate dalla regione di differenza 1 (RD1).
La regione RD1 è un frammento di genoma di 10,7 kb che codifica per
numerosi geni, tra cui in particolare Esat-6 e cfp10.
Tale regione è assente nel ceppo vaccinico M. bovis BCG ed è stato
dimostrato come l’attenuazione di quest’ultimo sia dovuta all’assenza di
RD1. Infatti l’inserimento della regione RD1 nel genoma di BCG ha come
risultato un aumento della virulenza del ceppo BCG ricombinante.
A. Infiltrato cellulare che si organizza in granuloma. I micobatteri risiedono prevalentemente
nella parte centrale del granuloma, all’interno di macrofagi “schiuomosi”. B. Macrofagi infettati
con M. tuberculosis.
la proteina ESAT-6, codificata dalla regione RD1, potrebbe indurre la
formazione di pori nelle membrane dei vacuoli del macrofago in cui il
micobatterio si moltiplica.
La regione che codifica per ESAT-6 e CFP10 comprende anche altre
proteine che costituiscono l’apparato secretorio.
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FATTORI di VIRULENZA
La secrezione di proteine e antigeni attraverso la membrana
rappresenta un potente ed efficace sistema per interferire con i
meccanismi di difesa dell’ospite.
Anche per M. tuberculosis questo meccanismo promuove l’azione
patogena e assicura la moltiplicazione nei tessuti dell’ospite.
Oltre ai sistemi di secrezione delle proteine ESAT-6 e CFP10, M.
tuberculosis presenta altri sistemi di secrezione come il Sec e il TAT.
Il sistema Sec è coinvolto nella secrezione della superossido dismutasi, un
enzima che consente al micobatterio di rendere meno battericida l’ambiente
all’interno del fagolisosoma. Ceppi di M. tuberculosis in cui il Sec è stato
inattivato geneticamente risultano essere fortemente attenuati.
I sistemi di secrezione finora caratterizzati mediano il trasporto delle proteine
attraverso la membrana plasmatica.
È noto che componenti non proteiche della parete cellulare di M.
tuberculosis intervengono nel meccanismo di patogenicità e tra questi un ruolo
importante viene svolto dagli acidi micolici che sono delle complesse strutture
molecolari di acidi grassi a lunga catena. Gli acidi micolici più semplici sono
costituiti da due catene, una lunga fino a 60 atomi di carbonio (distale) e una
più corta (prossimale). Esistono cinque tipi di acidi micolici.
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PATOGENESI
Gli acidi micolici possono essere organizzati in strutture complesse
quando legati covalentemente con arabinogalattani o altri zuccheri.
Il trealosio dimicolato (TDIM), anche noto come FATTORE CORDALE, è
uno dei più importanti ed esercita una potente azione biologica.
Presenta un’attività immunostimolatoria, stimola la secrezione di citochine ed
è strettamente coinvolto nel meccanismo di patogenesi che sfocia con il danno
tissutale tipico della TB.
È coinvolto nella protezione da stress ambientali, contribuisce alla bassa
permeabilità della parete cellulare che conferisce una naturale resistenza ai
farmaci ed è coinvolto nella protezione dagli stress ossidativi e nella
persistenza nei tessuti dell’ospite immunocompetente.
La porzione esterna della parete è ricca in glicolipidi complessi e fenolici,
che sono delle cere non polari rilasciate dalla cellula e svolgono una importante
azione biologica
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RAPPORTO OSPITE-PARASSITA
L’interazione dei micobatteri con il sistema immunitario innato e
acquisito, gioca un ruolo fondamentale nel rapporto ospite-parassita.
Alcuni componenti di parete interagiscono con recettori presenti sulla
superficie delle cellule del sistema immunitario, tra cui in particolare i
recettori Toll-like (TLR). È stato dimostrato ad esempio che il LAM
interagisce con il TLR2, così come alcune proteine di parete.
è stato possibile dimostrare l’induzione di apoptosi, che consente al
micobatterio di evadere la risposta dell’ospite o di modulare l’intensità
della risposta immunitaria.
M. tuberculosis induce una intensa risposta cellulare specifica diretta
verso gli antigeni secreti dal micobatterio durante le prima fasi dell’infezione.
Ad esempio, le proteine Esat-6 e CFP10 sono due tra gli antigeni più
immunogenici di M. tuberculosis, tanto da essere utilizzati come base per
la diagnosi indiretta di infezione da M. tuberculosis.
