Attività enzimatiche dei batteri lattici isolati da impasti acidi per la ...

mmol/L di fosfato di sodio, pH 6,8) è stata determinata utilizzando il metododel TNBS (Adler-Nissen, 1979). Una curva di taratura è stata preparatautilizzando la glicina (Gly, Sigma), come standard (range 0,0 - 0,5 mmol/Ldi Gly) e risultati sono stati espressi come mg di Gly/kg di impasto.3.2.3. Attività peptidasicaLe cellule cresciute in fase stazionaria in MRS liquido sono state raccoltemediante centrifugazione (12000 x g, 5 min), lavate due volte con tamponepotassio fosfato sterile 50 mmol/L, pH 7, e ri-sospese nello stesso tamponeper ottenere una sospensione cellulare standardizzata (DO 650= 1) dautilizzare per il dosaggio degli enzimi. Le attività delle aminopeptidasigenerali (PepNC), prolina iminopeptidasi (Pepi), glutamil aminopeptidasi(Pepa) e X-prolil dipeptidil aminopeptidasi (PepX) sono state misurate,in accordo con Macedo et al. (2000), utilizzando come substrati sinteticiLys-p-nitroanilide (-p-NA), Pro-p-NA, Glu-p-NA e Gly-Pro-p-NA o Arg-Pro-p-NA, rispettivamente. Per il dosaggio sono stati mescolati 30 μL disubstrato ad una concentrazione finale di 20 mmol/L in metanolo, 195 μLdi tampone potassio fosfato (50 mmol/L, pH 7,0), 95 μL di sodio azide0,05% (w/v) e 75 μL di sospensione cellulare. Dopo l’incubazione a 30°Cper 4 ore, la reazione è stata interrotta con 900 μL di acido acetico al 10%(v/v); il rilascio di p-nitroanilina (p-NA) nei surnatanti (12000 x g, 5 min)è stata misurata spettrofotometricamente a 410 nm. I dati ottenuti sonostati confrontati con una curva di taratura costruita utilizzando soluzionidi p-NA (range 0,1 - 20,0 mmol/L p-NA). Una unità di attività enzimatica(μkatal) è stata definita come la quantità di enzima necessario per liberare1 μmol di p-NA per secondo.3.2.4. Screening per l’attività ureasicaL’attività ureasica è stata determinata valutando qualitativamente ilrilascio di ammoniaca utilizzando un metodo basato sul viraggio del rossofenolo (Mora et al., 2004). I ceppi sono stati coltivati in MRS liquidocontenente 5 g/L di urea (concentrazione finale) e 0,05 g/L di nichel solfato(concentrazione finale). Le cellule, raccolte mediante centrifugazione(12000 x g, 5 min), sono state lavate due volte con una soluzionesalina sterile (0,85% w/v di NaCl) e ri-sospese in 100 μL di soluzionefisiologica sterile. Per il dosaggio enzimatico sono stati mescolati 10058