MELANCIA SEM SEMENTES Modelos Animais - Biotecnologia

R$ 5,00ano II • número 9 • julho/agosto de 1999ESPECIALMELANCIA SEM SEMENTESModelos AnimaisGENÉTICA DE CAMUNDONGOSAlgodão ColoridoExtração de DNADoença de ChagasNOVOS CONHECIMENTOS NA PATOGÊNESE DA DOENÇA DE CHAGASBiossegurança e Alimentos Transgênicoswww.biotecnologia.com.br

BIOTECNOLOGIA/KL3

BIOTECNOLOGIA/KL3

Biotecnologia e BiossegurançaENTREVISTAParceria NecessáriaEntrevista concedida aFernanda DinizLucas Tadeu FerreiraJulian Kinderlerer, Diretor Assistente do Instituto de Biotecnologia, Lei e Ética de Sheffield, InglaterraA regulamentação de pesquisas biotecnológicas começou a ser discutida no Reino Unido noinício da década de 70, quando cientistas de vanguarda se depararam com determinados avanços dabiologia que exigiam respostas rápidas quanto a questões de segurança. Em 1975, as técnicas demanipulação genética já eram vistas como instrumentos bastante rápidos e eficientes para promovermaior conhecimento sobre a ação dos genes e, assim, proporcionar benefícios substanciais e, por quenão dizer, imprevisíveis. Por meio de dessas técnicas, os cientistas vislumbravam um horizonte deinúmeras soluções para a agricultura, como, por exemplo, a extensão do ciclo de várias culturas e afixação natural de nitrogênio nas plantas pelo ar; para a área de saúde, a possibilidade de cura dealgumas doenças causadas por deficiências genéticas, como o diabetes e o câncer, entre outros avançosinimagináveis.Assim, o Reino Unido foi uma das primeiras nações;compreendendo Inglaterra, Escócia,Irlanda do Norte e País de Gales, a desenvolver uma estratégia de regulamentação para as pesquisas debiotecnologia. Um documento escrito por Lord Ashby, em 1975, recomendava que as técnicas demanipulação genética deveriam ser permitidas, mas sob rigorosas condições de segurança. Naquelaépoca, só se conseguia modificar microrganismos em laboratório e os riscos e medidas de contenção eprecaução eram analisados sob dois aspectos: o dos cientistas e técnicos que desenvolviam emanipulavam os organismos modificados, e o da população em geral. O meio ambiente, incluindoplantas e animais, não foi considerado naquela ocasião.Hoje, a biotecnologia avançou muito e produtos geneticamente modificados já sãocomercializados em vários países. A biossegurança vem acompanhando essa evolução no mesmo graude complexidade para evitar os riscos inerentes à liberação desses novos organismos. O Reino Unido éum exemplo de país que funciona dessa forma, por ser dotado de uma excelente estrutura defiscalização e acompanhamento das pesquisas, desenvolvimento, comercialização e importação deorganismos geneticamente modificados. Lá, esse trabalho é realizado em conjunto pelos 15 paísesintegrantes da União Européia, que seguem as mesmas diretrizes e procedimentos técnico-científicos debiossegurança.Para falar sobre o desenvolvimento da biotecnologia e da biossegurança no Reino Unido e naUnião Européia, a revista Biotecnologia, Ciência & Desenvolvimento entrevistou, no dia 11 de junhode 1999, na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, localizada em Brasília, o Diretor Assistentedo Instituto de Biotecnologia, Lei e Ética de Sheffield, Inglaterra, Julian Kinderlerer. Ele é tambémprofessor do Departamento de Biologia Molecular e Biotecnologia da Universidade de Sheffield emembro de vários comitês no Reino Unido e na Europa relacionados com a biotecnologia, legislação eética, entre eles os de Biossegurança e Proteção Ambiental da Inglaterra, e vem prestando consultoriasobre esses temas a diversos países, como Brasil, Rússia, África do Sul, Malásia, Tailândia e México,entre outros.4 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

BC&D - O senhor poderia descrever,sucintamente, o estágio atual de desenvolvimentoda biotecnologia agrícolano Reino Unido?Kinderlerer - A agricultura no ReinoUnido é um setor relativamente pequeno,mas muito eficiente. As principaisatividades agropecuárias estão voltadaspara o cultivo do trigo e de hortaliças,como batata, alface e outras, e para acriação de ovelhas e gado. O desenvolvimentoda biotecnologia no Reino Unidoacompanha as tendências da UniãoEuropéia, que, no momento, em funçãoprincipalmente da forte pressão exercidapelos movimentos ambientalistas contráriosaos organismos geneticamentemodificados, tem aprovado poucos produtostransgênicos. As primeiras liberaçõesde OGMs (organismos geneticamentemodificados) no Reino Unidoaconteceram em 1996 e os produtosliberados foram: híbridos de canola comtolerância a herbicida, somente paraprodução de sementes; e soja toleranteao herbicida glifosato, para importação,armazenamento e uso para nutrição animale não para cultivo. Ainda em 1996,houve consentimento, por parte doGoverno, para liberação restrita de canolageneticamente modificada com tolerânciaa herbicida (glufosinate ammonium)para importação de grãos, produçãode ração animal e uso industrial; e demilho resistente a insetos e a herbicida,somente para importação de grãos. Em1997, o Reino Unido recebeu um pedidode importação de milho modificado geneticamentetolerante ao herbicida glifosatosomente para produção de ração enão para cultivo. Esse pedido ainda nãofoi autorizado pelo Governo.BC&D - O senhor poderia explicar osprocedimentos adotados para a comercializaçãode produtos transgênicosno Reino Unido?Kinderlerer - A comercialização de produtostransgênicos no Reino Unido dependede autorização da União Européia.As decisões tomadas pela UniãoEuropéia quanto à comercialização sãoautomaticamente adotadas pelo ReinoUnido e demais países membros. Asliberações são analisadas caso a caso emonitoradas quanto aos efeitos diretos eindiretos ao meio ambiente, e as exigênciaspodem ser ampliadas ou não, deacordo com a União Européia. Se asanálises forem satisfatórias, os produtostransgênicos recebem licença para comercializaçãoe podem ser colocados nomercado sem restrições. Hoje, há poucosprodutos geneticamente modificadossendo comercializados na UniãoEuropéia, entre eles destacam-se milho,cana-de-açúcar e canola. No ReinoUnido, por enquanto, o único produtotransgênico desenvolvido, que está sendocultivado comercialmente, sob fortemonitoramento, é a canola com tolerânciaa herbicida e, dentro em breve,teremos também variedades transgênicasde batata resistentes a viroses, queestão em fase final de desenvolvimento.BC&D - Como a população na Europareage aos produtos transgênicos? Ouseja, o senhor acha que o povo europeuestá preparado para consumiresses produtos?Kinderlerer - A reação da populaçãoeuropéia aos produtos transgênicos émuito negativa. Uma pesquisa realizadano início do mês de junho deste anomostrou que menos de 1% da populaçãoaceita os transgênicos. A oposição aosprodutos geneticamente modificados naEuropa é extremamente forte. Os gruposambientalistas mais expressivos, especialmenteo “Greenpeace”, o “Friendsof the Earth” e a Sociedade de Proteçãodos Pássaros, entre outros, além deórgãos de defesa do consumidor, enfatizambastante, através dos veículos decomunicação, que os transgênicos podemvir a causar malefícios à saúdehumana e ao meio ambiente. A populaçãotorna-se presa fácil desses grupospelo desconhecimento generalizado daciência e dos seus benefícios. Isso, nofundo, é uma grande irresponsabilidadeda mídia por conceder espaço a essesgrupos que contestam os transgênicospor questões puramente ideológicas,sem nenhum embasamento técnico-científico.Eu acho que os jornalistas têmobrigação de apurar melhor os fatospara não divulgar notícias distorcidas,especialmente relacionadas à saúde ealimentação para não causar pânico edesinformação na população. E maisainda: os cientistas não estão agindo demaneira enfática, através da mídia, paramostrar à opinião pública a realidade eos avanços das pesquisas biotecnológicas.Diante dessa situação, o ParlamentoInglês tem- se esforçado no sentido dedivulgar documentos técnicos sobre ostransgênicos, através da mídia, com oobjetivo de mostrar à população osbenefícios que os transgênicos podemproporcionar.BC&D - A União Européia tem realizadocampanhas de esclarecimentoda população em relação aos transgênicos?Kinderlerer - Como eu já disse anteriormente,nós estamos tendo sérios problemasna Europa, especialmente emfunção do movimento das organizaçõesnão-governamentais contrárias aos transgênicos.As campanhas de esclarecimentodevem ser conduzidas por instituiçõesde pesquisa e empresas quedesenvolvem produtos transgênicos, quesão, a rigor, os primeiros interessados.Os cientistas precisam ser mais enfáticosao mostrar os benefícios que podem vira ser gerados pelos transgênicos; e maisdo que isso: provar que eles são equivalentesaos produtos convencionais, sóque ainda muito mais monitorados eavaliados até chegarem ao consumidor.Além disso, não há 100% de segurançaem nenhum produto alimentar, seja eleconvencional ou transgênico. Se meperguntarem, por exemplo, se é segurocomer bife e batatas, eu vou responderque, possivelmente, não. Porque entre10 mil ou mais, que são seguros, podeexistir pelo menos um que não seja,devido a contaminações ou a outrosfatores que a mídia aponta com freqüência,aliás.BC&D - Que tipo de controle o ReinoUnido exerce sobre as pesquisas eprodução de organismos geneticamentemodificados?Kinderlerer - Em nível de pesquisas,nós temos um conjunto de leis e várioscomitês consultivos que assessoram oGoverno na regulamentação e fiscalizaçãodos transgênicos, de acordo com oBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento 5

nível de segurança biológica exigido.Para os organismos geneticamente modificadosde menor risco, com amplohistórico documentado de utilização segurae sem registros de efeitos negativospara o meio ambiente, podemos trabalharlivremente, seguindo, obviamente,os procedimentos de segurança básicospara qualquer manipulação em laboratório.Mas, para desenvolver pesquisascom organismos de maior risco, precisamospedir permissão antes mesmo deiniciarmos os trabalhos em laboratórios.Essa permissão é solicitada ao ComitêConsultivo de Modificação Genética (“AdvisoryCommittee on Genetic Modification”-ACGM), que assessora o Departamentode Saúde e Segurança na aprovaçãoe liberação de organismos geneticamentemodificados. Esse Departamentotem total autonomia e poder de políciapara impedir qualquer desobediência àlegislação pertinente. Os técnicos doGoverno podem ainda auditar a qualquermomento as instituições para verificarse as pesquisas estão sendo realizadasde acordo com a lei, independentede serem transgênicos ou não. Emtermos de liberação no campo, o processoé muito semelhante ao do Brasil. AEmbrapa, por exemplo, quando querrealizar testes de campo com produtostransgênicos, tem que ter autorizaçãoprévia da Comissão Técnica Nacional deBiossegurança (CTNBio) do Ministérioda Ciência e Tecnologia. No ReinoUnido, o processo é o mesmo: as instituiçõesinteressadas também têm queobter permissão do Comitê Consultivoem Liberações no Meio Ambiente (“AdvisoryCommittee on Release into theEnvironment - ACRE) e a fiscalização éfeita por técnicos designados pelo Departamentode Saúde e Segurança. Resumindo:a regulamentação das pesquisasque envolvem organismos geneticamentemodificados está dividida em trêsníveis: em primeiro lugar, estão os procedimentospara as pesquisas dentrodos laboratórios; em segundo, para asliberações no campo; e, em terceiro,para o cultivo comercial e consumo deprodutos transgênicos. Essa terceiraetapa depende da aprovação de umoutro órgão: o Comitê de Análise deNovos Produtos e Processos Alimentares( “Advisory Committee on NovelFoods and Processes” - ACNFP), queassessora o Ministério da Agricultura,Pesca e Alimentação e a Secretaria deEstado da Saúde e suas Aplicações naavaliação dos riscos da liberação dessesprodutos para a alimentação humana.Em breve, dentro de poucos meses, seráconstituído ainda um novo comitê, quevai analisar a liberação de produtostransgênicos destinados à alimentaçãoanimal."A população torna-sepresa fácil desses gruposambientalistas pelodesconhecimentogeneralizado da ciência edos seus benefícios"BC&D - Se um produto transgênicofoi liberado para comercialização nosEstados Unidos ele é automaticamenteaprovado também na Europa outem que ser submetido às autoridadeslocais?Kinderlerer - Não. Ele tem que sersubmetido às autoridades de um dos 15países que compõem a União Européia.Cada um desses países tem poder paraliberar ou negar a importação de umproduto transgênico comercializado nosEstados Unidos e a decisão será respeitadae acatada pelos outros 14. Ou seja,na Europa não se fala em decisõeslocais; se um dos países diz não àintrodução de um produto transgênico,diz não por toda a Europa."Os cientistas precisam sermais enfáticos ao mostrar osbenefícios que podem vir a sergerados pelos transgênicos"BC&D - Diversas instituições do agronegóciotêm desenvolvido plantastransgênicas com tolerância a herbicidas.O senhor acha que o cultivodessas plantas pode aumentar a utilizaçãode defensivos agrícolas nomundo?Kinderlerer - Vou mencionar um exemplopara tentar responder a essa questãosobre o uso de herbicidas. Quando euparticipei de uma reunião no Cairo, háalguns anos, me perguntaram se eusabia como eles controlavam as plantasdaninhas no Egito. Eu disse que não efiquei surpreso com a técnica empregadapor eles: as ervas são simplesmentearrancadas com a mão, sem uso deherbicidas ou de qualquer outra tecnologia.E essa prática é muito comum naagricultura de subsistência em váriospaíses no mundo. Diante disso, apesarda introdução de plantas tolerantes aherbicidas levar ao uso desses produtos,representa, ao mesmo tempo, melhoriana qualidade de vida do trabalhadorrural, além do aumento de produção eprodutividade e maiores ganhos econômicos.Contudo, em escala de cultivocomercial, eu acredito que o uso dessasplantas levará à diminuição progressivado uso desses produtos devido ao aperfeiçoamentoconstante dessa tecnologia.BC&D - A clonagem da ovelha “Dolly”suscitou muitas polêmicas emtodo o mundo por envolver aspectoslegais, éticos e religiosos. O senhoracha que o avanço da ciência deveser livre ou ter algum tipo de limitação?Kinderlerer - Vamos começar pelaspesquisas com animais. Há muitos anos,os cientistas vêm trabalhando para aperfeiçoaro padrão genético dos animaisatravés de técnicas de melhoramentoclássico e, assim, aumentar a produçãode carne, leite e resistência a doenças econdições adversas. Por exemplo, asovelhas que, antigamente, só tinhamuma cria por ano, em média, podem terhoje 20 ou mais filhotes, em função dodesenvolvimento de técnicas de inseminaçãoartificial e manipulação de embriões,ao longo dos anos. A clonagemnada mais é do que uma evoluçãodesses métodos e, mais do que isso, umaimitação de um processo da natureza;eu, por exemplo, sou um clone natural,tenho um irmão gêmeo idêntico. Napecuária, há uma preocupação constantedo homem em desenvolver novastecnologias que permitam aumentar orebanho, de modo a atender à demandacrescente por carne e leite, em decorrênciaprincipalmente do aumento populacional,além de proporcionar ganhos deprodutividade. A clonagem é, sem dúvida,a tecnologia mais eficiente paraatingir esses objetivos. Já a clonagemhumana deve ser vista por dois ângulos:do ponto de vista científico, pode serconsiderada um grande avanço, porpermitir, a longo prazo, o desenvolvimentode novos órgãos para transplantes.Por outro lado, considero inaceitávela clonagem de seres humanos. Comocientista, eu considero qualquer desafio6 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

válido para o avanço do desenvolvimentocientífico sustentado, desde querespeitados os limites éticos e moraisda comunidade.BC&D - Em que áreas o senhoracredita que a biotecnologia podedar respostas mais rápidas nos próximosanos?Kinderlerer - A técnica que eu consideromais promissora hoje é a demapeamento genético, que permitearmazenar e formar bancos de dadosde informações genéticas, além de estabelecera proximidade e o distanciamentogenético entre as espécies, oque facilita o desenvolvimento de programasde melhoramento genético,entre outros. Na verdade, a biotecnologiajá vem trazendo avanços significativos,pois tornou possível a prospecçãode genes na diversidade biológicapara aplicação imediata e seuarmazenamento para uso futuro. Essesgenes têm sido utilizados na agriculturapara desenvolver plantas resistentes adoenças, insetos e estresses ambientaise para aumentar o valor nutricional dosalimentos, além de diminuir as perdasde armazenamento e pós-colheita; nasaúde humana e animal e na indústriade alimentos, entre outros. Diante detodos os avanços que já vêm sendoobtidos pelas técnicas biotecnológicase do potencial que apresentam paradesenvolver a agricultura do futuro, euacho que deve haver um esforço maior,especialmente por parte das empresasgovernamentais, para repassá-las àagricultura familiar. No Brasil, porexemplo, empresas como a Embrapadevem centrar suas pesquisas na produçãode espécies transgênicas importantespara a agricultura de subsistênciae produção de alimentos acessíveisàs camadas mais pobres, como a mandioca,que é uma das principais fontesde carboidratos. As grandes empresasmultinacionais, por razões óbvias demercado, não têm interesse no desenvolvimentodessas variedades transgênicas,o que, aliás, não é mesmo papeldelas.BC&D - Como o senhor avalia oestágio atual das pesquisas de biotecnologiano Brasil?Kinderlerer - Estou muito impressionadocom o alto nível das pesquisas noBrasil, em termos de qualificação profissionaldos cientistas, infra-estruturade laboratórios e com a abrangênciatécnica dos projetos de pesquisa. Comexceção de nações desenvolvidas como“No Reino Unido, temosum conjunto de leis evários comitês consultivosque assessoram oGoverno naregulamentação efiscalização dostransgênicos”EUA, Canadá, Reino Unido, França eJapão, poucos países no mundo têmessas qualificações. No que se refere àbiossegurança, o Brasil também ocupaposição de vanguarda. Em uma reuniãoda qual participei recentemente, ondeestiveram presentes representantes de18 países, incluindo Rússia, Namíbia,Hungria, Egito e Malásia, entre outros, oBrasil foi dos que mais se destacaram.BC&D - O que motivou essa sua vindaao Brasil?“Como cientista, euconsidero qualquerdesafio válido para oavanço dodesenvolvimento científicosustentado, desde querespeitados os limiteséticos e morais dacomunidade”Kinderlerer - Eu vim para participar,como convidado, do Seminário sobreClonagem e Transgênicos, realizado naprimeira quinzena de junho, no SenadoFederal brasileiro, no qual atuei comopalestrante em um debate sobre o tema:“Clonagem e transgênicos: riscos e benefícios”e de uma mesa redonda sobre“Bioética e biossegurança: limites e interfaces”,além de apresentar um semináriosobre biossegurança na EmbrapaRecursos Genéticos e Biotecnologia, tambémcomo convidado. Eu acho muitointeressante participar desses eventos, jáque essa troca de experiências e conhecimentosé muito importante para aumentara percepção pública acerca dabiotecnologia, que é uma área do conhecimentoque pode vir a trazer inúmerosbenefícios para a agricultura, saúdee meio ambiente. A desinformação e aidéia deturpada que a população, porvezes, tem dos transgênicos, muito porculpa dos meios de comunicação demassa, podem prejudicar o andamentodas pesquisas no país. E a biotecnologia,definitivamente, é uma ciência quenão pode parar de se desenvolver. Éimportante ainda que a população, comoum todo, saiba que existem normas,procedimentos e protocolos de biossegurança,que avaliam os riscos da introduçãoe desenvolvimento de produtostransgênicos e que só permitem a sualiberação se eles forem absolutamenteseguros para o meio ambiente e saúdeda população. Vou aproveitar ainda aminha passagem pelo Brasil para conhecera região amazônica.BC&D - Os produtos transgênicos comercializadosno Reino Unido têmque ser rotulados?Kinderlerer - Sim. Todos os novosprodutos alimentares lançados no ReinoUnido têm que ser rotulados para que osconsumidores saibam o seu conteúdo,independentemente de serem geneticamentemodificados ou originários dosseus derivados. De uma maneira geral, oeuropeu só consome aquilo que eleconhece. Os rótulos existem para isso.BC&D - O senhor acha que o desenvolvimentoe a introdução de organismosgeneticamente modificadosno meio ambiente podem causar riscosà biodiversidade brasileira?Kinderlerer - Sim, podem se foremintroduzidos de maneira irresponsável.Mas, para isso, é que são feitas asavaliações de riscos dos impactos nomeio ambiente e os demais procedimentosde biossegurança para evitar queeles ocorram. Ao mesmo tempo, abiotecnologia é uma importante ferramentapara ampliar os conhecimentossobre os recursos biológicos da biodiversidade,através, por exemplo, de técnicasde prospecção e formação debancos de genes. Essa situação é singularno Brasil devido à sua megabiodiversidade,especialmente na região amazônica,que ainda tem muito a revelar paraa ciência.Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 7