RISPOSTA IMMUNITARIA
La caratterizzazione immunologica della risposta immunitaria che si
sviluppa in risposta all’infezione da M. tuberculosis è piuttosto complessa.
La risposta cellulare è caratterizzata dalla presenza di linfociti CD4, che
secernono citochine pro-infiammatorie (IFN-γ) e da linfociti CD8 ad azione
citotossica.
Non è stato possibile ad oggi evidenziare dei correlati immunologici di
protezione, vale a dire un tipo di risposta immunitaria specifica correlabile
con il controllo dell’infezione.
L’assenza di tali informazioni rende ancora più difficile lo sviluppo di un
nuovo vaccino contro la TB.
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PATOGENESI
Mycobacterium tuberculosis si trasmette per via aerea da un paziente malato con
TB polmonare attiva e aperta e si ritiene siano sufficienti pochi batteri per iniziare
infettato il ciclo patogenetico di infezione nel nuovo paziente.
Il bacillo, una volta raggiunto lo spazio alveolare, viene fagocitato dai macrofagi
alveolari, dove può essere rapidamente ucciso oppure può resistere a tale azione
microbicida. Nel primo caso l’infezione non ha luogo e l’ospite non matura alcuna
risposta immunitaria specifica.
PATOGENESI
Quando viceversa i bacilli resistono all’azione mi
crobicida dei macrofagi, si ha moltiplicazione atti
va all’interno del macrofago e i micobatteri possono
infettare anche altri fagociti e cellule epiteliali pre
senti in prossimità del sito di infezione.
Durante questa fase i batteri possono disseminarsi
e raggiungere attraverso il sangue qualsiasi tessuto
e organo.
Alveolo 27
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PATOGENESI
La moltiplicazione batterica richiama
cellule del sistema immunitario che
iniziano a infiltrarsi e a organizzare il
tipico granuloma attorno al sito di
infezione primaria.
La presenza di leucociti e la secrezione
di citochine e chemochine ad azione
infiammatoria inducono la comparsa
della tipica necrosi caseosa.
Nel 90-95% dei casi la risposta
dell’ospite è in grado di circoscrivere e
controllare l’infezione e nell’ospite per
mane soltanto una lesione nel sito di
infezione primaria che prende il nome di
complesso primario
PATOGENESI
In questi soggetti il bacillo non viene completamente ucciso ma permane
in una fase di latenza.
Si stabilisce un equilibrio tra M. tuberculosis e il sistema immunitario
dell’ospite, in cui da un lato si impedisce la moltiplicazione incontrollata
del bacillo e dall’altro il bacillo è in grado di resistere all’azione
microbicida del sistema immunitario.
Tale condizione è evidenziata dalla presenza di una intensa risposta
cellulo-mediata nei confronti degli antigeni di M. tuberculosis,
classicamente evidenziata dalla reazione della tubercolina (Mantoux).
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PATOGENESI
La fase di latenza, clinicamente asintomatica,
può perdurare anche per decenni e può sfociare
in circa il 5-10% dei casi in una riattivazione
dell’infezione con comparsa di TB attiva.
In questi casi, così come quando l’infezione
primaria non viene controllata, il bacillo si replica
attivamente e la risposta dell’ospite non solo
non è in grado di controllare l’infezione ma è
responsabile del danno tissutale tipicamente
associato alla TB (immunopatologia).
PATOGENESI
La moltiplicazione del batterio richiama cellule del sistema immunitario, che
mediante la secrezione di chemochine e citochine inducono uno stato infi
ammatorio che causa una necrosi caseosa e danno tissutale che sfocia
nella comparsa delle tipiche caverne presenti a livello del parenchima
polmonare: questa è la classica forma di TB polmonare, clinicamente
evidente e che rappresenta la forma contagiosa dell’infezione.
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PATOGENESI
Sebbene nella maggior parte dei casi la TB attiva si presenti a livello
polmonare, pressoché tutti gli organi possono essere colpiti (reni, ossa,
linfonodi, cute ecc.) e in questi casi si assiste alla comparsa di strutture
granulomatose che sono poi responsabili del danno tissutale e quindi della
comparsa della patologia.
Nei neonati o in soggetti con deficit immunitari importanti si può assistere
a una moltiplicazione incontrollata del bacillo, con comparsa di una infezione
disseminata (ad esempio TB miliare) che può anche evolvere in meningite
tubercolare. In questi casi, in assenza di un opportuno trattamento,
l’evoluzione della malattia può essere rapida e ad esito infausto.
