Projeto Genoma do CÃ¢ncer - Biotecnologia

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Figura 4 – Modelo esquemático da vacina de dose única (“singleshot vaccine”) baseada no encapsulamento de antígenos em microesferas de PLGA Rodrigues Júnior (1999). Vários métodos têm sido descritos para a obtenção de microesferas. Dentre eles, o mais utilizado para o encapsulamento de compostos hidrofílicos e também o método de escolha para encapsulamento de antígenos protéicos e DNA, é o método de emulsão múltipla e evaporação do solvente. Trata-se de um método simples, de fácil transposição para escala industrial e cuja realização em condições assépticas garante a esterilidade final do produto. O esquema na figura 5 ilustra o encapsulamento de DNA em microesferas de PLGA. O processo consiste, inicialmente, na formação da emulsão primária do tipo água/óleo. O DNA é dissolvido na fase aquosa e o polímero na fase orgânica cujo solvente consiste normalmente de cloreto de metileno ou acetato de etila. A emulsão primária é então vertida, sob agitação, sobre uma segunda fase aquosa contendo um agente tensoativo (álcool poli vinílico) para formar uma emulsão estável do tipo água/óleo/água. Esta emulsão é mantida sob constante agitação até que o solvente orgânico, volátil, seja completamente eliminado da formulação. A remoção do solvente orgânico faz com que o polímero, insolúvel em água, precipite em torno das gotículas de água da fase aquosa interna resultando na suspensão de microesferas. As partículas são coletadas por centrifugação, lavadas para remover o excesso de tensoativo e liofilizadas. As microesferas poliméricas oferecem ainda vantagens no que concerne à sua estabilidade visto que elas são armazenadas na forma de pó liofilizado a ser reconstituído imediatamente antes da sua utilização. Outra característica fundamental para a adjuvanticidade das microesferas reside no fato de que, após administração parenteral, as partículas menores que 10 µm são fagocitadas pelas células fagocíticas do sistema fagocitário mononuclear, apresentadoras de antígenos. Já as partículas com diâmetro superior a 10 µm seriam responsáveis pela formação do depósito e liberação do antígeno por um período prolongado. Uma vez que o antígeno encontra-se encapsulado no interior das partículas e por isso protegido da ação de enzimas, as microesferas têm sido utilizadas para a estimulação da resposta imune em nível de mucosas. Após administração por via oral, as partículas menores que 5µm são captadas nas placas de Peyer por células M e Figura 5 – Obtenção de microesferas poliméricas contendo DNA pelo método de emulsão múltipla e evaporação do solvente transportadas para o tecido linfóide onde elas encontram células apresentadoras de antígenos. Esta possibilidade de imunização tem como grande vantagem a produção de IgA secretória que funcionaria como uma barreira inicial contra patógenos que invadem o organismo por superfícies mucosas. Recentemente, Jones e colaboradores (1997) demonstraram que o plasmídeo contendo o gene que codifica a enzima luciferase, encapsulado em microesferas de PLGA foi capaz de estimular a resposta imune humoral efetiva após administração oral em camundongos. Pelo exposto, as microesferas poliméricas têm surgido como uma estratégia interessante a ser empregada no processo de vacinação com DNA. A figura 6 ilustra o esquema de ação das vacinas de DNA encapsuladas em microesferas. Desde 1991, o Laboratório de Vacinas Gênicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP, vem desenvolvendo projeto de pesquisa, visando a descoberta de uma nova vacina contra a tuberculose. Os resultados mostraram que a vacina gênica desenvolvida pelo grupo não só tem atividade preventiva contra o estabelecimento da tuberculose experimental como também alta atividade terapêutica contra a doença já estabelecida (Lowrie et al., 1999 ). Em resumo, a vacina de DNA, que codifica o antígeno imunoestimulante hsp65 de Mycobacterium leprae, tem a habilidade de: (I) prevenir o estabelecimento da infecção e da doença; (II) eliminar a infecção causada pelo bacilo da tuberculose e curar casos crônicos da doença disseminada; (III) resolver casos de tuberculose causada por bactérias altamente resistentes aos medicamentos usados no combate à doença; e (IV) impedir a reativação da doença quando os animais são submetidos a uma imunodepressão pelo tratamento com drogas imunossupressoras. Além disso, durante o desenvolvimento do projeto, foram determinados os mecanismos imune efetores responsáveis pelo controle da infecção e da doença assim como iniciados estudos para saber qual a melhor maneira de se administrar as preparações vacinais para conferir maior proteção nos camundongos. Entretanto, para se alcançar tais resultados, foram necessárias 3 injeções, por via intramuscular, de 12 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
