Applicazioni Real-Time PCR - Bgbunict.it

Metodi e tecniche di laboratorio II. Genomica
APPLICAZIONI DELLA REAL-TIME PCR

Diabetes
and “AM”
Project
workflow

Results
Transcriptomics “at a glance”
33 of the 92 (36% 36%) AM genes analyzed showed
a significant variation (> 3 folds) of their
expression with respect to controls in at least
one time point either in both αTC1 and βTC1 or
in only one of them;
a more consistent induction of the AM in βTC1
(27 genes altered in at least one TP) than in
αTC1 (17 gene).

Mutation detection kits
DxS TheraScreen®: K-RAS Mutation Kit (Roche)
DxS TheraScreen®: K-RAS Mutation Kit
(in breve, il kit K-RAS) è un test diagnostico in vitro che consente di
identificare sette mutazioni somatiche nell'oncogene K-RAS e di
eseguire una valutazione qualitativa dello stato mutazionale. Deve
essere utilizzato in ambiente di laboratorio su campioni di DNA estratti
da tessuto colorettale fissato in formalina e incluso in paraffina.
http://www.progettokopernico.it/it/kop-terpers/kopkras/detail/0/185/365/approfondire-il-test-dikras.html?c=1

Spesso nei carcinomi umani vengono riscontrate mutazioni dell'oncogene
K-RAS. La presenza di tali mutazioni è correlata all'assenza di una
risposta a determinate terapie antitumorali basate sugli inibitori del
recettore del fattore di crescita epidermico (terapie anti-EGFR) nei
pazienti con carcinoma colorettale metastatico.

È possibile identificare sette mutazioni nel gene K-RAS su uno sfondo di
DNA genomico wild-type utilizzando un saggio PCR real-time basato sulla
tecnologia DxS Scorpions®. Si tratta di un metodo estremamente selettivo.
Se il numero di copie di DNA è sufficiente, è possibile determinare circa
l'1% dei mutanti su uno sfondo di DNA genomico wild-type
type.

Il kit K-RAS è in grado di identificare sette mutazioni K-RAS
nei codoni 12 e 13 dell'oncogene K-RAS
Il kit K-RAS utilizza i saggi PCR real-time
associando due diverse tecnologie: ARMS® e Scorpions®.

La tecnologia ARMS (Amplification Refractory Mutation System) supporta
l'amplificazione di specifici alleli o mutazioni.
La Taq DNA polimerasi è estremamente efficace per distinguere tra un
appaiamento corretto e un appaiamento errato all'estremità in 3’ di un
primer per PCR. È possibile eseguire un'amplificazione selettiva di
specifiche sequenze mutate anche in campioni in cui le sequenze non
mutate sono la maggioranza, in quanto:
• Quando il primer è perfettamente appaiato, l'amplificazione procede
con la massima efficienza.
• Quando la base in 3’ presenta un appaiamento errato, si osserva
soltanto un'amplificazione di basso livello sullo sfondo.

La ARMS (Amplification
Refractory Mutation System) PCR è un sistema per
identificare mutazioni. Essenzialmente si fanno due PCR in parallelo, una con un
primer specifico per l'allele normale e l'altra per quello mutato; il secondo
primer è uguale per entrambe. I primer sono fatti, ovviamente, per legarsi solo
alla variante allelica di interesse, in modo da non legarsi con l'altra. A questo
punto puoi avere 3 casi (supposto che la reazione 1 sia con l'allele normale e la
2 con il mutato): 1) amplifico in 1 ma non in 2 -> omozigote wt
2) amplifico in 2 ma non in 1 -> omozigote mutato
3) amplifico in 1 e in 2 -> eterozigote

La tecnologia Scorpions consente di identificare il risultato
dell'amplificazione. Il termine Scorpions è utilizzato per descrivere
molecole a doppia funzione che contengono un primer per PCR legato
covalentemente a una sonda. Il fluoroforo in questa sonda
interagisce con un colorante quencher, anch'esso incorporato nella
sonda, che sopprime la fluorescenza. Quando si verifica una
reazione PCR e la sonda si lega all'amplicon, il fluoroforo e il
quencher si separano, determinando un aumento della fluorescenza
proveniente dalla provetta della reazione.
http://www.biosearchtech.com/support/applications/real-time-pcrprobe-animation-video