VACCINO BCG:IL BACILLO DI CALMETTE E GUÉRIN
Il bacillo di Calmette e Guérin (BCG) è ancora oggi l’unico vaccino
disponibile contro la TB.
Il BCG è un vaccino vivo attenuato, ottenuto da Calmette e Guérin
mediante passaggi seriali in terreno di patata biliata a partire da un ceppo
virulento di M. bovis.
Durante il processo di attenuazione, il ceppo BCG ha perso numerosi
frammenti di genoma, che prendono il nome di regioni di differenza (RD).
Poiché il passaggio dei ceppi è avvenuto anche dopo l’isolamento del
ceppo vaccinico da Calmette e Guérin, si è assistito alla perdita di
frammenti di genoma anche in epoche successive, tanto che oggi si
conoscono ceppi diversi di BCG, che normalmente prendono il nome
dalle case farmaceutiche che li producono, i quali presentano un diverso
pattern di RD.
La più importante delle regioni RD è la RD1, che contiene una regione del
genoma che codifica per i geni Esat-6 e cfp10, e più in generale per il
cluster genico ESX1:
RD1 è essenziale per la virulenza di M. tuberculosis.
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VACCINO
VACCINO
A partire dal 1921, anno della prima immunizzazione con BCG, sono
state somministrate in tutto il mondo centinaia di milioni di dosi di
BCG.
Il vaccino BCG si somministra subito dopo la nascita per via
sottocutanea e dopo un mese si verifica l’avvenuta immunizzazione
mediante il test della tubercolina.
Nel corso del secolo scorso è stato possibile evidenziare pregi e difetti
del vaccino. Il vaccino si è dimostrato sostanzialmente sicuro e il basso
costo ha reso possibile l’attuazione di procedure di immunizzazione
anche nei paesi più poveri.
Il vaccino BCG si è inoltre dimostrato effi cace nel prevenire le forme,
spesso fatali, di TB disseminata (miliare) e di meningite tubercolare
nei bambini.
Studi in paesi ad alta endemia di TB hanno dimostrato come l’efficacia di
BCG nel prevenire le forme di TB attiva sia scarsa e spesso quasi zero
l’interferenza di micobatteri ambientali con lo sviluppo di una risposta
immunitaria, che potrebbe essere responsabile dello svanire col tempo della
risposta immunitaria indotta dal vaccino e dell’inefficacia di strategie di richiamo
(boosting);
BCG, ceppo attenuato ma vitale, non dovrebbe essere somministrato per ragioni
di sicurezza nei soggetti con infezione da HIV, che come noto rappresentano una
popolazione particolarmente a rischio per lo sviluppo della TB.
Poiché le persone vaccinate con BCG sviluppano una positività alla
tubercolina, questo test non può essere efficacemente utilizzato, in una
popolazione vaccinata, per valutare la prevalenza dell’infezione in una data
comunità o individuare i contatti (persone che, vivendo a contatto con un
soggetto cui è stata diagnosticata una TB attiva, sono state infettate da M.
tuberculosis).
Questi aspetti limitano fortemente la validità del test della tubercolina come
strumento di diagnosi immunologica.
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NUOVI VACCINI
HOSPITAL ALLI CAUSAI
Negli ultimi anni, anche grazie a un rinnovato investimento nella
ricerca sulla TB, abbiamo assistito allo sviluppo di nuovi vaccini
sperimentali.
Sono state implementate diverse strategie di vaccinazione:
vaccini a subunità, costituiti da due o più antigeni ricombinanti e purifi
cati di M. tuberculosis, somministrati con sostanze adiuvanti;
ceppi di Vaccinia virus ricombinanti che esprimono antigeni dominanti
di M. tuberculosis;
ceppi di BCG ricombinanti che iperesprimono antigeni dominanti o che
sono stati modifi cati per renderli più immunogenici.
I risultati ottenuti con alcuni di questi vaccini sono buoni in modelli
preclinici animali e si spera che gli studi clinici possano a breve
fornire una valida alternativa al vaccino BCG.
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DIAGNOSI
PROMOZIONE E ASSISTENZA COMUNITARIA
La diagnosi di infezione da M. tuberculosis, così come per gli altri
agenti di infezione, viene classicamente distinta in diagnosi
microbiologica o diretta e in diagnosi immunologica o indiretta.