técnica de imunocitoquímica (Figura 7). Os dados demonstram que o encapsulamento do DNA em microesferas é capaz de promover a transfecção de células fagocíticas in vitro. Então para avaliar o funcionamento deste sistema in vivo, estão sendo estudados parâmetros imunológicos, em camundongos BALB/c, após a administração da vacina encapsulada em microesferas, por vias e esquemas diversos. Os dados obtidos permitirão o estabelecimento de comparação da administração da vacina empregando-se outras técnicas como injeção intramuscular e bombardeamento de partículas. Agradecimentos: FAPEMIG, FAPESP, CNPq, PRPq/UFMG. Ao Centro de Microscopia Eletrônica do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais pela análise de microscopia eletrônica. Figura 6– Modelo esquemático da ativação da resposta imune pela vacina de DNA encapsulada em microesferas. A) Após administração, as microesferas sâo fagocitadas por células apresentadoras de antígenos. A erosão da matriz e difusão através de poros permite a liberação do DNA encapsulado nas microesferas. B) O plasmídeo liberado penetra então no núcleo da célula hospedeira e inicia a transcrição do RNAm que originará a proteína antigênica. O antígeno presente no citoplasma é então degradado em peptídeos que se ligam a moléculas de MHC de classe I. Após a ligação, o complexo é transportado via Golgi para a superfície celular onde podem ser reconhecidos por linfócitos T citotóxicos. C) O antígeno pode também ser processado por via exógena onde ele é fagocitado e degradado no fagolisossoma. Os peptídeos gerados são então conjugados a moléculas de MHC de Classe II e apresentados na superfície celular podendo ativar linfócitos T auxiliares. Dependendo do tipo de linfócito T auxiliar estimulado, células B podem ser ativadas e a produção de anticorpos específicos induzida. Entretanto as células B podem também sofrer ativação direta do antígeno secretado ou liberado no meio grande quantidade de DNA (50 a 100µg por amimal). Com o objetivo de otimizar a utilização da vacina, possibilitando a redução da quantidade e do número de administrações do DNA, microesferas de PLGA estão sendo empregadas como carreadores do plasmídeo. Para tal, o plasmídeo dissolvido em salina tamponada foi encapsulado em microesferas de PLGA 50:50 utilizando-se o método de emulsão múltipla e evaporação do solvente. Os resultados preliminares mostraram que o plasmídeo mantém-se funcional após o seu encapsulamento em microesferas e que as partículas obtidas apresentam distribuição de diâmetro variando entre 1 e 10µm, essencial para a captura por células fagocíticas. Quando adicionadas a cultura de macrófagos as microesferas são fagocitadas e a expressão da hsp65 por estas células pode ser detectada, 10 e 20 dias após o início do tratamento, utilizando-se a Figura 7– Avaliação da expressão de hsp65 por células J774 transfectadas com o DNA encapsulado em microesferas. As setas indicam as microesferas no interior das células Referências Bibliográficas: Barry M.A. & Johnston S.A. Biological features of genetic immunization. Vaccine, 15(8):788-791, 1997. Davis H.L., Whalen R.G., Demeneix B.A. Direct gene transfer in skeletal muscle in vivo: factors affecting efficiency of transfer and stability of expression. Hum. Gene Ther., 4:151-156, 1993. Jones D.H., Corris S., McDonald S., Clegg J.C.S. and Farrar G.H. Poly(DL-lactide-co-glycolide)-encapsulated plasmid DNA elicits systemic and mucosal antibody responses to encoded protein after oral administration. Vaccine, 15(8):814-817, 1997. Lima K.M. & Rodrigues Júnior J.M. Poly-DLlactide-co-glycolide microspheres as a controlled delivery system. Braz. J. Med. Biol. Res., 32(2): 171- 180, 1999. Lowrie DB, Tascon RE, Bonato VL, Lima VM, Faccioli LH, Stavropolous E., Colston MJ, Hewinson RG, Moelling K, Silva CL. (1999) Therapy tuberculosis in mice by DNA vaccination. Nature 400:269- 271 Preis I, Langer RS (1979) A single-step immunization by sustained antigen release. J Immunol Methods. 28(1-2):193-7. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 13
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