Carta ao LeitorBIOTECNOLOGIA Ciência & DesenvolvimentoKL3 ComunicaçãoFundadorHenrique da Silva CastroDiretor ExecutivoMárcio BrasilDiretora de PesquisaAna Lúcia de AlmeidaDiretor de ArteHenrique S. Castro FºDepartamento Comercial,Redação e Edição:SRTV/Sul - Quadra 701Ed. Palácio do Rádio IISala 215 - CEP 70340-902Brasília - DFTel.: (061) 225-1512 (061) 225-0976Fax: (061) 224-2830Projeto GráficoAgência de Comunicação IRIS(034) 217-2244(034) 259-0386http://www.agenciairis.com.bre-mail: iris@agenciairis.com.brE-mailkl3@biotecnologia.com.brHome-Pagehttp://www.biotecnologia.com.brImpressão e FotolitoGráfica São FranciscoAo disponibilizarmos para os nossos leitores e comunidadecientífica esta nona edição da Revista BiotecnologiaCiência & Desenvolvimento estamos convictos de que,mais uma vez, estaremos contribuindo para promover odebate sadio e plural do avanço da biotecnologia no Brasil.Muitos assuntos atuais e polêmicos fazem parte destaedição. Com certeza espertarão interesse, troca de conhecimentose experiências, provocando também debates acaloradosnos leitores, como por exemplo, a entrevista com ocientista e especialista em biossegurança do Reino Unido,Dr. Julian Kinderlerer, melancia sem sementes, algodãocolorido, extração de DNA, modelos animais de doençashumanas, novos conhecimentos sobre doenças de chagas,vespas como agentes no controle biológico e muitos outros.Importante destacar que a revista Biotecnologia Ciência& Desenvolvimento só tem conseguido, a cada edição,aumentar o número e a fidelidade dos leitores graças,acima de tudo, à participação sistemática e ao nível técnico-científicodos artigos, o que tem nos proporcionadomais forças para levarmos este projeto adiante.Assim, neste momento, queremos externar nossos agradecimentosa todos aqueles que direta ou indiretamentetêm contribuído com a Revista, em especial ao ConselhoCientífico, e reafirmar o compromisso público de manter aindependência da nossa linha editorial.AssinaturasO pedido de assinatura é realizado atravésda carta resposta-comercial encartada emcada revista, por telefonema ou faxdiretamente à KL3 ou pela Internetatravés dos nossos endereços eletrônicos.A revista não tem vendedores autorizados.ISSN 1414-45228 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

Conselho CientíficoDr. Henrique da Silva Castro - Saúde; Dra. Johanna Döbereiner - Microbiologia de Solos;Dr. Maçao Tadano - Agricultura; Dr. Naftale Katz - Saúde; Dr. Pedro Juberg - Ciências;Dr. Sérgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas;Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Genética de Microorganismos;Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental.Conselho Brasileiro de Fitossanidade - CobrafiDr. Ivan Rud de Moraes - Toxicologia;Dr. Luís Carlos Bhering Nasser - FilopatologiaConselho Federal de BiologiaDr. João de Deus MedeirosFundação Dalmo Catauli GiacomettiDr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Genética;Dr. José Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biológico;Dra. Marisa de Goes - Recursos GenéticosColaboraram nesta edição:Ana Cristina Miranda Brasileiro, Ana LúciaBrunialti Godard, Benedito AntônioLopes da Fonseca, Edécio Cunha-Neto,Eduardo Romano, Eleusio Curvêlo Freire,Fáboi Prezoto, Flávio de França Souza,Herman S. Mansur, Jean -Louis Guenet,João Pereira Leite, Manoel Abílio deQueiróz, Rita de Cássia de Souza Dias,Rodrigo L. Oréfice, Rúbia F. Silva, SimoneH. C. Scholze, Vera Cristina Terra-Bustamante, Wander L. Vasconcelos,Zélia P. Lobato.Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPENDr. José Roberto RogeroNovas TecnologiasBiomateriais para Fixação de Proteínas - pág 16AgriculturaVespas - pág 24Algodão Colorido - pág 36Extração de DNA de plantas - pág 40Melancia sem Sementes - Encarte EspecialSaúdePlasticidade Cerebral e Epileptogênese - pág 10Doença de Chagas - pág 20EntrevistaBiotecnologia e Biossegurança - Julian Kinderlerer, Sheffield - Inglaterra - pág 04PesquisaGenética de Camundongos- Encarte EspecialBiossegurançaBiossegurança e Vacinas da Dengue - pág 28SociedadeBiossegurança e Alimentos Transgênicos - pág 32Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 9

Plasticidade Cerebral eSAÚDEEpileptogêneseJoão Pereira LeiteProfessor Doutor da Faculdade deMedicina de Ribeirão Preto – USPDepartamento de Neurologia,Psiquiatria e Psicologia MédicaChefe do Laboratório de Investigação em Epilepsiajpleite@fmrp.usp.brEvidências a partir de estudos neuropatológicos humanos e experimentaisVera Cristina Terra-BustamanteMédica Assistente junto ao Centro de Cirurgia deEpilepsia (CIREP) do Hospital das Clínicas daFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USPvct@rnp.fmrp.usp.brFotos cedidas pelos autoresFigura 1: Imagem de ressonâncianuclear magnética na seqüênciaflair do paciente JMV, 35 anos, comhistória de crises parciais complexasque tiveram início na adolescênciae com história prévia decrise febril generalizada aos doisanos de idade. A investigação précirúrgicaevidenciou crises originadasna região temporal esquerda.Observa-se a formação hipocampalassimétrica, com redução do volumee da diferenciação da estruturainterna do hipocampo esquerdo,além de acentuado aumento dosinal (seta).Introduçãoa tentativa de explicar arecuperação de funçõesapós uma injúria cerebral,neurologistas levantam conceitosde reorganização funcionalou substituição funcional dosistema nervoso central (SNC) (Ramirezet al., 1996; Sabel et al., 1997).Vários estudos nas últimas décadastêm descrito que neurônios sobreviventesa um insulto no SNC passam porum processo de brotamento de sistemasaxonais, formandocontatos funcionais comregiões deprivadas desuas aferências originais.Dada a natureza universaldessa resposta de brotamento,existe a possibilidadede que a formaçãodesses novos contatosseja o substrato neuralresponsável pela reorganizaçãofuncional.Estudos lesionais em estruturaslímbicas de animaisde experimentaçãotêm demonstrado que obrotamento de terminaishomólogos àqueles desnervadospor uma injúriaprévia (brotamentohomotípico) está associadoà recuperação defunções de memória (Ramirezet al., 1996). Noentanto, estudos na formaçãohipocampal emmodelos experimentais de epilepsia eem pacientes com epilepsia do lobotemporal têm indicado que alguns tiposde brotamento anormais podemcontribuir para a ocorrência de crisesepilépticas (Babb et al., 1991, Sutula etal., 1989).Nos últimos anos, o avanço dastécnicas de neuroimagem estrutural efuncional, além da avaliação prolongadapor Vídeo-EEG e do refinamentonas técnicas cirúrgicas têm proporcionadoum aumento considerável donúmero de centros especializados notratamento cirúrgico da epilepsia dolobo temporal. Esse procedimento,embora tenha sido realizado pela primeiravez há mais de um século, foitemporariamente esquecido com oaparecimento das drogas antiepilépticas.No entanto, estas têm-se mostradoineficazes no controle da maioria doscasos de epilepsia do lobo temporal, oque levou ao reaparecimento e difusãoda cirurgia de epilepsia.Já em 1880, Sommer observou quepacientes epilépticos apresentavam freqüentementeao exame anátomo-patológicoalterações estruturais que envolviama região interna do lobo temporal,particularmente o hipocampo ea amígdala (Sommer, 1880; Mathern etal., 1998), mas foi Stauder (Stauder,1936) quem fez a associação dessesachados com a ocorrência de crisesparciais complexas, dando início àdescrição da síndrome que hoje conhecemospor epilepsia do lobo temporalmesial (French et al., 1993; Williamsonet al., 1993). Desde então, cada10 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

vez mais essa síndrome vem sendoestudada na tentativa de determinar acausa do seu aparecimento e os mecanismosque levam ao desenvolvimentoda epilepsia.Epilepsia do LoboTemporal MesialA epilepsia do lobo temporal é otipo mais comum de epilepsia intratáveldo ponto de vista medicamentoso.As crises epilépticas são caracterizadaspor uma aura inicial em parte dospacientes, sendo a mais comum a auraepigástrica (sensação de mal-estar naregião abdominal caracterizada por frio,cólica ou borborigmo), que pode ascenderem direção ao tórax ou à garganta(French et al., 1993). Outrasauras bastante freqüentes são as caracterizadaspor pensamentos forçados,lembranças de fatos já vividos (dofrancês, déjà vu) ou nunca vividos(jamais vu). Após essa fase, a criseusualmente evolui para perda da consciência,com o aparecimento de várioscomportamentos automáticos, queenvolvem particularmente a musculaturafacial e da deglutição e os membrossuperiores. O paciente pode aindaapresentar fala e marcha automática,ou períodos de agressividade (estesgeralmente ocorrem quando o pacienteé contido a força ou no período póscrise).Na fase pós-ictal pode ocorrerconfusão mental ou recuperação imediatada consciência. As crises podemevoluir para generalização tônico-clônicasecundária e a sua incidência évariável de caso para caso (Fernandese Sander, 1998). Ainda não há umadefinição clara na literatura se crisesepilépticas recorrentes podem ou nãolevar a uma piora progressiva da cogniçãodesses pacientes ou agravar aepilepsia (Holmes et al., 1998).Os pacientes que se apresentamcom essa síndrome têm freqüentemente,no seu passado, história de umaconvulsão, na vigência de febre, nainfância (na maioria dos casos, até ostrês anos de idade) (French et al.,1993). Essa convulsão geralmente érelatada como sendo duradoura (aproximadamenteuma hora ou, muitasvezes, de várias horas de duração),podendo ainda se apresentar comoconvulsões repetidas no mesmo dia.As crises podem acometer preferencialmenteum dimídio, assumindo umFigura 2: Representação esquemáticaem corte coronal dohemisfério cerebral direito passandopelo lobo temporal. Na porçãomesial está o hipocampo, seguidopelo giro parahipocampal, que éligado ao lobo temporal, na suaporção mais inferior. Para a retiradado hipocampo, faz-se uma secçãoda superfície lateral do lobotemporal, entre o giro temporalmédio e superior, em direção aocorno temporal do ventrículo lateral,como indicam as setas. Faz-sea retirada da superfície corticalpara, em seguida, retirar-se o hipocampoem bloco, juntamente como giro parahipocampal.caráter assimétrico. Após essa crise,que pode se caracterizar por um episódioúnico ou por crises repetidas nodecorrer de meses ou anos, surge umperíodo em que o paciente permaneceassintomático. Esse período segue atéo final da infância ou início da adolescência,quando, então, as crises epilépticasreaparecem, sendo dos tipos parcialsimples e/ou complexa, geralmenteocorrendo controle insatisfatório comas drogas anticonvulsivantes disponíveis.Estes pacientes têm como achadoradiológico a esclerose hipocampal(Williamson et al., 1993).Exames de InvestigaçãoAssim como nos outros casos deepilepsia, esses pacientes devem sersubmetidos a exames de investigaçãode rotina, que incluem o eletrencefalograma,e a um exame de neuroimagem,preferencialmente a ressonâncianuclear magnética. O primeiro podeevidenciar anormalidades focais, principalmentenas regiões temporais, quepodem ser unilaterais ou bilaterais. Oachado típico da ressonância nuclearmagnética é a atrofia da região mesialdo lobo temporal, sendo esse achadoconhecido por esclerose mesial temporal.Essa alteração envolve principalmenteo hipocampo, o giro parahipocampale a amígdala, sendo identificadapela ressonância nuclear magnéticacomo uma área de redução devolume na seqüência T1 e aumento desinal na seqüência flair (Figura 1). Emalguns pacientes, a ressonância nuclearmagnética pode ser normal ou limítrofecom a normalidade. Esse achadoocorre com maior freqüência nos pacientesem que não se observa históriade crise febril na infância antecedendoa epilepsia do lobo temporal, ou seja,nos pacientes que não apresentam ahistória típica da síndrome da esclerosemesial temporal.Nos casos definidos como clinicamenteintratáveis, é realizada uma investigaçãopormenorizada, que incluia monitorização prolongada por Vídeo-EEG,onde são registrados os achadosinterictais e ictais. Os achadosictais são tipicamente manifestos pelapresença de atividade rítmica na faixateta, correspondendo ao ritmo hipocampal,que, na grande maioria doscasos, é unilateral. Ainda fazendo parteda avaliação pré-cirúrgica são aindarealizados testes neuropsicológicos queevidenciam déficits de memória verbal(quando as crises são originadas nohemisfério dominante) ou de conteúdovísuo-espacial (quando as crisessão originadas no hemisfério não dominante)e a uma avaliação psiquiátricae social que podem identificar distúrbiospsiquiátricos e familiares relacionadosou não à epilepsia.Tratamento cirúrgicoO tratamento cirúrgico visa à curada epilepsia ou à redução significativado número das crises epilépticas. Ointuito da cirurgia é a ressecção da áreaepileptogênica, que, na epilepsia dolobo temporal, envolve as estruturasmesiais (hipocampo, giro parahipocampale amígdala). Para que seja feitaa ressecção é feita uma incisão naBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento 11

Figura 3: A: Representação esquemática de um hipocampo normal. As células principais do hipocampo compreendemos neurônios piramidais (representados por triângulos) distribuídos nos diversos subcampos (CA1, CA2 e CA3) do Cornode Ammon e células granulares (com citoplasma arredondado) localizadas na fascia dentata (FD). A região do hilo é envoltapela FD e contém, no seu interior, interneurônios dispersos (representado por células em forma de losango). Os axôniosdas células granulares (fibras musgosas) se projetam para a região CA3, constituindo o stratum lucidum (cabeça de seta).Na superfície externa da fascia dentata, encontra-se a camada molecular com as porções interna (mais clara, indicada porum asterisco) e externa (mais escura, indicada por uma estrela).B: Representação esquemática de um hipocampo com esclerose hipocampal. Observa-se uma perda celular importante(representada por figuras em branco), particularmente neurônios piramidais e hilares. Já na camada granular não há perdasignificativa de neurônios, ocorrendo no entanto, uma proliferação de colaterais axônicas (reorganização sináptica) provenientesde neurônios granulares que se projetam principalmente para a camada molecular interna (indicadas pelas setasazuis).porção lateral do crânio, próximo aopavilhão auricular, por onde se tem,acesso ao encéfalo. As técnicas deressecção da região epileptogênicavariam nos diversos centros de cirurgiade epilepsia, podendo incluir apenasas estruturas mesiais do lobo temporalou estender-se com a ressecção daporção lateral do lobo temporal (Figura2), sendo esta a técnica mais comumenteutilizada.PrognósticoO prognóstico cirúrgico é bastantefavorável, particularmente nos pacientescom diagnóstico da síndrome daesclerose hipocampal. Nesse grupo depacientes, chega a ser observado umíndice de cura da epilepsia em torno de80% a 90% dos casos, embora algunspacientes continuem a apresentar asauras. Nos pacientes em que essa histórianão é encontrada, mas, em examesde neuroimagem, observa-se achadotípico de esclerose hipocampal, oíndice de cura é ligeiramente menor,mas ainda em torno de 80%. Por outrolado, para os pacientes que apresentamressonância nuclear magnéticanormal, apresentam um prognósticobem menos favorável, podendo serobtido apenas 50% a 60% de casos emque ocorre a cura da epilepsia.Modelos animais e mecanismosde epileptogênesePara que haja um completo entendimentodos mecanismos que levamao desenvolvimento das epilepsias, incluídaa epilepsia do lobo temporal,vários modelos animais vêm sendodesenvolvidos. Tenta-se, dessa forma,determinar quais são os eventos quepodem induzir o aparecimento dascrises epilépticas, as estruturas envolvidase o melhor tratamento a serutilizado. Determinar o substrato anatômico,patológico e funcional, inclusiveos neurotransmissores envolvidos eas suas vias nas diversas formas deepilepsia é de grande importância parao desenvolvimento de novas terapêuticasclínicas ou cirúrgicas e na criaçãode mecanismos de prevenção dasmesmas. Assim, o modelo animal idealseria aquele que mais se aproximasseà história natural que ocorre em pacientes.O ideal é que se pudesse desenvolverem primatas, devido à maiorsemelhança filogenética com o homem,um modelo em que ocorressemcrises espontâneas, não sendo necessáriaa indução das crises por drogasou lesões cerebrais. Infelizmente sãopoucas as espécies animais que apresentamepilepsia idiopática e menosainda com crises parciais complexascomo as encontradas na epilepsia dolobo temporal.As preparações experimentais maisantigas, particularmente as utilizadaspara teste de drogas antiepilépticas,não reproduziam de forma fidedigna afenomenologia encontrada em humanos(Purpura et al., 1972). As crisesepilépticas eram induzidas principalmentede forma aguda, não sendoobservada a ocorrência de crises espontâneastardiamente. Nas duas últimasdécadas, novos modelos foramdesenvolvidos tendo como característicacomum a ocorrência de crisesespontâneas, em geral, como consequênciade um insulto cerebral decorrentede status epilepticus.Os principais modelos utilizadospara estudar a epilepsia do lobo temporalcom ocorrência de crises espontâneassão obtidos com injeções nacavidade peritoneal ou intra-hipocampalem ratos ou camundongos ou ain-12 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