La prima viene utilizzata per evidenziare soggetti con TB attiva,
mentre la seconda viene utilizzata per evidenziare i soggetti infettati
con M. tuberculosis, ma non è in grado di distinguere tra soggetti
sani (infezione latente) e soggetti malati (infezione attiva).
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RISULTATI TB
DIAGNOSI DIRETTA
15 comunitá sotto controllo
2400 persone monitorate
2169 PPD (Mantoux) letti
408 Bacilloscopie realizzate
380 Colture Lowenstein realizzate
21 Pazienti tratatti
CAMPIONI: la diagnosi microbiologica si basa normalmente sulla ricerca di M.
tuberculosis nel campione biologico (espettorato, lavaggio bronco alveolare,
urine, linfonodo ecc.).
DECONTAMINAZIONE: i campioni biologici polimicrobici, quali ad esempio
espettorati, devono essere decontaminati mediante trattamento con soluzioni
contenenti idrossido di sodio, cui il bacillo è resistente, per eliminare la flora
microbica presente e concentrati per incrementare le possibilità di isolare il
bacillo.
PAUCIBACILLARE: è infatti importante ricordare che pazienti con TB attiva
possono eliminare anche solo pochi bacilli, che moltiplicandosi molto lentamente
nei terreni di coltura, verrebbero rapidamente sopraffatti dalla presenza di altri
batteri nel campione biologico. Anche per tali motivi, la diagnosi microbiologica
viene normalmente eseguita, laddove possibile, su almeno tre campioni
consecutivi di espettora to e sulle urine del mattino raccolte per tre giorni
consecutivi.
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DIAGNOSI DIRETTA: ESAME MICROSCOPICO
Il campione viene analizzat0 al microscopio previa colorazione con Ziehl-Nielsen. La
presenza di batteri AAR è indicativa di una infezione attiva causata da micobatteri
patogeni, sebbene sia necessario identificare i micobatteri e distinguerli da altri
batteri acido-alcol resistenti (actinomiceti, nocardie).
I micobatteri si presentano al microscopio come dei bacilli rossi su sfondo blu,
allungati (A) e nel caso di M. tuberculosis spesso organizzati in piccoli gruppi di 3-10
bacilli (aggregati, B).
L’analisi microscopica presenta importanti vantaggi: 1) semplicità, 2) rapidità di
esecuzione, 3) il basso costo e 4) permette di evidenziare i soggetti contagiosi. È
stato calcolato che nei Paesi ad alta endemia di TB, l’analisi microscopica consenta
di evidenziare circa il 60% dei pazienti con TB attiva.
DIAGNOSI DIRETTA: ESAME COLTURALE
Il metodo diagnostico più sensibile è rappresentato dalla coltura. Per tali
motivi, nei laboratori opportunamente attrezzati, una seconda aliquota di
campione viene utilizzata per allestire le colture.
Si procede normalmente all’inoculo di un terreno solido (Lowestein-
Jensen), costituito da tuorlo d’uovo, glicerolo e verde di malachite come
inibitore della crescita di altri batteri (B).
La crescita dei micobatteri e in particolare di M. tuberculosis è molto lenta, e
possono essere necessari fino a 45 giorni di incubazione prima di
evidenziare colonie nel terreno (D).
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DIAGNOSI DIRETTA: AUTOMAZIONE E IDENTIFICAZIONE
Al fine di evidenziare più rapidamente i micobatteri in coltura, sono stati
sviluppati dei sistemi automatizzati costituiti da terreni liquidi, in grado di
evidenziare la crescita dei micobatteri mediante la misurazione del
consumo di ossigeno o di altri metaboliti come ad esempio acidi grassi
marcati radioattivamente (14C). L’utilizzo di tali sistemi di coltura ha
permesso di ridurre significativamente il tempo necessario per isolare in
coltura i micobatteri (20-30 giorni).
Una volta che la coltura evidenzia la presenza di micobatteri, è importante
procedere all’identificazione. In passato venivano utilizzate numerose
reazioni per identifi care la specie di micobatterio isolata.
Recentemente, l’utilizzo delle tecniche di diagnosi e identificazione
molecolare ha reso queste tecniche obsolete.