Analisi dei dati: metodo ∆Ct
Nei saggi real-time
Scorpions, il numero di cicli di PCR necessari per
rilevare un segnale fluorescente al di sopra del segnale dello sfondo è il
parametro con cui vengono misurate le molecole bersaglio presenti
all'inizio della reazione. Per conoscere i valori ∆Ct dei campioni si
calcola la differenza tra il valore Ct del saggio di mutazione e il valore
Ct del saggio di controllo per lo stesso campione. I campioni vengono
classificati come positivi alla mutazione se restituiscono un valore ∆Ct
inferiore al valore ∆Ct 1% per il saggio.

Il kit K-RAS contiene otto saggi.
• Un saggio di controllo.
• Sette saggi di mutazione.
Tutte le miscele di reazione contengono un saggio di controllo esogeno, o
controllo interno, marcato con HEX (rilevato dal colorante JOE nel sistema
ABI7900). In questo modo viene monitorata la presenza di eventuali
inibitori, che potrebbero indurre risultati falsi negativi. Il saggio di controllo,
marcato con FAM, serve per ottenere una valutazione del DNA totale in un
campione. Il saggio di controllo amplifica una regione
dell'esone 4 del gene K-RAS.

Ogni saggio di mutazione, marcato con FAM, contiene una molecola
Scorpion e un primer ARMS che consentono di distinguere il DNA wildtype
dall'eventuale DNA mutante rilevato con il saggio PCR real-time.

Protocollo per la valutazione dei campioni
La miscela del saggio di controllo in eccedenza, fornita nel kit K-RAS,
deve essere obbligatoriamente utilizzata per eseguire la valutazione del
DNA totale nei campioni. Il saggio di controllo amplifica una regione
dell'esone 4 del gene K-RAS. Preparare i campioni soltanto con il saggio di
controllo, utilizzando la miscela standard come controllo positivo e l'acqua
come controllo privo di templato. Notare che, per un uso ottimale dei
reagenti del kit K-RAS, è opportuno raggruppare i campioni in batch. I
controlli devono essere inclusi in tutte le sedute analitiche. Se si
analizzano i campioni uno ad uno, il consumo di reagenti aumenta e, di
conseguenza, il numero di campioni che è possibile analizzare con il kit K-
RAS diminuisce.

Aggiungere immediatamente 5 µl di campione, miscela standard o
acqua (per i controlli senza templato) nei pozzetti di reazione.

Per ‘Assay’ selezionare ‘Standard Curve (Absolute Quantification)’. Per
‘Run Mode’ selezionare ‘Standard 7900’.
Selezionare il pulsante ‘Next’ per visualizzare una schermata in cui è
possibile impostare i rilevatori. Aggiungere all'elenco un rilevatore FAM
e un rilevatore JOE, senza impostare i soppressori (Quenchers =‘none’).
Impostare ‘Passive Reference’ su ‘None’ e selezionare il pulsante ‘Next’.
Selezionare l'intera piastra e attivare le caselle relative ai rilevatori FAM
e JOE, in modo da garantire che siano monitorati entrambi i coloranti in
ogni pozzetto. Selezionare il pulsante ‘Finish’.

ABI 7900

Interpretazione della valutazione dei campioni
Valutare i valori Ct del controllo NTC per verificare che non vi siano
contaminazioni in grado di indurre un'amplificazione positiva nel canale
FAM (Ct < 40) o una reazione fallita del controllo esogeno nel canale HEX
(nessun valore Ct), che indicherebbero un problema di impostazione. La
miscela standard dovrebbe generare un Ct del saggio di controllo (canale
FAM) compreso tra 26 e 29 sullo strumento ABI7900. Scartare i dati se uno di
questi 2 controlli della seduta fallisce.