da através da estimulação elétrica mantidade estruturas límbicas (McNamara,1994). Entre as drogas mais utilizadasestão a pilocarpina e o ácido kainíco(Cavalheiro et al., 1982, Leite et al,1990).A pilocarpina é um agente colinérgicoque, quando injetado em ratos,leva à ocorrência de crises epilépticassemelhantes às crises parciais complexasobservadas em humanos. Essascrises se manifestam agudamente comoum episódio de estado de mal epiléptico,que pode durar várias horas (assimcomo o encontrado na infância decrianças que desenvolvem a síndromeda epilepsia do lobo temporal mesial).Após um período em torno de 15 dias,os animais passam a apresentar crisesparciais com automatismos nas patas ecom as vibrissas, assemelhando-se àsparciais complexas da epilepsia dolobo temporal. Essas crises apresentamentão um caráter recorrente de formacrônica e espontânea (Leite et al., 1990,Cavalheiro et al, 1991).O ácido kaínico é uma aminoácidoexcitatório com ação glutamatérgica.Quando injetado na região hipocampalou sistemicamente leva a um quadrode status epilepticus límbico. Posteriormentea essa fase, são observadascrises recorrentes espontâneas (Cavalheiroet al., 1982). Estudos realizadosnesses modelos animais mostramque, se o estado de mal epiléptico nãoocorre ou é abortado com drogas antiepilépticas,essas alterações neuropatológicasno hipocampo não ocorremnem se desenvolvem as crises espontâneas,mostrando que pode existiruma relação direta entre esse tipo deepilepsia e as anormalidades anatômicase funcionais do hipocampo (Lemose Cavalheiro, 1995).Um achado neuropatológico encontradoem vários modelos de statusepilepticus é a perda acentuada deneurônios hilares e células piramidaisnos subcampos CA1 e CA3, com relativapreservação das células granularese neurônios piramidais de CA2.Além desse padrão desigual de vulnerabilidadecelular, existe também aocorrência de brotamentos axonaisno hipocampo esclerótico (Figura 3).Uma atenção maior tem sido dada ‘aperda de neurônios hilares, particularmente‘as células musgosas e aosfenômenos plásticos de brotamentosaxonais. Essas alterações têm-se apresentadocomo substrato anatômico paraduas hipóteses propostas na literatura,na tentativa de explicar os mecanismossubjacentes ao processo de epileptogênesena epilepsia do lobo temporalmesial (McNamara, 1994).1-Hipótese das células em cestodormentes:Essa hipótese foi estabelecida porSloviter (1991), utilizando o modelo daestimulação elétrica mantida da viaperfurante, a principal aferência que seprojeta do córtex entorrinal (camadasII e III) para a formação hipocampal. Aestimulação elétrica dessa via determinaa perda da inibição mediada peloGABA nas células granulares in vivo,sendo, portanto, consistente com aidéia de que a desinibição sinápticacontribui para a hiperexcitabilidadedas células granulares. No entanto,essa observação é paradoxal em vistada preservação preferencial dos neurôniosGABAérgicos, isto é, os neurôniosGABAérgicos se apresentam proporcionalmentemenos lesados do queas células principais. A hipótese afirmaque uma crise prolongada levaria, porum mecanismo excitotóxico, à mortede neurônios no hilo (células musgosas),removendo a aferência excitatóriadesses neurônios para as células emcesto (GABAérgicas), que ficariam então“dormentes”, sem a ativação normaldeterminada pelas células musgosas.Uma vez iniciada a perda parcialda inibição, combinada a aferênciaexcitatória a estímulos normais, descargasexcessivas das células granularesseriam geradas, levando `a mortecelular progressiva no hilo e ao aparecimentode uma condição epilépticacom o passar dos anos após o insultoinicial (McNamara, 1994).2-Reorganização sináptica das fibrasmusgosas:Essa hipótese defende a idéia deque a hiperexcitabilidade das célulasgranulares é uma consequência de umrearranjo patológico de uma circuitarianeuronal, na qual as células granularesemitiriam colaterais axônicas para oFigura 4: Cortes histológicos ilustrando um hipocampo normal (A e C) e umhipocampo de um paciente com esclerose hipocampal (B e D). A e B representamcoloração pelo método de Nissl. C e D método de coloração pelo neo-Timm, que evidencia fibras ricas em zinco. Em A nota-se a distribuição normaldas células granulares e piramidais. Comparando com a figura B observa-se umaredução significativa de todas as células nas camadas piramidais (entre as setascurvas) e do hilo (cabeça de seta), com preservação do subiculum inferiormente(asterisco). Na figura C observa-se a representação normal da marcação pelométodo do neo-Timm, sendo a região do hilo mais intensamente corada, se extendendoaté a transição entre a região CA3 e CA2. Em D, esta marcação no hiloé um pouco menos intensa, estendendo-se até a região do subiculum. Na regiãoda fascia dentata observa-se uma densa marcação anormal na camada molecularinterna (seta).Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 13

seu próprio campo dendrítico, resultandonum circuito excitatório recorrente(Tauck e Nadler, 1985). Esserearranjo é resultante da eliminaçãosináptica em decorrência da morte deneurônios (células musgosas) que,normalmente, projetam axônios parao terço proximal da camada moleculardo giro denteado (McNamara,1994). As sinapses eliminadas sãoentão substituídas pelos axônios dascélulas granulares, as fibras musgosas.Os axônios das fibras musgosascontêm altas concentrações de zincoe podem ser facilmente identificadospelo método de Timm. Uma marcaçãoanormal de terminais Timm positivosna camada molecular internatem sido observada em hipocamposde pacientes com esclerose hipocampale modelos animais de epilepsiatemporal (Figura 4). Acredita-se que,para ocorrer esse processo plástico,haveria a necessidade de síntese defatores tróficos que seriam responsáveispelo brotamento e manutençãodesses novos circuitos (Gall e Isackson,1989).ConclusãoEmbora partindo de um achadoneuropatológico comum (perda deneurônios hilares), duas hipotéses seapresentam com mecanismos fisiopatológicosaparentemente antagônicos.Somente com futuros experimentosno tecido cerebral epileptogênico humanoe em modelos animais, conseguiremosvalidar essas hipóteses. Noentanto, o conhecimento dos eventosmoleculares que ocorrem após a lesãoneuronal poderá, no futuro, oferecernovas estratégias terapêuticasno combate à epilepsia farmacorresistente.O desenvolvimento de drogasque antagonizem a ação excitotóxicasobre os receptores do tipo NMDApoderá obviamente evitar os processosdegenerativos quando empregadosna fase aguda da agressão aotecido cerebral. Uma vez estabelecidaa lesão, talvez a reorganização sinápticadas fibras musgosas possa serimpedida com a modulação específicade fatores tróficos neuronais, comofoi recentemente descrita para o sistemacolinérgico (Holtzman e Lowenstein,1995). Ou ainda, no caso dascélulas em cesto dormentes, poderiamser desenvolvidas drogas que,seletivamente, ativassem as célulasGABAérgicas inativas, podendo entãorestabelecer a inibição recorrentenas células granulares do giro denteado.Referências bibliográficasBabb, TL; Kupfer, WR; Pretorious,JK; Crandall, PH and Levesque, MF. –Synaptic reorganization by mossy fibersin human epileptic fascia dentata.Neuroscience, 42 (2): 351-363,1991.Cavalheiro EA, Riche D, Le Gal LaSalle G - Long-term effects of intrahippocampalkainic acid in rats: a methodfor inducing spontaneous recurrentseizures. 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BIOMATERIAIS PARAFIXAÇÃO DE PROTEÍNASNOVAS TECNOLOGIASDESENVOLVIMENTO DE UM PROCESSO DE FABRICAÇÃO DE VIDROS POROSOS VIA SOL-GEL PARA FIXAÇÃO DE PROTEÍNASHerman S. Mansur - mestre e doutor em físico-químicaRodrigo L. Oréfice - mestre e doutor em engenharia de materiaisWander L. Vasconcelos - mestre e doutor em engenharia de materiaisRúbia F. Silva – mestre e doutora em engenharia de materiaisUniversidade Federal de Minas Gerais – Escola de Engenharia –Departamento de Engenharia Metalúrgica e de Materiaishmansur@demet.ufmg.brZélia P. Lobato – mestre em virologia e doutora em biologia molecularUniversidade Federal de Minas Gerais - Escola de Veterinária -Departamento de Medicina Veterinária PreventivaResumoRealizou-se um estudo para desenvolvimento de umprocesso de fabricação de vidro poroso de sílica via solgelpara fixação de proteínas. Utilizou-setetrametilortossilicato (TMOS) como precursor em meiode etanólico e um tampão fosfato salino PBS, mantendoo pH=7,40 ± 0,05. O processo de polimerização foimonitorado por meio de análise FTIR, sendo observadoum período superior a 10 dias para obtenção de umapolimerização completa à temperatura ambiente. Asanálises dos substratos de vidros porosos incluirammedidas de porosidade e área superficial (B.E.T). Emseguida foram realizados testes preliminares paraavaliação da eficiência de fixação da proteína albuminanos substratos de vidro poroso.Palavras Chaves: Biomateriais, Proteínas, Sol-gel.AbstractIn this work we report the development of a processfor silica porous glass production with proteinfixation based on sol-gel method. The glass wasobtained using TMOS in ethanol and phosphatebuffered saline (PBS) solution with pH= 7.40 ± 0.05.The polymerisation of the material during thegelation process was monitored through FTIR and nosignificant change of the spectra after 10 days wasobserved. Porosity and surface area were analysedby B.E.T and the results have shown an increase ofthe average pore size when albumin proteinmacromolecules were added to gelation solution.Keywords: Biomaterials, Proteins, Sol-GelGlass.Fotos cedidas pelos autores1. INTRODUÇÃOA elevada eficiência apresentada pelasmacromoléculas biológicas na seleção dereagentes e na especificidade da interaçãocom sítios de reação tem promovido ocrescente interesse de pesquisa envolvendofilmes finos de macromoléculas associadasa materiais avançados [1-2]. As proteínas,em especial, são macromoléculasbiológicas de elevada importância e oestudo de suas interações com os diversosmateriais e meios químicos é fundamentalpara o aprofundamento do conhecimentoorgânico e funcional dos seres vivos. Osestudos envolvem geralmente a fixação ouimobilização de uma ou mais proteínas emsubstratos, por meio de diversos mecanismos,tais como, ligação covalente, adsorçãofísica, ligações cruzadas, polarização eestereoquímica, etc. Um ou mais dessesmecanismos citados devem estar envolvidosno processo de fixação da proteínacom o substrato. Os vários parâmetros doprocesso, tais como pH, temperatura, áreasuperficial, íons e agentes quelantes, agentescomplexantes etc. certamente determinamos níveis de eficiência e o grau deseletividade das interações proteína-substrato.Pesquisas recentes têm demonstradoque vidros silicatos obtidos por meio datecnologia de processamento sol-gel podemoferecer um substrato para fixação demacromoléculas de proteínas sem a perdade características funcionais biológicas dasmesmas [3-6]. Ao contrário dos métodosconvencionais de fusão de sílica vítrea querequerem elevadas temperaturas, o processamentosol-gel envolve baixas temperaturasnas reações de hidrólise e condensação,ideal para a grande variedade demoléculas orgânicas sensíveis a altas temperaturas,como a classe das proteínas quepodem desnaturar e perder sua atividadebiológica [7].Tipicamente, uma solução contendoum alcóxido líquido, tal como Si(OCH 3) 4(tetrametilortossilicato, TMOS), conduz àreação de polimerização sob condiçõesapropriadas e a viscosidade da soluçãoaumenta até o gel ser obtido. O gel ésubseqüentemente secado e aquecido paraproduzir os produtos desejados. Durante apolimerização, a evolução da forma e dotamanho dos polímeros, que determinama interação reológica entre eles são osfatores chaves que afetam a dependênciatempo-viscosidade da solução. Uma etapafundamental no processo sol-gel é a produçãodo gel poroso, preparado geralmenteatravés da hidrólise e condensação dealcóxidos. Tal evolução conduz eventualmenteà formação de um gel poroso, queposteriormente pode ser convertido emvidro poroso pela desidratação do material.As características de controle de porosidade,a elevada superfície de interação eestrutura amorfa dos vidros obtidos porprocessamento sol-gel os qualificam comosubstrato ideal para a construção de sistemasbiológicos heterogêneos envolvendo16 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

materiais inorgânicos e macromoléculasde proteínas. O controleda distribuição e do tamanhomédio de poros é fundamentalpara a propriedade defixação de proteínas do substrato,oferendo um maior oumenor número de sítios deinteração, dependendo do volumede poros e da área superficialsólido-poros da matrizvítrea obtida [8].A porosidade e a elevadasuperfície específica intrínsecados vidros porosos obtidos via sol-gelpermitem a captura de macromoléculassem a necessidade de uma ligação com ossítios biologicamente ativos, o que portanto,não compromete a eficiência da propriedadede seletividade do sistema construído.Neste trabalho foi realizado um estudode análise de FTIR da formação de umamatriz de sílica-gel porosa com incorporaçãode proteína BSA. Foram feitas análisesda variação da porosidade média da matrizobtida com a adição de macromoléculasde proteína durante o processamento solgele também após a gelação.2. MATERIAIS E MÉTODOSOs reagentes Na 2CO 3(> 99,5%), fornecidospela VETEC foram utilizados sempurificação posterior.Na 2HPO 4(> 99,0%), NaH 2PO 4(> 99,0%)e NaCl (> 99,0%), fornecidos pela VETEC,foram utilizados como reagentes para preparaçãodo tampão fosfato PBS (“phosphatebuffered saline”).Foi preparada uma solução 1,0 N deNaOH (> 99,0%), fornecido pela MERK,para correção do pH da solução utilizadano processo sol-gel.A albumina bovina (BSA - fração V >99,5%), C 2H 5OH (absoluto >99,8%) eSi(OCH 3) 4(TMOS > 98%) foram adquiridosda SIGMA- ALDRICH e utilizados sempurificação posterior.2.1. Preparação do Substrato Sol-Gela) Método-1 - Sem adição de albuminaPreparou-se uma solução de TMOS(1,0 ml ), etanol (1,2 ml) e um tampãofosfato salina (PBS, pH=7,4, 0,6 ml), promovendoagitação moderada, à temperaturaambiente até ocorrência de gelação. Asolução foi mantida em temperatura ambientepor 14 dias para polimerização completa.Foram realizados espectros de FTIRao longo desse período de tempo paramonitoramento da polimerização. Apósuma semana, foi feita a adição de 250 µl dasolução de 1,0 % de albumina em tampãoPBS, em cada amostra de gel de sílica.Figura 1. Representação esquemáticadas etapas de processamento solgel,com a incorporação de proteínasem matrizes dos vidros porososobtidosb) Método-2 - Com adição de albuminadurante a gelaçãoPreparou-se uma solução de 1,0 % dealbumina em tampão PBS e adicionou-se àmistura de TMOS-Etanol, agitando-se moderadamenteem banho de gelo até que agelação ocorresse. Manteve-se à temperaturaambiente por 14 dias para polimerizaçãocompleta. A Fig.1 mostra um diagramarepresentativo do processo de incorporaçãode macromoléculas de proteínas duranteo processamento sol-gel para obtençãode uma matriz vítrea de sílica.2.2. Ténica de análise por Espectroscopiano Infravermelho por Transformadade Fourier (FTIR)Utilizou-se o equipamento de análiseFTIR Paragon-1000 da Perkin-Elmer, como software Spectrum for Windows 1.0. Osespectros foram obtidos na faixa de númerode onda de 400 a 4000 cm -1 paraFigura 2. Espectros deinfravermelho de amostras degéis de sílica em diferentes estágiosde consolidaçãoacompanhamento da evoluçãodurante a preparação do substratode gel de sílica com a incorporaçãoe adsorção de proteínas. Foramobtidos espectros de reflexão,utilizando-se o acessórioPerkin-Elmer para reflexão difusa.Amostras monolíticas e na formaparticulada foram analisadas.2.3. Ténica de análise deporosidade por B.E.T.Utilizou-se o equipamento deanálise AUTOSORB-1 da Quantachrome.Os ensaios foram realizados com susbtratosde gel de silica com diferentes concentraçõesde proteínas para avaliação da suainfluência na área superficial e no tamanhomédio dos poros obtidos.3. RESULTADOS3.1. B.E.T.Os resultados iniciais indicam umainfluência significativa no tamanho médiode poros obtidos e na área superficial coma adição de macromoléculas da proteínaalbumina bovina (BSA) no processo desíntese de vidro de sílica porosa via sol-gel.Utilizando-se o Método-1, onde a proteínafoi adicionada no oitavo dia de envelhecimentodo gel, observou-se um valor médiode 75 Å para as amostras com concentraçãode albumina de 3% a 5 % e 50 Å parao gel de sílica sem adição de proteína . Demodo análogo, as amostras fabricadas peloMétodo-2, onde a proteína foi adicionadadurante o processo de gelação, observouseum tamanho médio de poro inferior aoobtido no Método-1, mas uma tendênciasimilar de aumento do tamanho médio deporo (50-100%) com adição de 1% de BSA.Essa observação está de acordo com aliteratura [3] que discute o aumento dotamanho do poro com a adição de macromoléculasorgânicas associado, principalmente,ao encapsulamento dessas macromoléculasnos poros, que impedem acontração durante o processo de envelhecimentodo gel de sílica.3.2. Espectroscopia deInfravermelhoA espectroscopia de infravermelho foiutilizada nesse trabalho para comprovar aeficiência do método de preparação noque se refere à incorporação de proteínasnos géis de sílica. Além disso, essa técnicafoi ainda usada para monitorar os processosenvolvidos na formação do reticuladoinorgânico do gel de sílica.Como salientado anteriormente, a formaçãodo gel de sílica via sol-gel inclui oprocessamento de uma série de reaçõesBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento 17

químicas que envolvem os alcóxidos metálicose seus derivados, frutos de reações dehidrólise e condensação. O processamentode tais reações leva ao surgimento e crescimentode cadeias poliméricas inorgânicas,as quais interagem entre si, culminando coma eventual formação de um reticulado tridimensional(gel). A espectroscopia de infravermelhopermite o acompanhamento daevolução estrutural que ocorre durante atransformação sol para gel e após a formaçãodo gel, a partir da avaliação do ambientequímico associado às ligações da sílica.A Fig.2 mostra os espectros de infravermelhode géis de sílica em diferentes etapasde consolidação. Nesse caso, géis coletadosapós 11, 12 e 14 dias após gelação foramsubmetidos à análise. Os espectros exibidosna Fig.2 mostram o pico característicos dasligações Si-O-Si (modo de estiramento) entre1100-1000 cm -1 , o pico relacionado comas ligações rompidas Si-O- entre 950-900cm -1 e, entre 450-400 cm -1 , o pico associadocom as ligações Si-O-Si no modo de dobramento.A análise desses espectros provêinformações relacionadas com a estruturados géis de sílica no que diz respeito àformação do reticulado tridimensional. Percebe-se,através dos espectros, uma mudançaprogressiva da freqüência dos picos relativosàs ligações Si-O-Si (estiramento) paramaiores números de onda em géis envelhecidospor tempos mais longos. Além disso,observa-se uma redução gradual da intensidadedo pico relacionado com as ligaçõesrompidas para maiores tempos de envelhecimento.Tais resultados estão explicitadosna Fig.3.Os resultados da Fig.3 fornecem informaçõesimportantes relacionadas com oprocesso de consolidação da estrutura dosgéis de sílica. A mudança do pico localizadoaproximadamente em 1080 cm -1 para freqüênciasmaiores é uma indicação de que oreticulado da sílica se torna mais rígido àmedida que o tempo de envelhecimentoaumenta. Quanto maior o número de ligaçõescruzadas entre as cadeias poliméricasinorgânicas, maior é a rigidez da rede emaior é a energia necessária para a ocorrênciadas transições vibracionais das moléculas.Ao mesmo tempo, a redução do númerode ligações quebradas (Fig.3) é uma indicaçãodo prosseguimento das reações de condensaçãoentre grupos silanol (-SiOH) mesmoapós a gelação. Tais reações aumentama densidade de ligações cruzadas no gel,levando a um enrijecimento da rede inorgânica.Informações obtidas via espectroscopiade infravermelho, como as discutidas nasFig.2 e Fig.3, são úteis na definição doestágio ótimo de consolidação dos géis paraimpregnação de macromoléculas (processamentoMétodo 1). Tal estágio ótimo deveincluir uma série de características estruturaisque possibilite a penetração e fixaçãoFigura 3. Mudanças observadasna freqüência e intensidade debandas de absorção em géis desílica analisados em diferentesestágios de consolidação.das macromoléculas. Entre essas característicascitam-se: textura de poros, rigidezda rede, concentração de grupos silanol(ligações quebradas), entre outras.3.3. Avaliação da presença deproteínas nos géis de sílicaFigura 4. Espectros deinfravermelho de albumina, gelde sílica e gel de sílica incorporadocom albuminaA espectroscopia de infravermelhafoi usada na determinação da eficiênciados métodos de incorporação de proteínasnos géis. Na Figura 4, são mostradosespectros de albumina pura (Fig.4a), degéis de sílica puros (Fig.4c) e de géis desílica com albumina (Fig.4), obtidos peloprocesso tipo (a).Os picos característicos da albumina,que envolvem os grupamentos amidaprimária (1620 a 1680 cm -1 ) e amidasecundária (1480 a 1580 cm -1 ), estãoclaramente exibidos na Fig.4a. Os picosobservados nos espectros de FTIR deamida-I e amida-II estão de acordo comas bandas descritas para proteínas naliteratura [9-10]. Esses picos se encontramtambém presentes no espectro dogel preparado com albumina, revelando,assim, a capacidade do método usado emincorporar macromoléculas em matrizesde sílica.4. CONCLUSÃONeste trabalho foi desenvolvido umprocesso de obtenção de uma matriz devidro poroso via sol-gel para incorporaçãode proteínas. Observou-se um aumentodo tamanho médio poro da matrizcom o aumento da concentração de proteínaBSA. Verificou-se ainda a incorporaçãoda proteína BSA adicionada por meioda técnica espectroscópica de FTIR.5. AGRADECIMENTOSOs autores agradecem ao CNPq/CA-PES/FINEP/FAPEMIG pelos recursos concedidospara utilização nesse projeto. Osautores agradecem também a Wesller G.Schmidt pelas análises de porosidade realizadaspelo método B.E.T.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS[1] MCLEAN, M.A.;STAYTON, P. S.;SLIGAR, S. G.,Engineering Protein Orientationat Surfaces to Control MacromolecularRecognition Events, Anal. Chem.,v.65, p.2676-2678, 1993.[2] MURAMATSU, H.; DICKS,J.;TAMIYA,E.; KARUBE,I., Piezoelectric CrystalBiosensor Modified with Protein-A forDetermination of Immunoglobulins, Anal.Chem., 1987, v.59, pp.2760-2763.[3] DAVE,B.C.; DUNN,B.; VALENTI-NE, J. S.; ZINK, J. I., Sol-Gel EncapsulationMethods for Biosensors, Analytical Chemistry,v.66, n.22, 1994.[4] BRAUN,S.; RAPPOPORT,S.;ZUSMAN,R.; AVNIR,D.; OTTOLENGHI,M. Mater. Lett., 1990, v.10, pp.1.[5] ELLERBY, L. M.; NISHIDA, C. 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AGREVOBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento 19