DIAGNOSI MOLECOLARE
La diagnosi molecolare di infezione da M. tuberculosis o da micobatteri è
oggi uno strumento di grande utilità, che consente di diagnosticare
rapidamente (< 24 ore) e con elevata specificità e sensibilità la presenza di
micobatteri nei campioni biologici.
La diagnosi molecolare può essere eseguita direttamente nel campione
biologico o nella colonia isolata in coltura. Nel primo caso si ricerca
normalmente M. tuberculosis, che è di gran lunga il principale micobatterio
di interesse nella patologia umana, mediante tecniche di amplificazione
genica che ricercano sequenze di DNA specifiche per M. tuberculosis. La
specificità di tali sistemi diagnostici è molto elevata, e così pure la
sensibilità che consente di individuare fi no a 10-50 batteri per campione.
L’identificazione molecolare può essere eseguita amplificando delle sequenze di
DNA condivise tra i micobatteri (ad esempio un frammento di DNA che codifica
per la proteina HSP65 o per l’rRNA 16S) e procedere successivamente al
sequenziamento della suddetta regione.
Nei paesi in via di sviluppo l’analisi microscopica dell’espettorato rappresenta
spesso l’unico strumento per fare diagnosi di TB.
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Diagnosi indiretta
Diagnostica
La diagnosi indiretta si basava sulla dimostrazione di una risposta
immunitaria specifica dell’ospite nei confronti di antigeni di M.
tuberculosis. La reazione alla tubercolina consiste nell’inoculo per via
intradermica di un preparato proteico purificato di M. tuberculosis (PPD).
Dopo 48-72 ore nei soggetti infettati con M. tuberculosis si assiste alla
comparsa di una reazione di ipersensibilità ritardata, visibile per la
comparsa di una papula eritematosa, che in alcuni casi può andare
incontro a necrosi. Una reazione si definisce positiva quando il diametro
della papula è maggiore di 10-15 mm.
La reazione alla tubercolina è stata (NON PIU’) utilizzata come sistema
di screening della popolazione e per evidenziare i contatti.
È noto che tale reazione presenti alcuni importanti svantaggi. La
specificità è normalmente bassa, poiché soggetti venuti a contatto con
micobatteri ambientali possono risultare positivi alla reazione. Nella PPD
sono infatti presenti antigeni simili a quelli di altri micobatteri. Un altro
importante svantaggio è rappresentato dal fatto che soggetti vaccinati
con BCG risultano positivi al test della tubercolina, e considerando che
la vaccinazione con BCG è obbligatoria nei paesi ad alta endemia di TB,
è facile concludere come in questi paesi la reazione alla PPD sia di
scarsa utilità. 47
48
12

IMMUNITA’ CELLULO MEDIATA
Recentemente sono stati messi in commercio test diagnostici specifici per
la reazione immunitaria nei confronti di antigeni di M. tuberculosis.
Gli antigeni utilizzati sono specifici per M. tubercolosis e non sono
espressi da BCG.
Si procede al prelievo di sangue periferico dai soggetti e alla stimolazione
dei leucociti in vitro con gli antigeni purifi cati per 16-20 ore a 37 °C.
Si procede quindi alla raccolta del plasma e si misura la quantità di interferone-γ
prodotta.
I leucociti isolati da soggetti con infezione da M. tuberculosis (latente o attiva)
saranno in grado di secernere interferone-γ quando messi a contatto con gli
antigeni di M. tuberculosis.
Questi sistemi di diagnosi immunologica di TB consentono di distinguere tra
soggetti vaccinati con BCG e soggetti infetti, presentando l’ulteriore
vantaggio di non richiedere l’inoculo di sostanze nel paziente.
Diversi sistemi di diagnosi sierologica per la ricerca di anticorpi specifici
sono stati messi a punto, ma la sensibilità e la specificità osservate sono
state poco soddisfacenti e tali da sconsigliare l’utilizzo.
TERAPIA
La terapia contro le infezioni da M. tuberculosis si basa sempre sull’utilizzo
di più farmaci contemporaneamente per non selezionare le resistenze.
I farmaci contro M. tuberculosis vengono distinti in:
farmaci di prima linea (streptomicina, isoniazide, etambutolo, rifampicina e
pirazinamide) e
farmaci di seconda linea (fl uorochinoloni, etionamide, amikacina, acido paraaminosalicilico,
capreomicina, kanamicina e cicloserina).
