AttivitÃ enzimatiche dei batteri lattici isolati da impasti acidi per la ...

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mmol/L di fosfato di sodio, pH 6,8) è stata determinata utilizzando il metododel TNBS (Adler-Nissen, 1979). Una curva di taratura è stata preparatautilizzando la glicina (Gly, Sigma), come standard (range 0,0 - 0,5 mmol/Ldi Gly) e risultati sono stati espressi come mg di Gly/kg di impasto.3.2.3. Attività peptidasicaLe cellule cresciute in fase stazionaria in MRS liquido sono state raccoltemediante centrifugazione (12000 x g, 5 min), lavate due volte con tamponepotassio fosfato sterile 50 mmol/L, pH 7, e ri-sospese nello stesso tamponeper ottenere una sospensione cellulare standardizzata (DO 650= 1) dautilizzare per il dosaggio degli enzimi. Le attività delle aminopeptidasigenerali (PepNC), prolina iminopeptidasi (Pepi), glutamil aminopeptidasi(Pepa) e X-prolil dipeptidil aminopeptidasi (PepX) sono state misurate,in accordo con Macedo et al. (2000), utilizzando come substrati sinteticiLys-p-nitroanilide (-p-NA), Pro-p-NA, Glu-p-NA e Gly-Pro-p-NA o Arg-Pro-p-NA, rispettivamente. Per il dosaggio sono stati mescolati 30 μL disubstrato ad una concentrazione finale di 20 mmol/L in metanolo, 195 μLdi tampone potassio fosfato (50 mmol/L, pH 7,0), 95 μL di sodio azide0,05% (w/v) e 75 μL di sospensione cellulare. Dopo l’incubazione a 30°Cper 4 ore, la reazione è stata interrotta con 900 μL di acido acetico al 10%(v/v); il rilascio di p-nitroanilina (p-NA) nei surnatanti (12000 x g, 5 min)è stata misurata spettrofotometricamente a 410 nm. I dati ottenuti sonostati confrontati con una curva di taratura costruita utilizzando soluzionidi p-NA (range 0,1 - 20,0 mmol/L p-NA). Una unità di attività enzimatica(μkatal) è stata definita come la quantità di enzima necessario per liberare1 μmol di p-NA per secondo.3.2.4. Screening per l’attività ureasicaL’attività ureasica è stata determinata valutando qualitativamente ilrilascio di ammoniaca utilizzando un metodo basato sul viraggio del rossofenolo (Mora et al., 2004). I ceppi sono stati coltivati in MRS liquidocontenente 5 g/L di urea (concentrazione finale) e 0,05 g/L di nichel solfato(concentrazione finale). Le cellule, raccolte mediante centrifugazione(12000 x g, 5 min), sono state lavate due volte con una soluzionesalina sterile (0,85% w/v di NaCl) e ri-sospese in 100 μL di soluzionefisiologica sterile. Per il dosaggio enzimatico sono stati mescolati 10058
μL di sospensione cellulare e 400 μL di una soluzione contenente 1volume di reagente A (2 g di urea disciolta in 2 ml di etanolo e 4 mL diacqua deionizzata sterile) e 19 volumi di reagente B (1 g/L di KH 2PO 4,1 g/L di K 2HPO 4, 5 g/L di NaCl e 20 μg/ml di rosso fenolo). La misceladi reazione è stata incubata a 37°C per 2 ore e lo sviluppo di un colorerosso-violaceo indicava la presenza di attività ureasica.3.2.5. Attività fitasica e fosfatasicaLe cellule cresciute in fase stazionaria in MRS liquido sono stateraccolte mediante centrifugazione (12000 x g, 5 min), lavate due voltecon soluzione salina sterile e ri-sospese in acqua deionizzata sterile perottenere le sospensioni cellulari standardizzate (DO 650= 1) da utilizzareper gli esperimenti. L’attività fitasica è stata misurata utilizzando fitato disodio (Sigma) come substrato. Il dosaggio è stato effettuato mescolando600 μL di substrato (Na-fitato 3 mmol/L in Na-acetato 0,2 mol/L, pH4,0) e 150 μL di sospensione cellulare. Dopo 2 ore di incubazione a45°C, la reazione è stata stoppata con 750 μL di acido tricloroaceticoal 5% (w/v) (De Angelis et al., 2003). Il fosforo inorganico liberato èstato determinato misurato l’assorbanza a 700 nm. Una unità di attivitàfitasica (μkatal) è stata definita come la quantità di enzima necessarioper liberare 1 μmol di fosforo inorganico al secondo.L’attività della fosfatasi acida è stata determinata utilizzando ilp-nitrofenil fosfato (p-NPP) come substrato. La miscela di reazioneconteneva 200 μL 1,5 mmol/L p-NPP (concentrazione finale) in 0,2mol/L di Na-acetato, pH 5,2, e 400 μL di sospensione cellulare. Dopo2 ore di incubazione a 45°C, la reazione è stata stoppata con l’aggiuntadi 600 μL di NaOH 0,1 mol/L e il p-nitrofenolo (p-NP) rilasciato è statodeterminato misurando l’assorbanza a 405 nm sui campioni centrifugati(12000 x g, 5 min). Una unità di attività della fosfatasi (μkatal) è statadefinita come la quantità di enzima necessario per liberare 1 μmol dip-NP al secondo.3.2.6. Attività β-glucosidasicaLe cellule cresciute in fase stazionaria in MRS liquido (1,5 mL) sono stateraccolte mediante centrifugazione (12000 xg, 5 min), lavate due volte inTris-HCl 50 mmol/L, pH 8, e ri-sospese in 150 μL dello stesso tampone59
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