DOENÇA DE CHAGASSAÚDEEdécio Cunha NetoPesquisador do Instituto do Coração (InCor)Faculdade de Medicina da USPGanhador do Prêmio Roche (1994) e Prêmio Santista Juventude(1998) por seu trabalho na Imunologia da Doença de Chagasedecunha@usp.brNovos conhecimentos na patogênese da Doença de Chagasdoença de Chagas, causadapelo protozoário Trypanosomacruzi, afeta de 16a 18 milhões de pessoas nocontinente americano. Dadosda Organização Mundial de Saúderevelam que cerca de 90 milhões depessoas estão expostas ao risco de infecção.Em decorrência de migraçõespopulacionais, a doença de Chagas,classicamente considerada uma enfermidaderural, passou a atingir centrosurbanos, estimando-se que, aproximadamente,300.000 indivíduos infectadosresidam hoje em São Paulo e mais de200.000, no Rio de Janeiro.A despeito de a doença de Chagaster sido descoberta e seu ciclo elucidadohá mais de oito décadas, váriosaspectos relacionados com o seu controleainda se apresentam desafiadores.Os quimioterápicos anti-T. cruzi atualmentedisponíveis apresentam baixaeficácia e alta toxicidade, especialmentena fase crônica da doença de Chagas. Oconhecimento dos aspectos imunológicose inflamatórios que levam ao desenvolvimentodas diferentes formas clínicase dos mecanismos responsáveispelas formas graves, como a cardiopatiachagásica crônica, poderia permitir umtratamento eficaz por meio da modulaçãodesses mecanismos.A via mais importante de transmissãode T. cruzi para humanos é avetorial, pelas fezes de insetos triatomíneos(barbeiros) infectados. Graças aprogramas de Saúde Pública, a transmissãovetorial está sendo controladaem diversos países da América Latina,como é o caso do Brasil. Em função dasgrandes correntes migratórias citadasacima, a transfusão sangüínea passou arepresentar, especialmente nas grandescidades, a via mais importante no surgimentode novos casos da doença deChagas.Acometimento cardíaco naDoença de ChagasA causa principal de morbidade emortalidade na doença de Chagas é oacometimento cardíaco, que ocorre de5 a 30 anos após a infecção primária emcerca de 30% dos indivíduos infectadospelo T. cruzi. Na cardiopatia chagásicacrônica (CCC), ocorre uma inflamação edestruição progressiva do tecido cardíaco,levando a alterações da conduçãodos impulsos elétricos no coração earritmias. Paralelamente, ocorre um progressivoafinamento do músculo cardíaco,levando à dilatação das cavidadesdo coração, tendo como conseqüênciaa incapacidade de bombear adequadamenteo sangue para o organismo, umquadro chamado de insuficiência cardíacacongestiva. Dessa forma, a CCCfreqüentemente tem um curso fatal,uma vez que o tratamento é apenassintomático e a possibilidade de realizaçãode transplantes cardíacos é bemmenor que a demanda. Existem cercade 2 milhões de pacientes acometidosde CCC em nosso país. A CCC é responsávelpor, aproximadamente, 15% doscasos de pacientes atendidos por insuficiênciacardíaca congestiva, em hospitaisdo Estado de São Paulo. Um grupomenor dos pacientes infectados por T.cruzi (cerca de 5% a 8%) desenvolvealterações no tubo digestivo (os chamadosmegaesôfago e megacólon), aparentementepor destruição dos neurôniosque controlam sua motilidade; esses

problemas digestivos dificilmente levamao óbito. Já no acometimento cardíaco,que é tratado apenas sintomaticamentecom sucesso variável, o pacienteem geral vem a falecer em decorrênciade complicações irreversíveis dadoença. A CCC é a indicação maiscomum para o implante de marca-passoscardíacos artificiais em nosso país.Nos pacientes com insuficiência cardíacarefratária, o único caminho é o transplantecardíaco, um procedimento dispendiosoe inaccessível para a grandemaioria dos pacientes. Estudos comanimais experimentalmente infectadosindicaram que o tratamento com drogasanti-T. cruzi não parece evitar a progressãoda cardiopatia 1 .Mecanismos dedestruição do coraçãoOs mecanismos que levamao desenvolvimento daCCC ainda são assunto deintenso debate. São aindadesconhecidos os fatores desuscetibilidade que levamapenas 30% dos indivíduos adesenvolverem a CCC apósa infecção por T. cruzi, enquantoque os restantes 70%não apresentam problemascardíacos. A principal característicado tecido cardíacona CCC é uma miocarditedifusa, incluindo a destruiçãodas fibras cardíacas esubstituição por fibrose cicatricial,associada a um considerável infiltradoinflamatório difuso, compostopor linfócitos T e macrófagos. Essascélulas inflamatórias têm sido consideradascomo as efetivas destruidoras dotecido cardíaco, na aparente ausênciado T. cruzi. Já no coração de pacientesda forma indeterminada (IND), semsintomas cardíacos, identifica-se umainflamação bem menos intensa, chamadamiocardite focal 2 , que pode estarassociada com restos parcialmente destruídosdo parasita 3 (Higuchi et al. Am.J. Trop. Med. Hyg. 1997; 56: 485). Utilizando-setécnicas ultra-sensíveis, comoo PCR 4 e a imuno-histoquímica 5 , encontram-seindícios da presença do T.cruzi no coração de pacientes comCCC; entretanto, tais indícios tambémsão encontrados no coração de chagásicosda forma indeterminada, sem alteraçõescardíacas 6 . Além disso, outrosórgãos, como os rins, são parasitadospelo T. cruzi de forma análoga aocoração 7 , sem apresentarem sinaisde destruição ou dano funcional.Em conjunto, esses dados sugeremque a simples presença do T. cruzinão é suficiente para a indução damiocardite difusa e da destruiçãodo tecido cardíaco.Há algumas décadas, foi postuladaa hipótese auto-imune da patogêneseda CCC, que procurava explicara agressão ao tecido cardíacona CCC na ausência do T. cruzi insitu como um fenômeno secundárioa uma resposta imunológicacontra algum antígeno do T. cruzi,que apresentasse semelhanças antigênicas,ou mimetismo molecular,com um componente cardíaco. Aesse mecanismo - reagir com umantígeno semelhante, porém distintodaquele que gerou a respostaimune - chama-se reação cruzadaimunológica. Tanto as respostas imunesao T. cruzi quanto a auto-imunidadea componentes cardíacos jáforam responsabilizadas como desencadeadoresdo infiltrado inflamatórioe da destruição tecidual naCCC 8 .Informações obtidas com modelosanimais freqüentemente apontampara uma direção que pode serconfirmada por estudos com doentes.Linfócitos T CD4+, ou auxiliadores,de camundongos cronicamenteinfectados com T. cruzi podemtransferir a inflamação cardíacapara camundongos não-infectados.Também foi observado quetanto anticorpos do soro quantolinfócitos T CD4+ de camundongosinfectados reconhecem a miosina cardíaca,a proteína mais abundante do coração(Resultados revisados na ref. 8).Para verificar a validade dos resultadosna doença humana, nosso grupo estudouanticorpos anti-miosina cardíacano soro de pacientes CCC e IND. Anticorposanti-miosina cardíaca purificadospor afinidade a partir de soros depacientes CCC reconheceram especificamenteum antígeno de T. cruzi emum “imunoblot” com proteínas dos parasitas,apresentando-se como duasbandas de 140 e 116 kDa 9 . Identificouseesse antígeno como a proteína recombinanteB13 de T. cruzi 10 . Anticorposde reação cruzada estavam presentesem 100% dos soros de CCC, massomente 14% dos soros IND os apresentavam9 . Uma vez que são oslinfócitos T e não os anticorposos principais envolvidosna destruição ao coração, testamosclones de linfócitos Tobtidos por clonagem in vitroe expandidos a partir de umfragmento de biópsia do coraçãode um paciente portadorde CCC. Foram identificadosclones de linfócitos TCD4+ obtidos de biópsia endomiocárdicade portador deCCC que reconheciam de formacruzada a miosina cardíaca(a principal proteína docoração) e a proteína B13 deT. cruzi 11 . Curiosamente, nenhumclone de célula T reagiua qualquer outro antígenode T. cruzi, o que poderia indicarque, pelo menos nas áreas estudadas, odesencadeador do infiltrado inflamatórioera o reconhecimento cruzado damiosina cardíaca e não a presença do T.cruzi 11 . Estudamos também a produçãode citocinas (mediadores solúveis secretadospor linfócitos modular à inflamação)por linfócitos T presentes nocoração de pacientes CCC. Quando submetidosa estímulo com a fitohemaglutinina,potente ativador de linfócitos,essas células produzem quantidades significativasde IFN-γ e TNF-α, (citocinasinflamatórias, do tipo T1) mas não IL-4(citocina anti-inflamatória, do tipo T2)12. Em conjunto, esses dados indicam apresença, no infiltrado inflamátorio docoração de cardiopatas chagásicos, delinfócitos T reagindo cruzadamente comcomponentes do coração e capazes deproduzir citocinas inflamatórias, capazesde estabelecer uma inflamação doBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento 21

tipo “hipersensibilidade tardia”, justamentea observada na CCC.Após a definição das característicasprincipais dos linfócitos T presentes nocoração de cardiopatas chagásicos, épossível comparar tais característicasem linfócitos do sangue periférico depacientes CCC e IND, um material maisfacilmente disponível que biópsias cardíacas.Embora os linfócitos periféricosnão tenham apresentado resposta contraa miosina cardíaca, a imunização invitro de linfócitos com a proteína B13leva à geração de clones de linfócitos Tcom reação cruzada com a miosina 13.Isso sugere que, ao longo da infecçãopor T. cruzi, a sensibilização pela proteínaB13 in vivo possa levar à quebra datolerância para a miosina cardíaca. Aresposta de linfócitos T do sangue periféricoà proteína B13 foi muito semelhanteentre pacientes CCC e IND. Oslinfócitos T reconhecem B13 de formarestrita ao HLA, isto é, apenas indivíduoscom certas características genéticas(portadores de determinados alelos dosgenes da região HLA) podem apresentarresposta, embora estas característicasestejam presentes em até 85% dapopulação. Entre os chagásicos, a respostade citocinas a B13 é caracterizadapor grande produção de Interferongama,uma citocina pró-inflamatória, dotipo T1, e produção quase nula deInterleucina 4, uma citocina anti-inflamatória,do tipo T2. A resposta decitocinas a estímulo com fitoemaglutininafoi semelhante ao da B13 e oposta àencontrada em controles normais. Essesresultados indicaram a existência, nospacientes chagásicos, de um desvio sistêmicoe generalizado para a produçãode citocinas do tipo T1 (IFN-γ e proinflamatórias),com supressão de produçãodas citocinas do perfil T2 (IL-4) 14 . Essedesvio do perfil das citocinas provavelmenteestá relacionado com a capacidadedo T. cruzi de induzir a produção daInterleucina 12 (IL-12) por monócitos emacrófagos, que, reconhecidamente, estimulaa produção de citocinas do tipoT1 e suprime o perfil T2.Em suma, nossos resultados, ilustradosesquematicamente na Figura 1, reforçama possibilidade de que a infecçãopelo T. cruzi estimule a formaçãode linfócitos T potencialmente patogênicos,como postulado para outros agentesinfecciosos em doenças autoimunes.A infecção gera linfócitos T maturos,que reconhecem a proteína B13 e produzemIFN-γ, que são potencialmentecapazes de migrar para o coração.Entretanto, a identificação de linfócitosT anti-B13 capazes de produzircitocinas tipo T1 tanto em pacientesCCC como em IND, que não apresentamdestruição do tecido cardíaco,indica que a sua presença não ésuficiente para causar inflamação edestruição no coração. Assim, devehaver um “ponto-chave”, um fenômenoimunológico adicional, ocorrendoapenas em pacientes CCC, queleve ao acúmulo e ativação de taiscélulas no miocárdio levando à lesão.Estamos investigando a hipótese deque a geração de um infiltrado inflamatóriodestrutivo no miocárdio podesomente ocorrer no subgrupo deindivíduos infectados por T. cruzi,cujos linfócitos T anti-B13 apresentemreação cruzada com a miosinacardíaca.Novos tratamentos: drogas“inteligentes” eimunomodulaçãoAparentemente, não existe imunidadeestéril ao T. cruzi, isto é, oparasita persiste no organismo dopaciente em baixos números, ao longoda fase crônica da doença, querentre cardiopatas quer entre indeterminados.Isso é apoiado pelo fato deque estados de imunossupressão (porexemplo, drogas imunossupressoraspara transplante de órgãos, imunodeficiências)em chagásicos crônicosinvariavelmente provocam reativaçãodo parasitismo. O tratamentocom as drogas disponíveis contra o T.cruzi não leva à eliminação completado parasita de pacientes adultos cronicamenteinfectados; assim, a curaparasitológica completa é difícil. Aparentemente,o parasita persiste nohospedeiro na forma intracelular, jáque estudos mostraram que célulasintensamente parasitadas por T. cruzinão são danificadas pelo infiltradoinflamatório durante a infecção 3,15 .Os dados parecem indicar que asformas intracelulares do parasita desenvolverammecanismos de escape,ou pelo menos de retardo, da destruiçãodas células infectadas pelo sistemaimune, como acontece com algunstipos de virus 15,16 . A identificaçãodesses possíveis mecanismos deescape poderia fornecer importantesalvos para o desenvolvimento dedrogas anti-T. cruzi efetivas, capazesde curar a infecção crônica pelo parasita.Por outro lado, a definição doauto-antígeno cardíaco relevante paraa patogênese auto-imune da cardiopatiachagásica crônica é o primeiropasso para, no futuro, conceber umtratamento por supressão antígenoespecíficada resposta imune dirigidacontra esse auto-antígeno, como jádescrito na uveíte auto-imune, diabetesmellitus insulino-depedente, esclerosemúltipla e na artrite reumatóide 16 .Nessas doenças, observou-se que aadministração oral do auto-antígenorelevante gerou diminuição dos níveisde citocinas inflamatórias do tipo T1no órgão afetado, com conseqüenteredução de inflamação e destruiçãotecidual. Seria possível, então, eliminarseletivamente a resposta auto-imuneprejudicial sem interferir na respostade defesa contra o parasita.Referências bibliográficas1. Teixeira, A.R.L. et al. J. Infect. 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NOVARTISBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento 23

AGRICULTURAVESPASA importância das vespas como agentes no controle biológico de pragasProfº Fábio PrezotoDepartamento de Zoologia.Universidade Federal de Juiz de Forafprezoto@icb.ufjf.brFotos cedidas pelos autoress insetos são o mais numerosogrupo de animaissobre a face da Terra e,devido a sua influêncianas mais diferentes atividadeshumanas, têm sido objeto deestudo há muitos anos. Com o passardo tempo, a relação dos insetos como homem levou-os a serem classificados,do ponto de vista econômico,em insetos úteis ou nocivos.Entre os insetos, a ordem Hymenopteraé uma das que mais chamaa atenção, com cerca de 103 milespécies conhecidas, compreendendoinsetos como formigas (15 milespécies), abelhas (20 mil espécies)e vespas (cerca de 68 mil espécies)(GILLOTT, 1995).As vespas ou marimbondos sãoinsetos abundantes, que apresentamum alto grau de sinantropismo, ouseja, de associação com o homem. Émuito comum encontrar ninhos devespas construídos ao redor de edificaçõeshumanas. Embora todo oconhecimento popular sobre as vespasgire em torno de suas dolorosasferroadas e do seu grande númerode indivíduos, que saem do ninhopara atacar, cabe dizer que a açãonociva desses insetos é extremamenteirrelevante quando levamosem conta a contribuição deles tantono aspecto ecológico quanto no econômico.A grande maioria das vespas épredadora de inúmeras pragas agrícolase, consequentemente, agentesvaliosos no controle biológico destas.Mesmo em baixos níveis populacionais,os predadores contribuem nadiminuição da quantidade de pragas,reduzindo os picos de infestação quandomuitos inimigos naturais de hospedeirosespecíficos são ineficientes(DeBACH, 1951).Dentre as vespas sociais, o gêneroPolistes se destaca como um importanteagente de controle biológico,devido principalmente à facilidadede manipulação e translocação desuas colônias para abrigos artificiais.Na Carolina do Norte, RABB & LAW-SON (1957), verificaram que a introduçãode colônias de vespas dessegênero na cultura do fumo reduziuem 68% o dano causado pela lagartaProtoparce sexta (Johan). SegundoMORIMOTO (1961), uma única colôniade Polistes pode predar 2.000lagartas de Pieris rapae L., praga dacouve, durante seu ciclo de desenvolvimento.No Brasil, estudos recentes feitospor PREZOTO et al. (1994) e GIAN-NOTTI et al. (1995) trazem um levantamentodetalhado de presas capturadaspelas vespas Polistes simillimuse P. lanio lanio, respectivamente,sugerindo a utilização das mesmas nocontrole biológico de pragas agrícolas,uma vez que, em ambas as espécies,a maioria das presas capturadas24 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