Ct del saggio di controllo tra 29 e 35: interpretare i dati con cautela, poiché
le mutazioni di livello molto basso potrebbero non essere rilevate.
Ct del saggio di controllo tra 35 e 38: nei campioni sono presenti poche
copie di DNA amplificabile, mentre le mutazioni possono essere osservate
più facilmente quando la maggior parte delle copie è mutata.
Ct del saggio di controllo ≥ 38: respingere il campione, poiché il DNA è
insufficiente e il kit K-RAS non sarà in grado di rilevare le mutazioni.

Analisi dei campioni con lo strumento ABI 7900HT
1. Assicurarsi che il riferimento passivo sia impostato su ‘none’ nella
schermata di ispezione dei pozzetti.
2. Verificare che ogni pozzetto generi un segnale JOE dal saggio di
controllo esogeno.
a. Se il saggio di controllo esogeno genera un risultato positivo,
proseguire con l'analisi.
b. Se il saggio di controllo esogeno ha fallito ma la reazione FAM ha
prodotto un'amplificazione forte, proseguire con l'analisi perché la
causa del fallimento è stata l'attività competitiva della reazione FAM
nei confronti della reazione del controllo esogeno.
c. Se hanno fallito entrambe le reazioni (FAM e controllo esogeno), è
necessario scartare i dati per la possibile presenza di inibitori che
possono indurre risultati falsi negativi.

3. Nella scheda ‘Amplification Plot’ selezionare tutti i pozzetti in uso e
quindi selezionare il colorante FAM nell'elenco dei rilevatori. Utilizzare
l'impostazione della linea di base automatica e il valore Ct manuale,
quindi impostare la soglia manualmente al centro della fase esponenziale
utilizzando la scala logaritmica per l'asse Y, come descritto nella
guida dell'utente dello strumento ABI 7900.
4. Analizzare i dati e calcolare il valore ∆Ct nel seguente modo:
∆Ct = [Ct
saggio di mutazione campione] – [Ct
saggio di controllo
campione]

1. Valori Ct di controllo:
1.1. il valore Ct di controllo deve essere ≥ 24 per evitare un
sovraccarico del saggio.
1.2. Ct controllo < 29: il kit K-RAS è in grado di rilevare una mutazione
minima, fino all'1%, in questi campioni.
1.3. Nei campioni con Ct di controllo ≥ 29, il kit non sarà in grado di
rilevare una mutazione dell'1%, perché troppo bassa, tuttavia sarà
in grado di rilevare mutazioni di livello più alto.
1.4. Ct di controllo ≥ 35: nel campione sono presenti solo poche copie
di DNA amplificabile, mentre è più probabile osservare le mutazioni
se la maggior parte delle copie è mutata.
1.5. Ct di controllo ≥ 38: il DNA è insufficiente e i dati non dovranno
essere utilizzati.

2. Valori ∆Ct della miscela standard
2.1. I valori ∆Ct della miscela standard dovrebbero
corrispondere a quelli riportati in Tabella (± 2):
La miscela std. è un insieme di frammenti di DNA artificiali, rappresentatitvi
dell’Ex 4 di K-RAS e dei 7 diversi tratti genomici di K-RAS mutati. Pertanto, in
base ai valori descritti in Tabella, costituisce un ulteriore controllo di reazione!

3. Valori ∆Ct del campione:
3.1. Se il valore ∆Ct del campione è superiore al valore 1% (come
riportato nella Tabella precedente), il campione di DNA viene classificato
come negativo alla mutazione o al di sotto dei limiti di sensibilità del
kit K-RAS.
3.2. Se il valore ∆Ct del campione è inferiore al valore 1%, il campione
di DNA viene classificato come positivo alla mutazione.
3.3. Valori Ct di mutazione maggiori di o uguali a 38 dovranno essere
considerati negativi o al di sotto dei limiti di sensibilità del kit.

ABI7900

Mutation detection kits:
Allelic discrimination (Applied
Biosystems)
Definition: An Allelic Discrimination (AD) assay is a multiplexed (more than one
primer/probe per reaction), end-point (data is collected at the end of the PCR
process) assay that detects variants of a single nucleic acid sequence.
The presence of two primer/probe pairs in each reaction allows genotyping of
the two possible variants at the single-nucleic polymorphism (SNP) site in a
target template sequence.

