Estudo do papel da proteína induzida por glicocorticóide Anexina ...

Na resolução natural, Boc-1 e anti-AnxA1 foram administrados 24h e 36h após
desafio com LPS com lavado pleural realizado em 48h. Na resolução induzida, 4h após o
desafio com LPS, os camundongos foram tratados com dexametasona, sendo feito tratamento
prévio com Boc-1 ou anti-AnxA1, 15 minutos antes da dexametasona. Após 8h do desafio, foi
realizado o lavado pleural para contagem total e diferencial de células. Como controle para
anti-AnxA1 animais foram injetados com soro não imune de ovelha.
4.3.3 - Tratamento com peptídeo Ac2-26
Para avaliar o papel da AnxA1 no processo de resolução induzida, utilizamos o
peptídeo sintético Ac2-26 que se refere à parte N-terminal da proteína AnxA1, possuindo
atividade biológica comparada à proteína total. O peptídeo Ac2-26 foi diluído em PBS estéril e
administrado 100μg pelas via intraperitonial ou intrapleural. O peptídeo foi cedido pelo Dr.
Mauro Perretti (William Harvey Research Institute, Barts and The London School of Medicine,
Londres, Inglaterra). O tratamento com Ac2-26 foi realizado 4h após desafio com LPS e o
lavado pleural realizado 8h ou 24 h após desafio para contagem total e diferencial de células.
4.3.4 - Tratamento com zVAD-fmk
O tratamento com o pan inibidor de caspases zVAD-fmk (Tocris Bioscience) foi
realizado 15 minutos antes da administração de peptídeo Ac2-26. O zVAD-fmk foi diluído
em 2% de DMSO e PBS estéril e administrado 1 mg/kg, via intraperitonial. O volume total
administrado por animal foi de 200 µL.
4.4 - Análise da apoptose de leucócitos
A apoptose dos leucócitos presentes no lavado pleural dos animais desafiados com LPS,
com ou sem os tratamentos especificados acima, foi avaliada morfológica e bioquimicamente.
Caracterização morfológica da apoptose: As células (5x10 4 ) recuperadas da cavidade
pleural serão cito-centrifugadas, fixadas e coradas com May-Grunwald-Giemsa e contadas
(500 células por lâmina) utilizando microscópio ótico para determinar a porcentagem de
células com morfologia apoptótica.
Caracterização bioquímica da apoptose: Utilizamos análises de western blot para
detecção de proteínas envolvidas com apoptose. Os lisados celulares foram obtidos como
descrito anteriormente, sendo os immunoblots realizados com anticorpo que detecta a ativação
de caspase-3 clivada e Bax.
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