Figura 2: Distribuição dos abrigosartificiais de madeira com colôniasde Polistes simillimus ao redor deuma quadra de milho experimental.Figura 1: Vespa forrageadora dePolistes simillimus trazendo pedaçode presa para a colônia (na Seta).correspondeu a lagartas de Lepidopteraque estavam presentes nas plantaçõespróximas aos ninhos estudados.O Japão e os E.U.A. possuemprogramas de manejo de colônias devespas desse gênero para abrigosartificiais instalados ao redor de plantações,com a finalidade de controledas pragas dessas culturas.A primeira pesquisa brasileira envolvendoa utilização de uma espéciede vespa social do gênero Polistes nocontrole biológico de pragas agrícolas,foi realizado por PREZOTO(1997), no Município de Piracicaba,SP. Nesta pesquisa, o autor procurouavaliar a ação predatória da vespasocial Polistes simillimus sobre aspragas do milho (Zea mays L.) emcampo, verificando os efeitos dessaassociação na produtividade da lavourae na incidência de pragas.O trabalho de PREZOTO (1997)foi realizado em duas etapas: a primeiradurante o período de novembrode 1994 a março de 1995 e asegunda de novembro de 1995 amarco de 1996. A primeira etapa dotrabalho avaliou o efeito da açãopredatória da vespa P. simillimus naprodutividade de uma lavoura demilho infestada com a “lagarta-docartucho”(Spodoptera frugiperda).Para tanto, infestou-se uma lavouraexperimental de milho de 500 m 2 (5quadras de 10 x 10 metros, distantes8 metros entre si) na sua fase inicialcom lagartas de primeiro ínstar dareferida lagarta. Após a completainfestação da lavoura, foram translocadas20 colônias de P. simillimus,em estágio inicial, de localidadespróximas para abrigos artificiais demadeira, distribuídos um em cadalado das 5 quadras -experimento.Também foram mantidas duas quadras-controles(sem infestação e semvespas), distantes cerca de 750 metrosda área experimental. Ao final dociclo da cultura, em março de 1995, acomparação da produção média dasquadras-experimento e quadras-controlerevelou que, devido à ação dasvespas, a produtividade das quadrasexperimentofoi 15,94% maior doque a produção das quadras controlepara o peso bruto de espigas e 13,07%maior em relação ao peso de grãos.A segunda etapa do trabalho quantificoua ação predatória das vespasP. simillimus sobre as pragas da culturado milho (5 quadras experimento)em relação à ocorrência naturaldas mesmas em uma cultura em condiçõesnormais (2 quadras-controle).O experimento seguiu a mesma metodologiada primeira etapa, comexceção da infestação com lagartasde S. frugiperda. Pela amostragemsemanal de 5 plantas em cada umadas quadras experimento e controle,estimou-se a incidência de pragas nasduas áreas e, por meio da coletasemanal de presas capturadas pelasvespas (5 horas por semana), identificou-sequais as pragas da cultura domilho estavam sendo predadas (TabelaI).Os resultados obtidos nas 12 coletasrealizadas durante o ciclo da culturado milho (novembro de 1995 amarço de 1996) revelaram que apredação de pragas exercida pelas 20colônias de P. simillimus na áreaexperimental, contribuiu para umaredução de 77,16% na incidência deS. frugiperda e 80% na população deHelicoperva zea (“lagarta-da-espiga”)em relação à área de controle.Esses resultados confirmam a excelenteatuação dessa espécie de vespano controle biológico das pragas esignificam uma economia para o agricultor,uma vez que acabam predandocom sucesso as pragas mais abundantesda cultura e diminuindo o gastocom inseticidas, que, muitas vezes,não controlam com eficiência a espéciedanosa, além de contribuir para apreservação do meio ambiente pelaprodução de produtos sem agrotóxicos.As vespas de P.simillimus encontrarame predaram de maneira eficienteas lagartas de S frugiperda, mesmoas escondidas dentro de partes daplanta, onde os produtos químicosnão atuam. A lagarta-do-cartucho é apraga mais importante e disseminada

na cultura de milho no país,não somente pelos danos quecausa, mas também pela dificuldadede controlá-la (CRUZ,1986).Dessa forma, pode-se concluirque o manejo de colôniasde vespas sociais para controlede pragas de culturas agrícolasé muito viável, não apenaspelos bons resultados obtidos,mas também pela facilidadee boa aceitação dessasvespas ao manejo e translocaçãode suas colônias. As vespassociais são relativamenteabundantes no ambiente e,uma vez introduzidas, as colôniascrescem, multiplicam-see disseminam-se pela região,favorecendo sua manutençãoe continuada eficiência nocontrole biológico das pragasdo local.Apesar da grande importânciaecológica das vespasno ambiente, muitas espéciesestão ameaçadas de extinçãodevido, principalmente, à faltade consciência da maiorparte da população que, ao encontrarum ninho de vespa, o destrói mesmosem motivo, além do uso indiscriminadode inseticidas, que levam à mortevárias colônias no ambiente.Ao contrário da abelha, as técnicaspara o manejo e a criação das vespasainda estão no início, por isso, quandoum vespeiro é destruído, nada podereconstruí-lo.Por se tratar de um animal silvestre,protegido por lei, quem for pego capturandoou destruindo ninhos de vespasestá sujeito às penas da lei.AgradecimentosO autor agradece a atenção daProfª Lígia Vieira Lage, pela colaboraçãona revisão do artigo.ReferênciasCRUZ, I. Manejo de pragas do milhono Brasil. In: EMBRAPA. Curso internacionalde manejo de pragas. SeteLagoas: EMBRAPA/CNPMS, 1986. 22p.DeBACH, P. The necessity for naecological approach to pest control oncitrus in California. J. Econ. Entomol.,44: 443-7, 1951.Figura 3: Vista de uma colônia davespa social Polistes simillimus emum abrigo artificial de madeira.TABELA I. Quantidade de presas capturadas por 5 colônias de Polistes simillimusdurante 5 horas semanais (60 horas) na área experimental de uma cultura de milho.PRESAS CAPTURADASLEPIDOPTERASpodoptera frugiperdaSpodoptera sp.Heliothis virescensHelicoverpa zeaMocis latipesTrichoplusia niAnticarsia gemmatalisNymphalidaePieridaeLEPIDOPTERANão identificadosNinfa de HEMIPTERAINSETOS ADULTOSNão identificadosMaterial não identificadoTOTAL4-1--------1-6--31---------41--212---1---71-2--3-----1182-3--------1-61-1---22-----6GIANNOTTI, E.; PREZOTO,F.; MACHADO, V.L.L. Foragingactivity of Polistes laniolanio (Fabr.) (Hymenoptera,Vespidae). An. Soc. Entomol.Brasil, 24: 455-63, 1995.GILLOTT, C. Entomology.New York, Plenium Press,1995. 798p.MORIMOTO, R. Polisteswasps as natural enemies ofagricultural and forest pests.III. (Studies on the social Hymenopteraof Japan. XII). Sci.Bull. Fac. Agric. KyushuUniv., 18: 243-52, 1961.PREZOTO, F. “Ação de Polistes(Aphanilopterus) simillimusZikán, 1951 (Hymenoptera,Vespidae) nocombate às pragas de Zeamays L.” Dissertação deMestrado apresentada ao Institutode Ciências Biológicas/UNESP. Rio Claro, 1997, 67p.PREZOTO, F.; GIANNOTTI,E.; MACHADO, V.L.L. Atividadeforrageadora e materialcoletado pela vespa socialPolistes simillimus Zikán,1951 (Hymenoptera, Vespidae). Insecta,3(1): 11-19, 1994.RABB, R.L. & LAWSON, F.R. Somefactors influencing the predation ofPolistes wasps on tobacco hornworm.J. Econ. Ent., 50: 778-84, 1957.NÚMERO DE SEMANAS TOTAL %1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 123-2-----1---2821-1--3--3--1111-11--2--2---71--1-22--21--92-12-13--3--1133--2--1------623,071,0915,3810,981,098,7914,282,191,0912,081,093,295,58100,026 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

SOJA ROUNDUP

Biossegurança eBIOSSEGURANÇAVacinas da DengueCritérios de Biossegurança na análise de um candidato VacinalBenedito Antônio Lopes da FonsecaDepartamento de Clínica Médica da Faculdade deMedicina de Ribeirão Preto - Universidade de SãoPaulo. Médico formado pela Faculdade de Medicinada Universidade de São Paulo e Mestrado eDoutorado pela Yale University (USA).dengue, hoje a mais importantedoença viraltransmitida por artropódos,resulta da infecçãopor um dos sorotipos dovírus do dengue. Esses vírus, denominadosdengue tipos 1, 2, 3 e 4, sãotransmitidos a um hospedeiro susceptívelatravés da picada da fêmeado mosquito Aedes aegypti previamenteinfectada. O quadro clínicodessa doença varia desde apresentaçõesassintomáticas até quadros gravescaracterizados por hemorragia echoque circulatório e associados aalta letalidade, denominados febrehemorrágica do dengue (FHD) e síndromedo choque do dengue (SCD).Essas formas da doença estão, namaior parte das vezes, relacionadascom a infecção secundária causadapor um sorotipo do vírus da denguediferente daquele que causou a infecçãoprimária. FHD e SCD são prevalentesem mais de 100 países e sãouma ameaça à saúde de mais de 2,5bilhões de pessoas, habitantes dasregiões tropicais e subtropicais doglobo terrestre. A incidência anual dadengue é estimada em torno de dezenasde milhões, com um númeroaproximado de 500.000 hospitalizaçõesde casos de FHD/SCD. Em média,o índice de mortalidade dessescasos é de 5%, com, aproximadamente,24.000 óbitos por ano. No Brasil,somente neste ano, já foram notificados213.932 casos de dengue, sendoque, até a 18 a semana epidemiológica,50 casos foram caracterizadoscomo FHD/SCD e resultaram em 8óbitos.A Organização Mundial da Saúde(OMS) considera o controle e a prevençãoda dengue uma das suas prioridadese, para atingir esse objetivo,adotou, em 1995, um programa estratégicomundial. Atualmente, o controledessa doença baseia-se primariamenteno controle do vetor, já quenão existe ainda uma vacina licenciadapara uso humano, apesar de intensapesquisa nesse campo nos últimos30 anos.Vacinas para a dengueAs primeiras tentativas de produçãode vacinas para os vírus da dengueiniciaram-se alguns anos apósesses vírus terem sido isolados. Inicialmente,candidatos vacinais foramatenuados pela passagem seriada emcérebros de camundongos e se mostraramprotetores contra os seus protótiposselvagens. Entretanto, proteçãoapenas contra um tipo de sorotiponão é suficiente devido à hipótesede que a infecção sequencial por umsorotipo diferente leve a uma doençamais grave. Desse modo, a vacinapara o dengue deve ser tetravalente,isto é, proteger contra os 4 sorotipos.Assim, pesquisadores começaram atentar produzir vacinas atenuadas parao dengue, em particular grupos devárias instituições americanas e daMahidol University, na Tailândia. Ascepas 45AZ5 PDK-27 (dengue-1),DEN-2 PR-159-S1 (dengue-2),CH53489 clone 24/28 (dengue-3) e341750 Carib (dengue-4) foram desenvolvidaspelos grupos americanosenquanto que as cepas DEN-1 PDK-13, DEN-2 PDK-53, DEN-3 PGMK-30/F2 e DEN-4 PDK-48 foram desenvol-28 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

vidas na Tailândia, sob supervisão daOMS. Vários ensaios clínicos foramfeitos com esses candidatos vacinais,quando foram conseguidos algunsresultados que garantiam a possibilidadedessas vacinas serem usadas,desde que os problemas de potênciae imunogenicidade fossem resolvidos.Em 1993, foi firmado um acordocomercial entre a Mahidol Universitye a Pasteur Merieux Serums andVaccines Company para optimizar aprodução dessas vacinas para o dengue.No início deste ano, foi apresentado,no First Annual Conference onVaccine Research em Washington,D.C., o resultado dos testes em voluntárioshumanoscom esta vacina. Aconclusão do trabalhofoi que, apesarda maioria dos individuostestados teremapresentadosoroconversão, interaçõesentre os sorotiposvirais resultandoem viremiaseletiva pelo dengue-3,podem afetara infectividade eimunogenicidadeda vacina tetravalente.A produção devacinas de vírus inativadostem sidopouco explorada na produção devacinas para o dengue devido à característicade não apresentar grandeimunogenicidade. Recentemente, Putnake colaboradores tem investidonesse método de produção de candidatosvacinais através da passagemdesses vírus em células Vero (rim demacaco verde africano) e FRhL-2(pulmão fetal de macaco Rhesus)seguido por inativação em formalinaa 0.05% e formalina seguida de radiação(7 mRads de fonte de cobalto).Entretanto, somente proteção parcialfoi obtida com esta técnica o que acoloca em segundo plano em relaçãoàs demais, principalmente pelo fatode ser muito caro produzir esse tipode vacina e pela pouca imunogenicidade.Outra estratégia usada na produçãode candidatos vacinais refere-seà purificação de proteínas nativasdos vírus da dengue por cromatografialíquida (HPLC). Os resultados aítambém foram desapontadores e, associadaao custo de produção, essa estratégiatem sido abandonada.Nos últimos anos, algum progressono desenvolvimento de vacinas temsido alcançado por meio do uso datecnologia do DNA recombinante. Asestratégias usadas foram as de produçãode peptídeos sintéticos, vacinas desubunidades, vacinas de vírus recombinantes,vacinas derivadas de clonesinfecciosos de cDNA derivados de candidatosvacinais e vacinas de DNA.Deposita-se muita esperança nos doisúltimos métodos. Um clone infecciosode cDNA preparado a partir do candidatovacinal DEN-2, PDK-53 está sendousado para construir vírus quiméricospor meio da inserção dos genes dacápside viral, da pré-membrana e doenvelope dos vírus dengue-1, 3, e 4 naestrutura genômica do DEN-2 PDK-53.Essas vacinas vêm sendo desenvolvidascom sucesso por um grupo doNational Intitutes of Heallth (NIH) etêm-se mostrado imunogênicas nomodelo animal. Além disso, clone infecciosode cDNA do vírus da febreamarela pode ser usado para os mesmosfins. As vacinas de DNA podemrepresentar uma solução, pois elas podemser usadas para imunização contraum sorotipo específico de dengue, semo inconveniente de induzir a respostaimune exacerbada responsável pelasinfecções graves do dengue. Kochel ecolaboradores produziram um candidatovacinal para o dengue-2 e demonstrarama presença de anticorposneutralizantes para esse vírus em camundongos.Outros candidatos vacinaispreparados por engenharia genéticasão as vacinas de subunidadese vírus recombinantes que expressemproteínas dos vírus da dengue. Aprodução de vacinas de subunidadesem baculovírus tem tido resultadosconflitantes pois alguns grupos têmencontrado proteção total em camundongos,enquanto outros encontramapenas proteção parcial. Com vírusrecombinantes, principalmente como vírus da vaccínia, esses resultadosnão têm sido diferentes, apesar dessesvírus recombinantes possuírem areputação de induzirem melhor respostaimune do que os outros vetoresrecombinantes, tais comobactérias, por exemplo, aSalmonella typhimurium.Biossegurança e vacinasDesde que a vacinapara a dengue seja a únicachance de realmente controlaressa doença, intensaspesquisas nessa áreapoderão resultar na produçãode candidatos vacinais.As normas para liberaçãode uma vacina devecobrir todas as fases deprodução de uma vacina,isto é, a fase de desenvolvimento,de ensaios clínicos,registro nos orgãos competentese vigilância pós-liberação. Antes dafase de investigação clínica, deve-seinvestir na segurança do laboratórioem que a pesquisa está sendo desenvolvidaa fim de se proteger as pessoasque estão envolvidas na pesquisae que o meio ambiente não sejaafetado pelos produtos secundáriosresultantes dessa pesquisa. Para tanto,as condições de segurança doslaboratórios devem ser otimizadas,em especial com a manipulação dosvírus e o descarte do material. A infraestruturade biotério é de extremaimportância, pois se a pesquisa forrealizada em áreas endêmicas para adengue, existe a possibilidade decontaminação dos animais usados empesquisa por mosquitos infectadosou da contaminação de mosquitospelo candidato vacinal. Além disso, énecessário certificar-se de que os materiaisusados na produção das vaci-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 29

nas sejam puros e seguros, e que, aomesmo tempo, não comprometam apotência da vacina. Testes em animais,inclusive em primatas não-humanos,devem ser exaustivamente realizadospara garantir que a mesmanão é tóxica, portanto é segura, potentee eficaz para uso em humanos.Após a avaliação da eficácia dessavacina no laboratório, os critérios debiossegurança devem ser aplicadosna investigação clínica.A investigação clínica para validaçãoda vacina como imunobiológicogeralmente se faz em três fases: osensaios clínicos de fase I, II e III. Nafase I, o produto é administrado paraum pequeno número de voluntários evisa a determinar a atividade biológicado produto, sua potência e a suasegurança. Nesse caso, um candidatovacinal para a dengue deverá induzira formação de anticorpos neutralizantese, para alcançar esse objetivo, ocandidato vacinal deve ser administradoem pequenas doses e ser isentoou com poucos efeitos colaterais. Aindanessa fase, pode-se certificar deque o candidato vacinal não persisteno organismo (latência) e que podeser administrado com segurança aimunossuprimidos e imunocomprometidos.Ensaios de fase II destinamsea confirmar os achados dos ensaiosde fase I, em particular a eficácia doproduto em produzir a sua atividadefarmacológica e fisiológica. No casodas vacinas da dengue, essas deverãoinduzir resposta imune que confiraproteção contra os quatro sorotiposde vírus da dengue semelhante àresposta induzida pelos próprios agentes.Nessa fase, o vírus selvagem podeser administrado aos voluntários queforam vacinados ou podem ser usadosvoluntários de área endêmica everifica-se a capacidade protetora davacina. Alguns efeitos colaterais maisraros podem ficar aparentes nessafase. Devido ao maior número devoluntários usados, pode-se determinar,nessa fase, se a “infecção” pelavacinação ocorre somente na populaçãoalvo, se o candidato vacinal écontagioso e se induz fenômenos imunológicosque possam ser associadosao desenvolvimento de doença autoimune.Se o candidato vacinal é umvírus recombinante, deve-se avaliarse não ocorreu mudança de especificidadecelular ou aumento da virulência.Na fase III, os ensaios clínicos sãorealizados “no campo”, com um grandenúmero de pessoas e devem incluirpopulações com característicasepidemiológicas bem estudadas. Avigilância pós-liberação deve ser implementadae documentada. Somenteassim, eficácia e segurança a longoprazo podem ser determinadas. Apenascom estudos a longo prazo é quese poderá concluir que o candidatovacinal não é tumorogênico ou nãoocorre integração no genoma do hospedeiro.Nessa fase, por meio deestudos controlados, outros aspectosimportantes na discussão de critériosde biossegurança poderão ser avaliados.Entre eles estão a capacidade docandidato vacinal infectar outras espécies,incluindo os vetores da dengue,de sobreviver na natureza, de serdisseminado no meio-ambiente e, finalmente,do grau de segurança dessecandidato vacinal a longo prazo.Dessa fase sairão os resultados queserão analisados em relação ao riscoda liberação de uma vacina para usohumano e o benefício a ser alcançado.Como exemplo, os efeitos colateraisdo vírus da vaccínia não foramdesprezíveis durante a campanha deerradicação da varíola, porém a erradicaçãodessa doença livrou a humanidadede um dos seus maiores flagelos.Do mesmo modo, as vacinascontra a poliomielite e o sarampo nãosão inócuas, mas prestam um benefícioimensurável às pessoas vacinadas.Quanto à persistência na natureza,é impossível predizer o resultadoda liberação de um candidato vacinalno meio-ambiente. O vírus da vaccíniaé, até hoje, excretado por búfalos,na Índia. Isso só ocorre porque ovírus da vaccínia tem a capacidade deinfectar outras espécies que não aquelavisada para a vacinação. Desse modo,será difícil ocorrer a liberação de umvírus recombinante preparado a partirde um vírus da vaccínia para usovacinal. Por outro lado, se a especificidadedo candidato vacinal para aespécie humana for alta e os efeitosda infecção aguda pouco importantes,a persistência na natureza podeauxiliar na imunização de susceptíveisAssim, a avaliação de critérios debiossegurança na liberação de umcandidato vacinal é complicada pelanecessidade de estudos a longo prazo,porém um dos critérios mais importantesé a avaliação de risco ebenefício. As vacinas de vírus atenuadosmultivalentes, como é o caso davacina para a dengue, podem apresentara replicação preferencial de umsorotipo viral em detrimento dos outros.Além disso, por serem atenuadas,e portanto, vacinas de vírus vivos,existe a possibilidade da reversãode um deles à cepa virulenta, aumentandoa possibilidade de causar doençaclínica após a inoculação da vacina.As vacinas de vírus quiméricos funcionariamcomo vacinas de vírus atenuadose, portanto, com os mesmosproblemas mencionados anteriormentepara essas vacinas. Adicionalmente,como ocorre a produção de umvírus previamente inexistente, não sepode prever o impacto desste novovírus na natureza e o resultado dassuas infecções em seres humanos.Desde que vacinas de DNA estãosendo consideradas uma alternativapromissora para o desenvolvimentode vacinas, a maior preocupação é apossibilidade de integração desstesDNAs no genoma celular. Estudossobre esse tema têm mostrado que ainjeção de 200 mL de DNA, o quecorresponde a 3 x 10 13 moléculas deDNA, representa uma freqüência deintegração 10.000 vezes inferior a eventooncogênico, o que é um eventoextremamente raro. Assim, se um candidatovacinal apresentasse um efeitoadverso indesejado a cada 100.000vacinações, este seria considerado umalto índice de efeitos adversos. Porém,se analisarmos o fato de que jáforam notificados mais de 200.000casos de dengue este ano no Brasil eque houve 50 casos de dengue hemorrágiconesse período, resultandoem 8 óbitos, o benefício da vacinaçãoé óbvio. Desse modo, é importantedeterminar os critérios de biossegurançapara que se possa avaliar umcandidato vacinal na sua totalidade,mas, é claro, que os estudos a longoprazo são aqueles que nos darão asmaiores informações sobre a segurançae o benefício do uso desses imunobiológicos.Desse modo, na eventualidadede se produzir uma vacina paradengue, esta deverá passar por umabateria imensa de testes para que sejacogitada a sua aprovação para usohumano. Infelizmente, apesar dos esforçose da necessidade para controledessa doença, vacinas para a denguenão estarão disponíveis para uso humanoem um futuro próximo.30 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