L’ISONIAZIDE (idrazide dell’acido isonicotinico) è altamente efficace contro
M. tuberculosis, e agisce nel processo metabolico che porta alla sintesi degli
acidi micolici. Prima di poter esercitare la sua azione a carico degli enzimi
codificati dai geni inhA e kasA, l’isoniazide deve essere attivata dalla
catalasi del micobatterio (KATG). L’isoniazide è battericida su batteri in
fase di moltiplicazione attiva (lesioni polmonari) e batteriostatica nei batteri a
lenta crescita o persistenti.
La RIFAMPICINA inibisce l’azione dell’RNA polimerasi batterica ed esercita
un azione battericida sia su batteri in rapida crescita che su batteri
persistenti.
49
50
TERAPIA
Prima e Dopo TERAPIA
La PIRAZINAMIDE è un farmaco che deve essere attivato in ambiente
acido per raggiungere la forma attiva, inibisce la sintesi degli acidi grassi
e agisce sulla popolazione batterica presente all’interno dei macrofagi.
L’ETAMBUTOLO interferisce nella sintesi della parete batterica, inibendo
la sintesi degli arabinogalattani. Tale azione, pur essendo di per se
batteriostatica, ha il merito di scompaginare la regolare struttura della
parete, facilitando l’ingresso degli altri farmaci nella cellula, potenziandone
l’effi cacia, riducendo il rischio di comparsa di farmacoresistenze.
51
52
13

DOTS Directed Observed Therapy Short-course
Il protocollo terapeutico suggerito dall’OMS prende il nome di DOTS e
consiste nell’assunzione simultanea di:
3 farmaci (isoniazide, pirazinamide e rifampicina) per i primi 2 mesi
2 farmaci (isoniazide e rifampicina) per i restanti quattro mesi.
Il trattamento con più farmaci contemporaneamente si rende necessario per
evitare la selezione di resistenze nel corso della terapia.
È stato calcolato, ad esempio, che la frequenza di mutanti primari è di circa
1 ogni 10 5 per l’isoniazide, 1 ogni 10 6 per la streptomicina e 1 ogni 10 7 per la
rifampicina.
La lenta crescita del micobatterio e i lunghi periodi di trattamento fanno sì
che la comparsa di resistenze ai singoli farmaci sarebbe frequente nel caso
di terapia con un singolo antibiotico. Viceversa, poiché la probabilità di
resistenza ai farmaci è moltiplicativa, l’utilizzo di più farmaci fa sì che la
frequenza passi da 10 -5 nel caso dell’isoniazide a 10 -18 nel caso di
somministrazione con i suddetti tre farmaci contemporaneamente.
ottobre 2007 e marzo 2008
missione in ECUADOR:
la tubercolosi
53
54
L'esame colturale su terreno solido (tecnica già disponibile ai
tempi di R. Koch) è l'unica tecnica diagnostica attualmente
disponibile nei Paesi in via di sviluppo
Terreno
(‏LJ‏)‏ SOLIDO
Terreno LIQUIDO
(‏Bactec‏)‏
Terreno LIQUIDO
(‏MGIT‏)‏
Biologia molecolare
(‏COSTI 55 EVOLUZIONE TECNICHE (e aumento 56
14

MODS: MICROSCOPIC-OBSERVATION DRUG-SUSCEPTIBILITY
October 12, 2006, New England Journal of Medicine:
“…è più sensibile, rapido ed economico da eseguire degli attuali
test disponibili.”
GENERALITÀ
Tecnica messa a punto presso la Universidad Cayetano Heredia
di Lima, Perú.
Si basa su due caratteristiche ben conosciute dei micobatteri:
M. tuberculosis cresce più rapidamente in terreno líquido che nel
solido
“Aggregati ” caratterístici di M. tuberculosis possono essere visti con
il microscopio invertito osservando il terreno liquido
www.modsperu.org
The philosophy underlying MODS is laboratory freeware: all the
components are readily available from laboratory suppliers; there are no
hidden, patented secrets.
57
58
STRUMENTI O REATTIVI
RISULTATI
terreno Middlebrook 7H9
(< 1 $ / campione)
microscopio invertito (1500 – 3000 $)
Presenza o assenza di M. tuberculosis nel campione
Sensibilità/resistenza a rifampicina
Sensibilità/resistenza a isoniazide
in 10-15 giorni!
Moore DAJ et al. Microscopic-observation drug-susceptibility assay for the diagnosis of TB.