The actual quantity of target sequence is not determined. For each
sample in an AD assay, a unique pair of fluorescent dye detectors is
used, for example, two TaqMan® MGB probes that target an SNP site.
One fluorescent dye detector is a perfect match to the wild type (allele
1) and the other fluorescent dye detector is a perfect match to the
mutation (allele 2). The Allelic Discrimination assay classifies unknown
samples as:
• Homozygotes (samples having only allele 1 or allele 2)
• Heterozygotes (samples having both allele 1 and allele 2)

WT probe
Mutant probe

About AD Experiments AD Experiment Workflow
After you design the experiment and isolate DNA, an AD experiment involves
performing:
• A pre-read run on an AD plate document to determine the baseline
fluorescence associated with primers and probes before amplification.
• An amplification run using an AQ plate document to generate real-time PCR
data, which can be used to analyze and troubleshoot the PCR data for the AD
experiment, if needed.
• A post-read run using the original AD plate document. The post-read run
automatically subtracts the baseline fluorescence determined during the pre-read
run, then assigns allele calls (automatically or manually) using the amplified data.

Workflow of the complete process

Quality of DNA Ensure that the DNA you use for the AD experiments:
• Is extracted from the raw material you are testing with an optimized
protocol
• Does not contain PCR inhibitors
• Has an A260/280 ratio greater than 1.7
• Is intact as visualized by gel electrophoresis
• Has not been heated above 60 °C; heat can cause degradation

A reaction plate contains the following for an AD assay:
• No Template Controls (NTCs)
• Known genomic DNA controls (optional, not included in example
experiment)
• Unknown genomic DNA samples

Preparing the Plate
1. Invert the reaction mix tube prepared in the
previous section.
2. Centrifuge the tube briefly to spin down the
contents and to eliminate air bubbles.
3. Pipette 13.75 µL of reaction mix into each well
in a 96-well reaction plate.
4. Dilute 1 to 20 ng of each purified genomic DNA
sample into nuclease-free water for a total
sample volume of 11.25 µL.
5. Pipette 11.25 µL of the following solutions into
the indicated wells:

Creating an Allelic Discrimination (AD) Plate Document
An AD plate document stores data collected from an AD run for a single
reaction plate. An AD plate document also stores other information about the
run, including sample names, markers, and detectors.

AD plate documents use:
• Detector – In SDS software, a virtual representation of a TaqMan® probe
and primer set and associated fluorescent dye that detects a single target
nucleic acid sequence.
• Markers – A set of two detectors that discriminate between different alleles
of a common locus. Allele 1 is detected by one detector (for example, FAM dye),
and allele 2 is detected by the second detector (for example, VIC® dye).
• Task – A setting that you apply to the markers in a well of a plate document
and that determines the way the SDS software uses the data collected from the
well during analysis.

AD plate document markers use two types of tasks:
– Unknown – Applied to markers of wells that contain PCR reagents
for the amplification of target sequences. The SDS software indicates
unknown targets with a U.
– No Template Control – Applied to markers of wells that contain no
target template. The SDS software indicates no template controls by an
NTC.
Exercise through
SDS v. 2.3 software

1) Performing the Pre-Read Run
2) Performing the Amplification Run
3) Performing the Post-Read Run

Amplification
Run

Evaluating Results
After identifying the dye components, the SDS software determines the
contribution of each dye in the raw data using the multicomponent
algorithm. Cluster Variations: The SDS software plots the results of the
allelic discrimination run on a scatter plot of Allele X versus Allele Y. Each
well of the 96-well reaction plate is represented with an (Undetermined) on
the plot. The clustering of points can vary along the horizontal axis (Allele X),
vertical axis (Allele Y), or diagonal (Allele X/Allele Y). This variation is due to
differences in the extent of reporter dye fluorescent intensity after PCR
amplification.

Allelic Discrimination Plot