CARGILL

Biossegurança eSimone H. C. ScholzeA autora é analista de C&T do Ministérioda Ciência e Tecnologia, temmestrado em Direito pela UnB e émembro da CTNBio.SOCIEDADEAlimentos TransgênicosO papel da CTNBiointenso avanço da pesquisa biotecnológicaprovoca hoje umacrescente mobilização da sociedadee dos Poderes Públicosquanto à absorção dos seus resultados -reações positivas com relação aos benefíciosaportados pela biotecnologia e reaçõesnegativas quanto aos riscos tecnológicos.Quando se trata de riscos tecnológicos,não se está lidando apenas com a incertezaeconômica ou científica e tecnológica, mastambém com a incerteza ética e moral. Àprimeira ordem de incertezas, a sociedaderesponde com o estabelecimento de regulaçãotécnica mais estrita, por exemplo, nocampo da biossegurança, do uso de animaispara pesquisa e da propriedade e comérciode bens de alto conteúdo tecnológico. Relativamenteà segunda categoria de incertezas,além do debate no campo da biossegurança,verifica-se a legítima intensificaçãodo debate ético. O Brasil chega hoje exatamentea essa era de transformações científicase de debates éticos e legais.A aprovação de um plantio em escalacomercial de uma linhagem transgênicacomeça com muitos anos de trabalho delaboratório. Uma vez que uma planta potencialmenteútil tenha sido desenvolvida etestada em laboratório, um programa detestes de campo é essencial para avaliar seudesempenho, antes da comercialização. Abiossegurança visa precisamente ao estabelecimentodos mecanismos de proteção parao uso da biotecnologia moderna, tanto noque tange a experimentos laboratoriais, comoa testes de campo que possam implicar riscobiológico, provocando impactos ambientaisfavoráveis ou indesejáveis ou conseqüênciaspara a saúde humana. Desde a década de1970, fatores associados ao desenvolvimentocientífico e tecnológico dos países, ainteresses econômicos e a pressões dospróprios cientistas e de grupos ambientalistasvêm delineando as normas do que seconvencionou denominar biossegurança.A Lei de BiossegurançaComo conseqüência de projeto de lei deiniciativa do então Senador Marco Maciel,após 5 anos de tramitação no CongressoNacional, foi sancionada, em 1995, a Lei deBiossegurança e foi criada a ComissãoTécnica Nacional de Biossegurança (CTN-Bio), instituição norteadora do desenvolvimentoda moderna biotecnologia no Brasil.Operacionalmente vinculada ao Ministérioda Ciência e Tecnologia, a CTNBiocomeçou suas atividades em junho de1996. É composta por 36 membros, titularese suplentes, especialistas de notóriosaber científico, das áreas humana, animal,vegetal e ambiental, representantes dosMinistérios da Ciência e Tecnologia, daSaúde, da Agricultura, do Meio Ambiente,da Educação e das Relações Exteriores,além de representantes de órgão de defesado consumidor, de proteção à saúde dotrabalhador e do setor empresarial debiotecnologia.Compete à CTNBio estabelecer normase regulamentos relativos às atividadese projetos que envolvam construção, cultivo,manipulação, uso, transporte, armazenamento,comercialização, consumo,liberação e descarte relacionados a organismosgeneticamente modificados, visandoa proteger a vida e a saúde do homem,dos animais e das plantas, bem como omeio ambiente. A Comissão vem-se reunindoregularmente desde a sua criaçãopara certificar a segurança de laboratóriose experimentos relativos à liberação deorganismos geneticamente modificados nomeio ambiente e para julgar pedidos decomercialização de produtos que contenhamOGMs. Ao longo de seus três anosde funcionamento, foram emitidas 18 InstruçõesNormativas que regulamentam diversosaspectos da biotecnologia modernano País.Atualmente, existem 120 instituiçõespúblicas e privadas credenciadas pelaCTNBio, por meio da concessão de Certificadode Qualidade em Biossegurança(CQB), para desenvolver atividades comorganismos transgênicos, das quais 20 efetivamenteconduzem liberações planejadasno meio ambiente. A Comissão jáautorizou e vem acompanhando cerca de700 processos de liberações planejadas nomeio ambiente, em plantios agrícolas emescala experimental e apenas um em escalacomercial, a soja “roudup ready”. Emborase verifique um processo cada vez maior deconscientização, muitas instituições aindaatuam com organismos transgênicos semautorização legal da CTNBio. A fiscalizaçãodessas atividades é incumbência dos órgãosfiscalizadores do Ministério da Agricultura,do Ministério da Saúde e do Ministério doMeio Ambiente, em suas respectivas áreas decompetência.Procedimentos da CTNBioA Comissão analisa, caso a caso, assolicitações que lhe são encaminhadas, jamaisemitindo pareceres genéricos sobre,por exemplo, “soja transgênica” ou “milhotransgênico” em geral, mas, unicamente,sobre determinada linhagem de soja modificadapara expressar determinadas características.Cabe ao solicitante o ônus de demonstrara biossegurança do OGM, fornecendotodos os dados necessários para a avaliaçãoda CTNBio, podendo a Comissão exigir informaçõese testes adicionais. É exigêncialegal para realização de experimentos comOGMs que a instituição interessada disponhada autorização específica da CTNBio para arealização do experimento, de Certificado deQualidade em Biossegurança, ambos publicadosno Diário Oficial da União, e queconstitua Comissão Interna de Biossegurançade acordo com os critérios das InstruçõesNormativas.A elaboração de parecer técnico prévioconclusivo pela CTNBio é regulada pela Lei8.974/95, Decreto 1.752/95, Regimento Internoda CTNBio, além dos procedimentosestabelecidos nas Instruções Normativas. Deacordo com esses procedimentos, o pedidode liberação de OGMs no meio ambiente édistribuído às Comissões Setoriais Específicasda áreas da Saúde, Vegetal, Animal eAmbiental, que emitem pareceres técnicosnas áreas de sua competência, determinandoos critérios e recomendações para a sualiberação ou a indeferindo.O Parecer Técnico Conclusivo emitidopela CTNBio contempla necessariamente osseguintes aspectos da segurança do OGM: a)riscos ao meio ambiente, examinados comespecial atenção pela Comissão Setorial Es-32 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

pecífica da Área Ambiental, presidida pelorepresentante do Ministério do Meio Ambiente;b) riscos do ponto de vista agrícola eanimal, examinados atentamente pelas ComissõesSetoriais Específicas das Áreas Vegetale Animal, presididas pelo representantedo Ministério da Agricultura; c) riscos para asaúde humana, para produção de alimentoscom vistas ao consumo humano, examinadoscom especial atenção pela Comissão SetorialEspecífica da Área de Saúde, presidida pelorepresentante do Ministério da Saúde.Esse parecer é vinculado a todos os atosadministrativos posteriores dos Ministérios,seja quanto ao registro e fiscalização desementes e grãos, na Secretaria de DefesaAgropecuária do Ministério da Agricultura,seja quanto ao registro e fiscalização deprodutos alimentícios, na Agência de VigilânciaSanitária do Ministério da Saúde. Endossa,por fim, o caráter vinculativo do ParecerTécnico Conclusivo quanto à segurança ambientale alimentar dos organismos transgênicos,o disposto no inciso II do art. 2º doDecreto 1.752/95, que atribui competênciaampla à CTNBio para “acompanhar o desenvolvimentoe o progresso técnico e científicona biossegurança e em áreas afins, objetivandoa segurança dos consumidores e da populaçãoem geral, com permanente cuidado àproteção do meio ambiente”.Competências Específicas dosMinistérios da Saúde, daAgricultura e do Meio AmbienteEmitido o parecer técnico prévio conclusivoda CTNBio, cabe aos Ministérios daAgricultura, da Saúde e do Meio Ambiente,no limite de sua competência específica, aatribuição de monitorar e fiscalizar as atividadesrelacionadas aos OGMs - e não se trataaqui de conceder aprovação prévia, que éresponsabilidade da CTNBio, onde essesMinistérios têm assento.Por ocasião do registro e da fiscalizaçãode sementes e grãos, pela Secretaria deDefesa Agropecuária do Ministério da Agricultura,e do registro e da fiscalização deprodutos alimentícios pela Agência de VigilânciaSanitária do Ministério da Saúde, observar-se-á,para efeitos de biossegurança, oParecer Técnico Conclusivo da CTNBio. Oregistro e outras autorizações desses Ministériossão medidas administrativas para fins defiscalização e monitoramento do uso, transporte,armazenamento, comercialização, consumo,liberação e descarte de produtos quecontenham OGMs.Aplicam-se, ainda, as legislações geraisde competência de cada Ministério. Em particular,nos termos da Lei 6.507/77 e doDecreto 81.771/78, cabe ao Ministério daAgricultura promover a fiscalização da produçãoe do comércio de sementes e mudas,e proceder ao registro de sementes e grãos,com o objetivo de garantir a qualidade domaterial produzido e comercializado. Acresceà competência desse Ministério o registrode novas cultivares para fins de comercializaçãoe de proteção dos direitos de propriedadeintelectual, nos termos da Lei 9.456/97 e do Decreto 2.366/98.Apesar de o ato da CTNBio constituirparecer conclusivo de caráter técnico doponto de vista da biossegurança, não é,entretanto, autorizável para determinar oplantio de um vegetal transgênico, cujaresponsabilidade é fundamentalmente dacompetência do Ministério da Agricultura.Vale ainda ressaltar que, segundo asnormas gerais contidas na Lei de Biossegurança(art. 16), compete exclusivamente àCTNBio determinar a paralisação de quaisqueratividades envolvendo OGMs, umavez constatada “a existência de riscos gravespara a saúde do homem e dos animais,para as plantas e para o meio ambiente”.Assim, a interdição de experimentos e deplantios de vegetais geneticamente modificados,mediante determinação da CTNBiopublicada em comunicado no Diário Oficialda União é prerrogativa dos órgãos defiscalização do Ministério da Saúde, doMinistério da Agricultura e do Ministério doMeio Ambiente.Além da interdição e também mediantedeterminação da CTNBio, infrações à Lei8.974/95 poderão ser passíveis de multasem valores superiores a 16.110,80 UFIR,que serão aplicadas pelos órgãos de fiscalizaçãodos Ministério citados.Soja Transgênica “Roundup Ready”Com relação ao caso específico dautilização em escala comercial da cultivarda soja geneticamente modificada “roundup ready” resistente ao herbicida glifosato,requerida pela empresa Monsanto, a CTN-Bio regulamentou, por meio da InstruçãoNormativa nº 18, de 15/12/98, os procedimentosa serem observados para sua liberaçãoplanejada no meio ambiente e seuplantio comercial, por ter entendido que,do ponto de vista da biossegurança, não hárisco ambiental ou para a saúde humana eanimal na utilização da soja em questão.Após três anos de estudos experimentaisrealizados pela empresa interessada,com o acompanhamento da CTNBio, e umano de exaustiva avaliação pela CTNBio, aconclusão favorável acerca da ausência derisco para a segurança ambiental decorrentedo uso dessa soja pautou-se nos seguinteselementos:a) A soja é uma espécie predominantementeautopolinizável, cuja taxa de polinizaçãocruzada é da ordem de 1%. Por tratarsede espécie exótica, sem parentes silvestresno Brasil, não se verifica a possibilidadede ocorrência de polinização cruzadada soja transgênica com espécies silvestresno meio ambiente.b) Existem no Brasil pelo menos trêsespécies conhecidas de ervas daninhasnaturalmente resistentes ao herbicida glifosato.A utilização do glifosato no País, aolongo das últimas duas décadas, não ensejouo aparecimento de outras espécies deervas daninhas a ele resistentes. A introdução,para plantio, do cultivar soja transgênica“round up ready” não aumentará a pressãode seleção sobre as espécies daninhasem termos de concentração de produto/área.c) A soja é uma espécie domesticada,cuja sobrevivência depende em alto grau doser humano. Não há razões científicas parase prever a sobrevivência de plantas derivadasda linhagem em questão fora de ambientesagrícolas. Além disso, na ausência depressão seletiva - no caso, o uso do herbicidaglifosato - a expressão do gene inserido nãoconfere à planta vantagem adaptativa.d) A utilização do herbicida glifosato, deuso rotineiro nas lavouras de soja no Brasil,não teve efeito negativo no processo defixação biológica de nitrogênio, seja quantoao comportamento dos cultivares de sojaexpostos ao herbicida, seja com respeito aocomportamento dos microrganismos fixadoresde nitrogênio. Além disso, o genemarcador nptii, de resistência a antibiótico,não foi transferido para a espécie transgênica.e) Finalmente, ainda quanto à questãoambiental, não há nenhum efeito documentadode variações de comportamento populacionalde insetos benéficos ou de insetospragas decorrente do uso do herbicida citado.Além do exame da segurança ambiental,a CTNBio concluiu que, fora os riscos inerentesao consumo da soja para a parcela dapopulação que apresenta reações adversas àingestão da soja em geral, o consumo da sojatransgênica não consiste risco para a segurançaalimentar, tanto na dieta de humanos,quanto na dieta de animais.MonitoramentoA par de todas as considerações técnicase com o objetivo de assegurar contínuoacompanhamento do produto, a CTNBio,nos termos da melhor conduta de gerenciamentode risco do ponto de vista da biossegurança,decidiu que o uso comercial da sojatransgênica em questão será realizado mediantemonitoramento científico pelo períodode cinco anos, procedendo-se a análises eestudos em plantios comerciais a seremdisponibilizados pela empresa Monsanto. Omonitoramento compreenderá os seguintesaspectos:a) avaliação da variação da composiçãoespecífica da comunidade de plantas daninhasda área.b) avaliação de eventual incidência deplantas daninhas “escape”, determinando sea resistência ao herbicida glifosato resultariada transferência do transgene.c) avaliação periódica da dinâmica populacionalde organismos indicadores: insetos,patógenos e microorganismos fixadoresde nitrogênio e solubilizadores de fosfato.d) a empresa enviará relatório anual àCTNBio, até o dia 15 de junho seguinte aoano agrícola específico.Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 33

e) as áreas de monitoramento serãofranqueadas à auditoria científica pela sociedadecivil organizada interessada, medianteautorização prévia da CTNBio e com apresença de fiscais do Ministério da Agricultura.f) a empresa informará na embalagemdo produto que, eventualmente, os usuáriosda tecnologia poderão receber visitastécnicas da CTNBio.O monitoramento, que, na prática, verificaráqualquer possível efeito adverso decaráter ambiental decorrente do uso doproduto transgênico, consiste, de fato, emgerenciamento de risco e visa a permitirque, a qualquer momento, a CTNBio possaretirar o produto do Sistema Nacional deRegistro de Cultivares e, por conseguinte,do mercado de sementes e da indústria dealimentos, por meio da ação dos órgãos defiscalização e controle do Ministério daAgricultura.Análise de Risco do OGMpara o Meio Ambiente eLicenciamento AmbientalParalelamente à discussão sobre o méritotécnico-científico da decisão tomadapela CTNBio de dispensar a EIA/RIMA paraa soja transgênica “roundup ready”, devidamenteconsubstanciada na Instrução Normativanº 18, de 15/12/98, e no Comunicadonº 54, publicado no D.O.U. de 1º/10/98,Seção 3, pág. 56, tem sido questionadaalguns aspectos da constitucionalidade daaplicação da Lei de Biossegurança e de seudecreto regulamentador, especificamentequanto à dispensa de EIA/RIMA pela CTN-Bio, que passamos a examinar.O art. 225, inciso V, da Constituiçãodetermina que incumbe ao Poder Públicoexigir, na forma da lei, estudo prévio deimpacto ambiental para instalação de obraou atividade potencialmente causadorade significativa degradação do meioambiente. Por outro lado, quanto à análisede risco ambiental, é facultado à CTNBio,nos termos do inciso XIV, do art. 2º doDecreto 1.752/95, “exigir como documentoadicional, se entender necessário, arealização de Estudo de ImpactoAmbiental(EIA) e o respectivo Relatório deImpacto no Meio Ambiente (RIMA) de projetose aplicação que envolvam a liberaçãode OGM no meio ambiente”. O confrontodessas duas disposições da legislação brasileirapermite avaliar a questão da biossegurançados OGMs para o meio ambiente soba ótica de algumas considerações legais.A primeira reflexão diz respeito ao fatode que a Lei de Biossegurança insere-se noCapítulo VI da Constituição Federal de1988 - Do Meio Ambiente, regulando osincisos II e V do § 1º, segundo os quaisincumbe ao Poder Público preservar a diversidadee a integridade do patrimôniogenético do País e fiscalizar as entidadesdedicadas à pesquisa e manipulação dematerial genético; e controlar a produção,a comercialização e o emprego de técnicas,métodos e substâncias que comportemriscos para a vida, a qualidade de vidae o meio ambiente. Uma vez que essa leicria a Comissão Técnica de Biossegurança,na qual têm assento diversos ministérios eorganizações, e lhe confere competênciaespecial no campo ambiental, torna-se claroque a questão ambiental na legislaçãobrasileira não se circunscreve exclusivamenteà esfera de atribuições do Ministériodo Meio Ambiente, ou aos órgãos doSistema Nacional do Meio Ambiente ou aoCONAMA.Outra consideração diz respeito à decisãoda CTNBio de dispensar a exigência deEIA/RIMA - e não de estudos e avaliaçõesde risco ambiental - para a soja “roundupready”. Do ponto de vista científico e dosestudos de risco ambiental examinados eacompanhados ao longo de três anos pelaCTNBio, não apenas à luz das condiçõesespecíficas brasileiras, mas ao longo dosanos em que esse produto já vem sendoavaliado, testado, produzido e utilizado,não apenas no Brasil, mas também nosEstados Unidos, na União Européia, naArgentina, no Canadá e no Japão, não seconstatou qualquer indício de que hajapotencial de significativa degradaçãodo meio ambiente. Só isso já afastaria aexigência de estudo prévio de impactoambiental contida no mencionado art. 225,inciso IV, da Constituição Federal. Ademais,vale ressaltar que os estudos préviosde impacto ambiental a que se refere otexto constitucional não se limitam unicamenteao “EIA/RIMA” regulado pela Resolução237/97 do CONAMA.Uma última consideração quanto aoaspecto ambiental deve ser finalmenteexaminada. O processo de avaliação econtrole de risco ambiental do ponto devista da biossegurança de OGMs, que deveser rigorosamente seguido pelo solicitantede autorização para experimentos comorganismos transgênicos, é minuciosamentedefinido nas Instruções Normativas nº3/96e nº10/98 da CTNBio. Essa regulamentaçãocontém normas detalhadas para avaliaçãoe controle de risco ambiental, bem comode riscos para a saúde humana e animalpelo uso de organismos transgênicos, cujoconteúdo e critérios são substancialmenteequivalentes a um estudo de impacto ambiental,embora não tenham essa denominação.Esses procedimentos de verificação préviade riscos dos transgênicos para a saúdee o meio ambiente, tradicionalmente denominados“avaliação de risco” e “controle derisco” - e não Estudo de Impacto Ambientale Relatório de Impacto no Meio Ambiente(EIA/RIMA) - contêm elementos e procedimentossimilares e a mesma finalidade deproteção e preservação ambiental.Além disso, a Instrução Normativa nº3/96 determina que, no caso de a CTNBioconsiderar que a liberação proposta provocaráefeito negativo no meio ambiente, aencaminhará ao Ministério do Meio Ambiente,que poderá exigir impacto ambiental(EIA/RIMA). Mais uma vez evidencia-se opoder discricionário do Poder Público -representado pela CTNBio - que, com baseem evidências e estudos científicos, avaliaráse cabe ou não exigir do interessado arealização de EIA/RIMA. Logo, se, na avaliaçãocientífica de risco da CTNBio, o órgãopúblico sobre o qual recai esse poder discricionário,e se nào constatar que não há riscode dano significativo ao meio ambiente quejustifique a elaboração de um EIA/RIMA,este não será exigido do interessado.Cabe ainda observar que, à luz do § 4º,do art. 24 da Constituição Federal, segundoo qual “a superveniência de lei federalsuspende a eficácia da lei estadual no quelhe for contrário”, uma vez que esse estudoseja dispensado pela instância federal competente,a CTNBio, não poderá uma leiestadual requerê-lo.Considerações finaisA CTNBio foi criada em 1995 por uma leidemocraticamente aprovada pelo CongressoNacional e, desde sua instalação, em junho de1996, pauta sua ação pelo estrito cumprimentoda Lei de Biossegurança. Toda a ação quea CTNBio se propõe a realizar está calcada noentendimento de que o Estado moderno nãopode prescindir da transferência do conhecimentoe do seu uso em benefício do homeme da sociedade, mediante processos adequadosde biossegurança. Esse princípio da precaução- concretizado entre nós pela própriaexistência da Lei de Biossegurança e da CTN-Bio - reflete-se hoje na postura que a sociedadebrasileira adotará doravante em face datecnologia transgênica.Nesse contexto, quando a biotecnologiavem-se tornando, cada vez mais, instrumentopara solução de problemas relacionados, sobretudo,com saúde e alimentação humana, éfundamental que a legislação brasileira debiossegurança seja adequadamente implementadae que a CTNBio continue a orientarinstituições de pesquisa e empresas quanto aoscritérios e procedimentos de biossegurança,como também a a esclarecer a preocupação dapopulação brasileira acerca de eventuais riscosassociados a OGMs.Ao presenciarmos o debate acirrado acercada conveniência ou não de permitirmos aentrada de produtos transgênicos no Brasil, épreciso ter-se discernimento quanto às questõeseconômicas, as questões legais, as questõespolíticas e as questões científicas, de modoque não se permita que os aspectos políticos eeconômicos venham a obscurecer ou deturpara legalidade e a legitimidade da ComissãoTécnica Nacional de Biossegurança, refletidana transparência de seus procedimentos, nacompetência de seus cientistas, na correção eseriedade com que as questões de segurançacientíficas são por ela abordadas.34 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