New Eng J Med 355: 1539–1551, 2006
59
60
15

NaOH-
NALC
Vortex and
stand for 15
minutes
PBS
Fill tube
to 14ml
Centrifuge
15 min 3000g
7H9
PANTA
OADC
sample 1 sample 2 Negative QC sample 3 sample 4 sample 5 or
Positive QC
Sputum decontamination
900µl / well
C
C C
C C
1 3 4
C
MODS
1 2 NEG 3 4 5 / POS
control
control
C
C
C
C
C
C
Culture and
direct
susceptibility
testing
Drug-free
Isoniazid
Rifampici
I
R
I
R
I
R
I
R
I
R
I
R
2 wells for drug-free control (C), 1 for isoniazid 0.4 µg/ml (I), 1 for rifampicin 1 µg/ml (R)
Istituto di Microbiologia - Genova
61
62
Moore DAJ et al. Microscopic-observation drug-susceptibility assay for the diagnosis of TB. New Eng J Med 355: 1539–1551, 2006
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64
16

65 66
Istituto di Microbiologia - Genova
Laboratorio del Hospital Alli Causai
67
Laboratorio del Hospital Alli Causai
68
17

COSTI
Caviedes L, et al. Rapid, efficient detection and drug susceptibility testing of Mycobacterium
tuberculosis in sputum by microscopic observation of broth cultures. The Tuberculosis Working
69
Group in Peru. J Clin Microbiol. 2000 Mar;38(3):1203-8
Laboratorio del Hospital Alli Causai
70
ABSTRACT
A collaborative project was established between the Alli Causai
Foundation in Ambato, Ecuador, and the University of Genova,
Italy, to introduce the microscopic observation drug susceptibility
(MODS) assay for the rapid identification of Mycobacterium
tuberculosis in Ecuador.
A total of 507 samples were evaluated during a 10-month
period, and DNA was extracted from each isolate and sent to
Genova for confirmatory molecular analysis.
M. tuberculosis was identified in 45 samples by MODS, and drug
resistance was observed in approximately 21% of the isolates,
with four multidrug-resistant strains detected in two patients.
71 72
18

73 74
TERAPIA: RESISTENZE
A seconda dei risultati del test di sensibilità ai farmaci eseguito sul ceppo
isolato o a seconda della tollerabilità del farmaco da parte del paziente, la
combinazione di farmaci può essere modificata e/o integrata. Per una
corretta ed efficace terapia è fondamentale seguire correttamente la terapia
antibiotica.
Negli ultimi anni si è assistito alla comparsa di
ceppi MDR-TB (Multi-Drug Resistant TB) che sono ceppi di M. tuberculosis
resistenti a isoniazide e rifampicina e più recentemente di
ceppi XDR-TB (Extensively Drug Resistant TB), che sono ceppi resistenti alla
rifampicina e all’isoniazide, ma anche a tutti i fluorochinoloni e ad almeno uno dei
tre seguenti farmaci iniettabili: capreomicina, kanamicina e amikacina.
Epidemie veicolate da tali ceppi sono state osservate in Sud-Africa e nei
Paesi dell’Est Europa, e sono stati isolati anche in Europa e in Italia. La
mortalità in pazienti infettati con tali ceppi è molto maggiore rispetto ai
ceppi sensibili, per l’inefficacia dei trattamenti terapeutici disponibili.
La comparsa di epidemie veicolate da questi ceppi rende ancora più urgente
lo sviluppo di nuovi farmaci contro M. tuberculosis. La maggior parte dei
farmaci in uso sono stati sviluppati oltre quarant’anni fa, e le poche molecole
attive identificate di recente stentano ad essere inserite nei regimi
75 76
terapeutici.
19

MYCOBACTERIUM LEPRAE
Mycobacterium leprae è l’agente eziologico della lebbra o malattia
di Hansen.
Si stima che nel mondo siano 1-2 milioni le persone con disabilità
ascrivibile all’infezione da M. leprae.
Nel 2006 i casi di lebbra conclamata sono stati circa 220 000, la
maggior parte dei quali sono stati registrati in India, Brasile e Africa
centrale.
M. leprae è un bacillo AAR che cresce nei macrofagi, cellule neurali,
nella zona plantare di topi atimici e nell’armadillo.
Non è mai stato coltivato in terreno di coltura e viene considerato un
patogeno intracellulare obbligato.
Si ritiene che il tempo di replicazione (stimato in circa 12-14 giorni)
sia responsabile del lungo tempo di incubazione e della necessità di
adottare lunghi trattamenti terapeutici.
77
MYCOBACTERIUM LEPRAE
Il completamento della sequenza del genoma di M. leprae ha permesso di
comprendere meglio alcuni aspetti della biologia di questo importante
micobatterio.
Il genoma di M. leprae è di circa 3 268 203 bp (circa 75% di quello di M.
tuberculosis), ma i geni codificati sono soltanto 1606 (40% di M.
tuberculosis).
Nel genoma di M. leprae sono stati individuati oltre 1100 pseudogeni (geni
con inserzioni, delezioni o comunque non codificanti per proteine) e questo
numero è assolutamente incoerente con quanto trovato finora nel genoma
non solo di altri micobatteri ma anche di altri batteri.
Si ritiene che M. leprae abbia subito durante l’evoluzione un processo di
decadimento genico che ha determinato l’inattivazione della maggior parte
del corredo genico.
La lebbra raramente uccide il paziente, ma risulta essere fortemente
invalidante per i danni prodotti agli arti e altri tessuti periferici. La lebbra è
una infezione granulomatosa cronica e lentamente progressiva che
coinvolge la pelle e i tessuti nervosi periferici. È stato infatti dimostrato
come M. lepre presenti un particolare tropismo per i nervi periferici.
78
MYCOBACTERIUM LEPRAE
L’infezione è generalmente limitata alle parte più fredde dell’organismo (pelle,
naso, tratto respiratorio superiore). Generalmente gli organi interni quali cervello,
fegato, milza, reni e ossa, non risultano essere coinvolti. Si è solito distinguere due
tipi di lebbra:
lebbra lepromatosa. È caratterizzata da una scarsa risposta immunitaria dell’ospite
che non è in grado di controllare la replicazione del bacillo. In questi casi l’analisi
microscopica dei tessuti evidenzia la presenza di numerosissimi batteri AAR (forma
multibacillare). È questa la forma altamente contagiosa di lebbra, fortemente invalidante e
che richiede prolungati trattamenti terapeutici (> 2 anni).
lebbra tubercoloide. È caratterizzata da una buona risposta immunitaria, dalla presenza
di pochi batteri AAR nei tessuti, e da un modesto danno tissutale. Non è contagiosa e il
trattamento si conclude normalmente entro 6 mesi di terapia.
Possono comunque presentarsi forme di lebbra intermedie.
La diagnosi si effettua generalmente su base clinica e può essere confermata dalla
presenza nel reperto microscopico di bacilli acido-alcol resistenti.
Il trattamento farmacologico si basa sull’utilizzo di dapsone, clofazimina e
rifampicina, somministrati da soli od in combinazione a seconda del quadro clinico.
79
ALTRI MICOBATTERI
La maggior parte dei micobatteri sono batteri ambientali o saprofiti e possono essere
isolati normalmente dal suolo o dall’acqua. Alcuni di questi micobatteri possono
causare importanti patologie nell’ospite umano, in particolare nel soggetto
immunocompromesso.
Chiamati micobatteri atipici, opportunisti o anonimi, oggi si identificano quali Non-
Tuberculous Mycobacteria (NTM) o Mycobacteria Other Than Tuberculosis
(MOTT).
Possono causare infezioni croniche a livello polmonare simili a quelli causate da M.
tuberculosis nel soggetto adulto; linfoadeniti localizzate nei bambini; infezioni della
cute e dei tessuti molli; infezioni disseminate.
Negli anni 80-90 del secolo scorso abbiamo assistito a un emergere di infezioni
disseminate in soggetti con AIDS. La riduzione del numero di linfociti T CD4
circolanti determinava una incapacità dei macrofagi di attivarsi e di esercitare una effi
cace azione antimicobatterica, che aveva come risultato la comparsa di infezioni
disseminate. Tra le specie più frequentemente associate a tali infezioni ritroviamo
Mycobacterium avium intracellulare complex, sebbene molti altre specie siano
state isolate. Negli ultimi anni, l’introduzione di più efficaci terapie anti-retrovirali ha
reso molto meno frequenti questo tipo di infezioni.
I MOTT hanno un genoma più grande rispetto ai micobatteri patogeni come M.
tuberculosis, ma conservano la loro capacità di resistere e moltiplicarsi all’interno dei
macrofagi e/o delle cellule dell’ospite come principale meccanismo di patogenesi.
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