AGROCERES

ALGODÃO COLORIDOElêusio Curvelo FreirePesquisador da Embrapa Algodão-Campina Grande, PBAGRICULTURAFotos: Eleusio Curvêlo FreireO ALGODÃO COLORIDO NO BRASILORIGEMO algodão colorido foi desenvolvidopelos incas e astecas há 4.500 anos, bemcomo por outros povos antigos das Américas,Ásia, África e Austrália. Já foramidentificadas 39 espécies silvestres de algodãocom fibras coloridas. Na maioriadessas espécies primitivas, o algodão possuifibras coloridas, principalmente na tonalidademarrom. Porém, já foram descritosalgodões coloridos em tonalidadesverde, amarela, azul e cinza. Esss algodões,por longos períodos, foram descartadospela indústria têxtil mundial e atémesmo foi proibida sua exploração emvários países por serem considerados comocontaminação indesejável dos algodões detonalidade branca normal. Esses tipos coloridosforam preservados pelos povosnativos e nas coleções de algodão emvários países. No Brasil, foram coletadasplantas de algodoeiros asselvajados, nastonalidades creme e marrom, em misturascom algodoeiros brancos cultivados, dasespécies G. barbadense L. e G. hirsutum L.Miscelânia de cores do algodãotrabalhado na EmbrapaTabela 1 - Herança de cor da fibra do algodão.Símbolo do gene Coloração da fibra Espécie de GossypiumLd 1kLc 2BLc 2kLc 2MLc 2vLc 3BLc 4kD wLg 1Lc 2LcFONTE: Endrizzi et al (1984)CaquiMarrom clarocaquiMarrom médioMarrom muito claroMarrom claroCaquiBranco sujoVerdeMarromMarromraça, marie galante Hutch, conhecidoscomo algodões arbóreos. Esses algodõescoloridos tinham uso apenas artesanal ouornamental, principalmente nos Estadosda Bahia e Minas Gerais. Inicialmentepassaram a ser preservados em bancos degermoplasma da Embrapa Algodão, emPatos-PB, desde 1984. A partir de 1989, foiiniciado o trabalho de melhoramento genético,após uma visita de empresáriostêxteis japoneses, que demonstraram interesseem adquirir aquele tipo de fibra.A HERANÇA DA COR DA FIBRAArboreum e herbaceumArboreum e herbaceumArboreum e herbaceumArboreum e herbaceumArboreum e herbaceumArboreum e herbaceumArboreumRaimondiiHirsutumHirsutumBarbadense, Darwinii eTomentosumRegiãoÁfrica e AfroásiaÁfrica e AfroásiaÁfrica e AfroásiaÁfrica e AfroásiaÁfrica e AfroásiaÁfrica e AfroásiaAfroásiaAméricaAméricaAméricaAméricaA herança da coloração da fibra normalmenteé controlada por um gene dominante,mas com alelos em locus diferentes.O gene verde é controlado pelos alelos deum único locus Lg, encontrado no cromossomo15 do genoma D do algodão americano(G. hirsutum).O gene que controla a coloração marromem suas várias tonalidades é encontradonos algodões do velho e do novomundo, com vários alelos identificados.(Tabela 1). Sendo a cor do algodão controladapor genes maiores, o melhoramentodessa característica é simples, porém nãoprescinde de autofecundação controladapelo melhorista, para evitar segregaçõesou contaminações indesejáveis. Por outrolado, algumas tonalidades de cores sãofortemente influenciadas pelo ambiente(luz solar, tipo de solo, ano). Entre astonalidades de cores, a verde é a maisinfluenciada pelo ambiente, enquanto acreme e a marrom são as mais estáveis.O PROCESSO DE MELHORAMENTOInicialmente foi efetuada uma avaliaçãoda produtividade e das característicasdas fibras dos 11 acessos de algodão arbóreocolorido existentes no Banco de Germoplasma.Constatou-se que o compri-

Tabela 2 - Características médias das novas linhagens de algodão colorido. Touros, RN - 1998.Linhagem RendimentoComprimentokg/haS.L. 2,5 %CNPA 95-3BCNPA 96-713CNPA 96-871CNPA 96-426CNPA 96-703CNPA 96-729CNPA 96-802CNPA 96-816CNPA 96-974CNPA 96-1016CNPA 96-1029MédiaF.CV%1.982 ab2.510 a1.268 b1.841 ab1.715 ab1.425 b1.755 ab1.377 b1.488 b1.754 ab1.470 b1.6893,0*24,11ªFlor(dias)60 ab61 ab61 a59 b61 a60 ab59 ab60 ab60 ab61 ab60 ab602,4*1,71ªCapulho(dias)111 b116 ab114 ab112 ab113 ab115 ab113 ab118 a115 ab112 ab112 ab1141,9 ns2,3P. 100Sementes(g)9,2 abc9,0 abc8,0 c10,0 a8,5 bc9,9 a9,5 ab8,7 abc9,1 abc9,3 abc8,1 c9,05,6**6,1%deFribra38,438,638,038,239,937,939,839,538,638,639,338,80,7 ns4,5P. 1Capulho(g)3,73,43,44,23,33,74,03,43,23,63,53,61,3 ns14,125,8 ab25,7 ab24,8 b27,6 ab25,9 ab28,3 a26,4 ab26,1 ab25,1 ab24,9 b26,6 ab26,12,6*5,1Uniformidade(%)45,8 ab45,6 ab46,5 ab48,3 a46,8 a42,3 b46,4 ab46,6 ab46,7 ab46,7 a46,4 ab46,22,7**3,8Resistênciagf/tex22,1 abc21,5 abc21,5 abc24,2 a23,0 abc18,0 bc23,9 ab22,0 abc21,8 abc17,7 c19,3 abc21,43,1**11,6Finura(Micronaire)4,0 ab4,3 a4,3 a4,1 ab3,9 ab3,5 b3,9 ab4,1 ab4,3 ab4,2 ab3,9 ab4,12,5*7,8Elongação(%)5,35,15,45,55,34,85,75,25,15,15,25,31,5 ns7,6mento das fibras dos acessos coloridosvariou de 25,9 a 31,6mm; a resistência eramuito fraca, com 60% dos materiais variandode 19,5 a 21,7 gf/tex, o que impossibilitariasua industrialização em fiações modernas,que exigem algodões de alta resistência.As fibras eram também excessivamentefinas e de baixa uniformidade. Aprodutividade, no campo variou de 294 a1.246 kg/ha.Foi determinado como objetivo doprograma de melhoramento elevar a resistênciadas fibras, a finura, o comprimentoe a uniformidade, bem como estabilizar acoloração das fibras nas tonalidades cremee marrom e elevar a sua produtividade nocampo. Utilizou-se primeiramente, o métodode seleção individual com teste deprogênies, e, posteriormente, o método dehibridação seguido de seleção genealógica,para se obter variações nas tonalidadesde cores. A partir de 1996, foram incluídosnas pesquisas algodões de coloração verdee procuradas novas combinações decores, por meio de cruzamentos dos algodõesmarrom, creme e verde. O método deseleção individual com teste de progêniesconsistiu em separar plantas coloridas nas11 entradas originais que constituiam oBanco de Germoplasma, de modo quepropiciasse a análise das característicasagronômicas e das fibras de cada uma dasplantas eleitas. Por meio desse métodoforam obtidas e estudadas 1.085 plantas,que resultaram em 217 linhas de progêniesde tonalidades creme a marrom. O métodode hibridação foi utilizado para obter novavariedade e combinação de cores diferentes,pelo do cruzamento dos algodoeirosnativos do Brasil, de coloração creme emarrom, com as cultivares americanasArkansas Green (verde) e Texas (marromintenso). Esses cruzamentos estão nasgerações F2 e F3 e irão resultar cultivarescom tonalidades de cores mais variadasem futuro próximo.Outra opção que foi utilizada pelaEmbrapa para a obtenção de cultivares dealgodão colorido foi a introdução dosgenes que controlam a coloração verde,na cultivar comercial mais plantada noNordeste (CNPA 7H), por meio da técnicade retrocruzamentos. Para isso, foramefetuados três ciclos de retrocruzamentosutilizando-se a cultivar Arkansas Greencomo progenitor doador e a CNPA 7Hcomo progenitor recorrente.Nos últimos três anos, foram estudadas217 progênies, 35 novas linhagens e22 linhagens avançadas de algodão colorido,nos municípios de Patos e Monteiro,na Paraíba e Touros, no Rio Grande doNorte.Tabela 3 - Características médias das linhagens avançadas de algodão colorido. Touros, RN - 1998.Linhagem RendimentoComprimentokg/haS.L. 2,5 %Bulk CNPA 95-3BCNPA 95-130CNPA 95-653CNPA 95-709CNPA 95-813CNPA 95-816Bulk Creme ENL 789CNPA 771/92-1139MCNPA 95-4BCNPA 92-127MédiaF.CV%2.912 ab3.534 a2.398 bc2.142 bc1.904 c2.191 bc2.629 bc2.688 bc2.302 bc2.396 bc2.5097,2**13,71ªFlor(dias)59595958585859575858587,0 ns7,81ªCapulho(dias)112 ab110 b113 ab113 ab112 ab113 ab111 b111 ab111 b114 a1123,2**1,3P. 100Sementes(g)10,1 ab10,4 a8,8 b9,2 ab10,0 ab9,4 ab9,7 ab8,9 b8,9 b9,2 ab9,43,9**6,0%deFribra35,133,537,235,833,834,034,833,637,437,635,62,5*5,5P. 1Capulho(g)4,0 ab4,2 ab3,6 ab3,9 ab4,5 a4,0 ab3,7 ab3,7 ab3,4 b4,3 ab3,93,0**9,825,628,626,527,928,828,126,925,526,326,927,11,6 ns7,1Uniformidade(%)48,1 ab48,3 ab50,9 a49,8 ab48,7 ab45,0 b47,9 ab49,6 ab48,8 ab47,1 ab48,41,8 ns4,9Resistênciagf/tex19,321,520,319,520,220,018,721,818,019,119,82,0 ns8,5Finura(Micronaire)3,83,63,54,14,03,54,23,93,73,83,81,9 ns8,9Elongação(%)7,07,27,77,16,26,57,57,47,27,17,116 ns9,9Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 37

Tabela 4 - Características tecnológicas de fibras das linhagens de algodão colorido eleitas para multiplicação. Touros-RN. 1998.LinhagemVariedades Coloridas:CNPA 95-653 1CNPA 92-1139 2Variedades Comerciais brancas:ITA 90CNPA 8HComprimentoS.L. 2,5 %27,628,7Uniformidade(%)44,146,6Resistênciagf/tex20,522,6Alongamento%5,35,829,929,151,347,127,026,05,85,71- Produtividade de 2.400 kg/ha e rendimento de fibra de 37,2%, sob condições irrigadas.2- Produtividade de 2.690 kg/ha e rendimento de fibra de 36,6%, sob condições irrigadas.Finura3,94,03,83,6FiabilidadeCSP1806188123072212Resistênciagf/tex14,114,0414,9214,32Fio Singelo - 27 TexAlongamento Coeficiente% Torção4,85,06,55,33,313,513,473,49RESULTADOS OBTIDOS COM APESQUISA DE ALGODÃO COLORIDOAVALIAÇÃO AGRÍCOLACom o processo de melhoramentocontínuo, as linhagens avaliadas em1997,em Patos e Monteiro, PB, apresentaramprodutividade em torno de 1.500 kg/ha, resistência de fibras na faixa de 23 a 25gf/tex, finura fina (I.M.) de 3,4 , comprimentode fibra (S.L. 2,5%) de 29,5mm euniformidade de 48,0%. A produtividademédia no campo supera a de cultivares dealgodoeiro mocó precoce em mais de 50%.Por outro lado, com essas característicasde fibras, os algodões coloridos melhoradospodem ser processados por indústriastêxteis modernas. Nas avaliações de fiosdo algodão colorido de títulos 16Ne e20Ne, obteve-se resistência do fio de 13,5e 12,3 gf/tex, respectivamente; alongamentode 6,9; e 56 pontos finos/km e 112pontos grossos/km; índices que confirmama boa qualidade do fio.Em 1998, para fugir da seca que afetoutodo o Nordeste, a pesquisa foi conduzidasob condições irrigadas, utilizando-se pivôcentral, no município de Touros-RN. Nessascondições, foram avaliadas 46 progênies,11 novas linhagens e 10 linhagensavançadas de algodões coloridos. As característicasmédias das novas linhagensestudadas estão apresentadas na Tabela 2,onde podem ser observadas as característicasmédias das 4 linhagens eleitas (CNPA96-713, CNPA 96-426, CNPA 96-703 e CNPA96-802) para continuidade das pesquisas.Essas linhagens apresentaram resistênciaque variam de 21,5 a 24,2 gf/tex, finura de3,9 a 4,3, comprimento comercial na faixa28-30mm a 30-32mm, alta produtividade(1.715 a 2.510 kg/ha) e alto rendimento defibras (38,2 a 39,8%).Os resultados do ensaio de linhagensavançadas, onde estão sendo avaliados osmateriais em fase pré-comercial, estãoapresentados na Tabela 3. Nesse ensaio,foram escolhidas as linhagens CNPA 95-653 e CNPA 92-1139 M para aumento desementes, com vistas a um possível lançamentodelas como novas cultivares, devidoao equilíbrio das características agronômicase tecnológicas das fibras dessaslinhagens. Esses dados confirmaram resultadossemelhantes obtidos nos anos de1996 e 1997 com essas linhagens e sãoindicadores de que elas podem ser plantadascomercialmente.AVALIAÇÃO INDUSTRIALCom as fibras coloridas obtidas em1997 foram produzidos fios de título 20Nee confeccionados tecido de malha e 50camisetas para avaliação da qualidade dotecido produzido a partir do algodão coloridonordestino. A malha e os testes industriaisforam processadas no CERTTEX/SENAI em Paulista, Pernambuco. Foramefetuados ensaios de solidez de cor; estabilidadedimensional da malha (encolhimento)e resistência do tecido ao Pilling.Os resultados obtidos comprovaram que amalha colorida apresentou boa solidez decor nos níveis de cloro de 0,01% e 0,1%,com grau 4; boa solidez de cor a fricção,com graus 4 a 5; boa solidez de cor ao suor,grau 4-5; boa solidez da cor a lavagem,grau 3-4; e alta resistência do tecido aoPilling, grau 5. Esses dados são uma evidênciade que o tecido obtido com essealgodão possui qualidade e estabilidadede coloração, semelhante aos tecidos coloridosartificialmente.Neste ano de 1999, estão sendo efetuadostestes de desempenho industrial doalgodão colorido na indústria EMBRATEX;do Grupo Coteminas, sediada em CampinaGrande, na Paraíba. Para isso, foram fornecidosdois fardos de pluma, os quais estãosendo processados em equipamentos industriaisde série para produção de fio detítulo Nec 25,25; confecção de malha e decamisetas. A produção industrial do fiocolorido na fiação da EMBRATEX apresen-

tou resultados considerados satisfatóriospelos engenheiros têxteis da empresa. Ofio de algodão colorido apresentou tenacidadede 11,4 CN/Tex, elongação de 3,9%e força máxima de 2,66 N, 10 pontos finos/km e 18 pontos grossos/km.PERSPECTIVAS DOALGODÃO COLORIDOA pesquisa encontra-se na fase deescolha final de uma das linhagens paraaumento de sementes e lançamento deuma cultivar de fibras coloridas, o quedeverá ocorrer em um ou dois anos. Assementes foram aumentadas em áreas irrigadasno município de Touros e Ipanguaçu,no Rio Grande do Norte, com colheitaem novembro de 1998. Entre as dez linhagensavançadas coloridas estudadas, foramescolhidas uma de coloração marrompara plantio no Campo Experimentalde Patos,-PB, comvistas a apresentá-la aos produtoresem julho, e uma decoloração creme para plantiosob condições irrigadas, emTouros-RN, para apresentá-laaos produtores em novembro/99.As características tecnológicasdas duas linhagensescolhidas estão apresentadasna Tabela 4.Pretende-se concluir ostestes de avaliação do desempenhoindustrial até o final de1999, com divulgação dos resultadosem conferência têxtilprogramada para o ano2000.A região indicada para plantio de algodãoarbóreo colorido inicialmente seráaquela zoneada para cultivo do algodoeiroarbóreo no Nordeste, podendo, no futuro,a produção desse algodoeiro se expandirpara outras regiões.O mercado para o algodão coloridoainda é restrito, sendo o produto consumidopor pessoas alérgicas a corantes sintéticos,grupos ambientalistas e ONGs quedesenvolvem trabalhos com agriculturaorgânica. Os preços obtidos com o algodãocolorido no mercado internacionalvariam de US$ 3,79 a US$ 5,00 / kg de fibraverde e de US$ 1,84 a US$ 3,35/kg de fibramarrom, o que propicia alta margem delucro aos produtores, quando comparadocom o algodão de fibra branca, que alcançapreços médios de US$ 1,65/kg de fibra.Por outro lado, o desenvolvimentogenético de outras tonalidades de cores eos testes industriais processados com osalgodões coloridos podem abrir novosmercados, inclusive para o algodão coloridoorgânico (algodão produzido sem utilizaçãode fertilizantes, inseticidas ou outrosinsumos químicos artificiais), bem comoindustrialização sem o uso de corantessintéticos, para resultar num produto ecologicamentelimpo, sem agressões ao homeme ao ambiente.ALGODÃO COLORIDO VERDESimultaneamente ao desenvolvimentodo algodão colorido marrom, foram produzidosretrocruzamentos para incorporaçãoda coloração verde na cultivar dealgodão anual mais cultivada no Nordeste(CNPA 7H). Após a série de três retrocruzamentos,foram retiradas progênies queestão em fase de seleção e avaliação tecnológicade fibras e fios. Pretende-se até ofinal do ano 2000, colocar à disposição dosprodutores sementes de uma cultivar dealgodoeiro anual de fibra verde, derivadada CNPA 7H.UTILIZAÇÃO DA BIOTECNOLOGIAPARA A PRODUÇÃO DOALGODÃO COLORIDOOs avanços obtidos até então com oalgodão colorido decorreram da exploraçãodo germoplasma natural do algodão,por meio de métodos tradicionais de melhoramentogenético. O uso da biotecnologiade transferência de genes que controlama expressão de várias tonalidadesde cores, das espécies selvagens de algodãopara as cultivares modernas, já constituium dos objetivos das empresas debiotecnologia que trabalham com algodão,no mundo, o que pode resultar emavanços tecnológicos e em economia detempo e recursos na obtenção das futurascultivares de algodão colorido.RECURSOS APLICADOSNA PESQUISANo período de desenvolvimento destapesquisa, foram aplicados, aproximadamente,R$ 60.000,00 oriundos do CNPq eR$ 100.000,00 da Embrapa, num montantetotal de R$ 160.000,00, referentes ao custeiode pesquisa. A esses recursos devemser acrescentadas as despesas referentesaos salários do pessoal envolvido, o queeleva o custo total da pesquisa para R$355.000,00, no período de 10 anos dapesquisa.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASENDRIZZI, J.E.; TURCOTTE, E.L. eKOHEL, R.J. Quantitative genetics, cytologyand cytogenetics. In: Cotton. Ed. R.J.KOHEL e C.F. LEWIS. Madison: AmericanSociety of Agronomy, 1984. p.82-131.EMBRAPA. O algodão colorido no Brasil.Campina Grande: EMBRAPA-CNPA,1998 (folder).FREIRE, E.C.; SANTANA, J.C.F. de;GUSMÃO, J.L. de e SILVA, J.A. da. Característicase potencialidades doalgodão colorido do Nordestedo Brasil. In: Conferênciainternacional Têxtil/Confecção, I, 1995. Rio deJaneiro. Anais... Rio de Janeiro,SENAI/CETIQT, 1995.p. 16-22..FREIRE, E.C.; ANDRA-DE, F.P. de; FARIAS, F.J.C.;COSTA, J.N. de; MOREIRA,J. de A.N.; VIEIRA, R. de M.;FARIAS, R.H. de. Melhoramentodo algodão coloridono Nordeste do Brasil. CampinaGrande: EMBRAPA-CNPA, 1997. 6p. (EMBRA-PA-CNPA, Pesquisa em Andamento,49).FREIRE, E.C. Brasil já produz algodãoorgânico. Textilia, v. 5, nº 18, 1995. p. 68.ICAC RECORDER. Washington: InternationalCotton Advisory Committee. v.10,nº 4, 1992.ICAC RECORDER. Washington: InternationalCotton Advisory Committee, v.11,nº 4, 1993.INTERNATIONAL COTTON ADVI-SORY COMMITEE. Cultivo del algodonorganico: ICAC Recorder, Washington, v.14,nº 4, p. 55-81, 1996.WANDERLEY, M.J.R.; SANTANA, J.C.F.de; LIMA, M. do S.N.; FREIRE, A. de F.Fiabilidade das novas linhagens do algodoeiroarbóreo de fibra colorida em funçãode suas características físicas. In: CongressoBrasileiro de Algodão, I. 1997. Fortaleza.Anais.. Fortaleza: MA/SDR/EMBRA-PA, 1997. p.608-612.KATZ, D.; BOONE, N.; UREELAND,J.M. Jr. Organically grown and naturallycolored cotton: A global overview. In:Beltwide cotton conferences, 1997. Neworleans. Proceeddings... New Orleans:National Cotton Council, 1997. p. 293-297.Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 39

Extração de DNA de plantasAGRICULTURAEduardo Romano, Biólogo Molecular, M.Sc.Ana Cristina Miranda Brasileiro, Bióloga Molecular, Ph.D.CENARGEN/Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.romano@cenargen.embrapa.brSOLUÇÕES PARA PROBLEMAS COMUMENTE ENCONTRADOSisolamento de DNA deplantas e de material vegetalproveniente de culturade tecidos é umaetapa importante na análise da estruturae organização do genoma deplantas. Essas análises necessitam,freqüentemente,usar enzimas de restrição,que cortam o DNA em fragmentos,para ser que é utilizado emSouthern blot ou em construção debibliotecas genômicas. Preparaçõesde DNA vegetal também são, comumente,utilizadas como substratosem reações de PCR para estudosfilogenéticos ou no desenvolvimentode marcadores moleculares comoos microsatélites e os gerados porRAPD. Independente do tipo de estudomolecular, as preparações deDNA devem produzir amostras purassuficientes para não inibir ostratamentos enzimáticos ou causarinterferências nos padrões de migraçãoem gel de eletroforese.Algumas considerações são importantesna obtenção de DNA deboa qualidade e devem ser atendidasindependente do método utilizado.1) As paredes celulares devemser rompidas com o objetivo de liberaros constituintes celulares. Essaetapa é realizada geralmente pelocongelamento do tecido vegetal emnitrogênio líquido e posterior quebramecânica, com o auxílio de umpilão e de um almofariz, no caso deextração em larga escala. Para extraçãoem pequena escala, utiliza-se umpequeno bastão de vidro e um tuboFigura 1: Esquema representativo das etapas de extração deDNA pelo método CTAB.de microcentrífuga. Nesse caso, aspreparações freqüentemente se destinama reações de PCR e podem serrealizadas somente na presença detampão de extração, sem a adição denitrogênio líquido.2) As membranas celulares devemser rompidas para liberação doDNA. Essa etapa é realizada pelaação de um detergente como SDS(dodecil sulfato de sódio) ou CTAB(brometo de cetiltrimetilamônio).3) Deve-se evitar a ação de DNAses,que podem degradar o DNA.Com esse propósito, os tampões deextração possuem pH por volta de8,0, enquanto o pH ótimo para açãode DNAses endógenas fica por voltade 7,0. Outro expediente empregadoé a adição de EDTA (ácido etilenodiamono tetracético) no tampão deextração. O EDTA é uma substânciaquelante de cátions divalentes, comoMg +2 e Ca +2 e, portanto, inibe a açãode DNAses, que usam esses metaiscomo cofatores (Sambrook et al.,1989).4) Ácidos nucléicos devem serseparados das proteínas. Para tanto,realiza-se de uma a várias extraçõescom fenol e/ou clorofórmio, que desnaturamas proteínas tornando-as insolúveisà fase aquosa, onde se encontramos ácidos nucléicos.5) O DNA deve ser protegido daação de compostos fenólicos, queoxidam o DNA irreversivelmente, tornandoeste inacessível às enzimas derestrição. A contaminação por compostosfenólicos pode ser evidenciadapela coloração do DNA que tendea ficar marrom. Para evitar o efeitooxidativo dos polifenóis, deve seradicionado ao tampão de extraçãoagentes anti-oxidantes, como PVP(polivinilpirrolidona), BSA (albuminade soro bovino) ou β-mercaptoetanol.40 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

6) Os ácidos nucléicos devem serseparados de polissacarídeos. Essesinibem a ação de enzimas de restrição(Shioda & Marakami-Muofushi, 1987)e tornam a amostra de DNA excessivamenteviscosa, interferindo na migraçãodo DNA em corridas eletroforéticas.O detergente CTAB é utilizadocom essa finalidade, já que polissacarídeose ácidos nucléicos possuemsolubilidade diferenciada na presençadesse detergente. Polissacarídeostambém podem ser removidospelo emprego de gradiente de cloretode césio (CsCl).Vários autores descrevem problemasno isolamento e purificação deDNA vegetal de boa qualidade (parauma revisão ver: Rogers & Bendich,1994). Esses problemas são resultantesprincipalmente do co-isolamento depolissacarídeos, substâncias fenólicas ecompostos secundários.O método mais utilizado com sucessopara diferentes espécies é o baseadono uso do detergente CTAB. Essedetergente solubiliza as membranas,formando com o DNA um complexoque facilita uma posterior precipitação(Weising et al., 1995). A maioria dosTabela 1: Problemas comumente encontrados durante o isolamento de DNA de plantas;possíveis causas e soluções.Problema encontradoAmostra de DNA marrom oumuito escura.Amostra de DNA com aspectogelatinoso e excessivamenteviscoso.O DNA, antes da digestão comenzimas de restrição, apresentaarraste vertical no gel.O DNA apresenta forma cônica nogel, em direção ao pólo positivo.Após a corrida, muito DNA retidono poço do gel.Após digestão com enzima derestrição, a amostra apresentauma corrida com muito DNA naslaterais e pouco DNA no centro.O DNA no gel apresentacontaminação com RNA.CausaContaminação por polifenóis.Contaminação porpolissacarídeos.DNA degradado por contaminaçãopor DNAses ou por quebramecânica durante a extração comclorofórmio.Excesso de DNA aplicado no gel.Contaminação porpolissacarídeos.Contaminação porpolissacarídeos.Contaminação porpolissacarídeos.Excesso de DNA aplicado no gel.Contaminação por RNA.SoluçãoAdição de PVP-40 e/ou BSA no tampãode extração, a concentração de 1 a 2%.Aumento da concentração de ß-mercaptoetanol para até 5%.Purificação da amostra em gradientede CsCI ou por precipitação comacetato de amônio.Extrato de DNA via núcleos celulares.Verificar o pH do tampão de extração.Este deve estar por volta de 8,0. Se opH estiver por volta de 7,0 facilitará aação de DNAses durante a extraçãoMistura das fases aquosa e declorofórmio menos vigorosamente.Aplicar menos DNA no gel.Purificação da amostra em gradientede CsCI ou por precipitação comacetato de amônio;Extração de DNA via núcleos celulares.Purificação da amostra em gradientede CsCI ou por precipitação comacetato de amônio;Extração de DNA via núcleos celulares.Purificação da amostra em gradientede CsCI ou por precipitação comacetato de amônio;Extração de DNA via núcleos celulares;Aplicação de menos DNA no gel.Adicionar RNAse A, a uma concentraçãofinal de 100µg/mL e incubar a37ºC por 20 minutos.protocolos descritos na literatura utilizamo protocolo CTAB padrão, comalgumas modificações, com vistas aresolver problemas específicos daespécie em estudo. Outros protocolosfreqüentemente empregados sãovariações do descrito por Dellaportae colaboradores (Dellaporta et al,1983). Esses métodos se fundamentamna precipitação simultânea deproteínas e polissacarídeos na presençade SDS e altas concentraçõesde acetato de potássio. Outro métodoutilizado é a extração de DNA pormeio de núcleos celulares. Essa estratégiaé baseada em uma préviaseparação dos núcleos dos outrosconstituintes celulares. Esse procedimentopode resolver o problema deco-isolamento de constituintes indesejáveis,como os polissacarídeos epolifenóis citoplasmáticos. A principaldesvantagem deste método éque a extração de núcleos a partir dematerial congelado é muito ineficiente.Outra desvantagem é que essemétodo é mais laborioso do que ospreviamente mencionados. As preparaçõesde DNA obtidas por qualquerum desses métodos podem sofreruma posterior purificação porcentrifugação em gradiente de densidadede CsCl. Essa purificação,apesar de laboriosa, é eficiente naremoção de RNA, polissacarídeos,proteínas e outros contaminantes daamostra de DNA. Outra estratégiapara purificação do DNA isolado é aprecipitação com acetato de amônio.Essa estratégia é mais rápida, porémo DNA purificado é de menor qualidade.Nesse artigo descrevemos um protocoloCTAB padrão utilizado comsucesso em nosso laboratório, emdiferentes espécies, e dois protocolosde purificação (gradiente de CsCle acetato de amônio). Apresentamostambém uma tabela (tabela 1), ondesão identificados os problemas comumenteencontrados na extraçãode DNA por meio do protocolo CTAB.Dessa forma, o leitor poderá identificaro problema e tentar fazer asmodificações necessárias para melhorara qualidade do DNA. Na tabela2, estão listadas algumas espéciesvegetais para as quais foram necessáriasadaptações de protocolos básicos,visando à resolução de problemasespecíficos.Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 41

Tabela 2 - Principais espécies vegetais para as quais foram necessárias adaptações de protocolosbásicos, visando à resolução de problemas específicos (adaptado de Weising et al. 1995).Espécie vegetalAbies alba (abeto)Betula alba (bétula)Glycine max (soja)Gossypium hirsutum (algodão)Fragaria x ananassa (morango)Helianthus annus (girassol)Hordeum vulgare (cevada)Ipomoea batatas (batata-doce)Linum usitatissimum (linho)Lycopersicon esculentum (tomate)Musa acuminata (bananeira)Nelumbo spp. (lótus)Nicotiana tabacum (fumo)Oryza sativa (arroz)Picea abies (aberto)Pisium sativum (ervilha)Prunus persica (pessegueiro)Saccharum spp. (cana-de-açúcar)Solanum tuberosum (batata)Theobroma cacao (cacaueiro)Vicia faba (fava)Vitis vinifera (videira)Zea mays (milho)ProtocolosIsolamento de DNA total de plantasutilizando-se o método CTAB(Figura 1)1. Pese 3 g do material vegetal a seranalisado (calos, folhas, plântulas etc.),de preferência fresco, e transfira paraum almofariz contendo com nitrogêniolíquido. Com o auxílio de um pilão,Para maiores informações sobre técnicasde isolamento e análise de DNA deplantas, consulte o "Manual de TransformaçãoGenética de Plantas" (Brasileiro& Carneiro, 1998). Nele são apresentadasdiferentes técnicas utilizadasna transformação de plantas, assimcomo experimentos para a detecçãode genes repórteres e análise molecularesda integração de genes em plantas.Para adquirir o manual, acessar viaInternet a home page da Embrapa noendereço:http://www.spi.embrapa.brProtocolosutilizandotampões CTABXXXXXXXXXXXProtocolos baseados naprecipitação deproteínas epolissacarídeos comaceato de potássio/SDS(Dellaporta)XXXXXProtocolosenvolvendo oisolamento denúcleoXXProtocolosmistosXXXXXpulverize o material até se obter umpó fino.2. Transfira rapidamente o pó obtidopara um tubo de polipropilenode 50 ml que contenha 15 ml detampão CTAB [CTAB 2% (p/v); NaCl1,4 M; Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; EDTA20 mM; β-mercaptoetanol 0,2% (v/v)]pré-aquecido a 65 o C. Feche o tubo emisture gentilmente até o pó ficarhomogeneamente distribuído.3. Incube as amostras em banhomariaa 60 o C por 30 minutos, agitandoocasionalmente o tubo para mantero extrato ressuspendido.4. Retire o tubo do banho-maria eespere que a mistura atinja a temperaturaambiente. Adicione 15 ml declorofórmio:álcool isoamílico (24:1;v/v). Feche o tubo e misture manualmentepor 10 minutos.5. Centrifugue a 5.000 g por 10minutos a temperatura ambiente, paraseparar a fase orgânica da aquosa.6. Remova a fase aquosa (fasesuperior) para um tubo novo de 50XXXXXXXXXml. Evite pegar qualquer proteínadesnaturada presente na interface.7. Repita a extração comclorofórmio:álcool isoamílico maisuma ou duas vezes (etapas de 4 a 6),levando em consideração que maisextrações podem tornar a amostramais pura, porém com maiores perdasde DNA.8. Adicione RNAse A a uma concentraçãofinal de 100 µg/ml e incubea 37 o C por 30 minutos. Essa etapa éopcional e contribui para aumentar apureza da sua amostra.9. Adicione 0,6 volume de isopropanolou 2,5 volumes de etanol absoluto,ambos a -20 o C. Misture suavementeaté formar um precipitado.10. Se o complexo DNA-CTABobtido formar uma rede de filamentosvisíveis, recupere o DNA com oauxílio de uma pipeta. Caso o DNAnão forme uma rede visível, centrifuguea amostra a 10.000 g por 20minutos. Em uma boa preparação, oDNA não deve estar escuro. Sempreque possível, evite a etapa da centrifugaçãopara não co-precipitar o DNAe polissacarídeos.11. Descarte o sobrenadante elave o precipitado com 5 ml de etanol70% (v/v). Caso o precipitado se soltedurante a lavagem, repita a etapa dacentrifugação por 3 minutos(etapa10).12. Descarte o sobrenadante eseque o precipitado invertendo o tuboem um papel-toalha.13. Dissolva o precipitado em 500µl de tampão TE (Tris-HCl 10 mM, pH8,0; EDTA 1 mM) e incube a 4 o C pormeia hora ou mais. A amostra podeser então armazenada a -20 o C.14. Uma purificação posterior podeser realizada por tratamento com acetatode amônio ou por gradiente decloreto de césio .Purificação de DNA total deplantas por tratamentocom acetato de amônio1. Dissolva o DNA isolado em 1,0ml de tampão TE (Tris-HCl 10 mM, pH8,0; EDTA 1 mM) e adicione 500 µl deacetato de amônio a 7,5 M.2. Feche o tubo e misture suavementepor inversão para homogeneizara solução. Incube no gelo por 15minutos.3. Centrifugue por 30 minutos a10.000 g a 4 o C. Transfira o sobrena-

dante para um novo tubo.4. Adicione 2 volumes de etanolabsoluto ao sobrenadante e misturesuavemente por inversão. Incubepor 1 hora a -20 o C.5. Centrifugue por 10 minutos a5.000 g a 4 o C.6. Lave o precipitado com etanol70% (v/v) e centrifugue novamentenas mesmas condições por 3 minutos.7. Seque o precipitado e dissolvaem 500 µl de tampão TE (Tris-HCl 10mM, pH 8,0; EDTA 1 mM). Conservea solução a -20 o C.8. Caso seja necessário, procedaa uma repurificação por gradientede cloreto de césio.Purificação de DNA total deplantas por gradiente de cloretode césio (CsCl) (Figura 2)1. Dissolva o DNA isolado em 6,5ml de tampão TE (Tris-HCl 10 mM,pH 8,0; EDTA 1 mM) e transfira asolução para um tubo de ultracentrífugade 10 ml.2. Adicione 7 g de CsCl, feche otubo e misture a solução por inversão.Caso necessário, aqueça a soluçãoem um banho-maria a 30 o C parafacilitar a dissolução.3. Adicione 700 µl de brometo deetídio a 0,1% (p/v). Feche o tubo emisture gentilmente por inversãopara homogeneizar a solução. Apartir dessa etapa, proteja seu tubocom um papel-alumínio para evitarexposição à luz ambiente, que poderádanificar o DNA na presença dobrometo de etídio.4. Centrifugue a 45.000 rpm (rotorVti65) por 16 horas, em uma ultracentrífuga,a 20 o C.5. Após a formação do gradiente,visualize a banda correspondente aoDNA sob luz ultravioleta (320 nm).Colete cuidadosamente a banda com oauxílio de uma pipeta Pasteur e transfirapara um novo tubo de vidro de 15 ml.6. Remova o brometo de etídioadicionando à solução que contém DNA1 volume de 1-butanol ou álcool isoamílico,ambos saturados em água. Fecheo tubo e misture gentilmente porinversão até que uma única fase seforme.7. Centrifugue por 3 minutos a 1.500rpm (rotor SS34) a temperatura ambiente,para separar a fase orgânica daaquosa. Descarte a fase orgânica (fasesuperior), que contém o brometo deetídio, com o auxílio de uma pipetaPasteur.8. Repita a extração por quantasvezes forem necessárias para eliminarqualquer vestígio de brometo de etídio(a cor rosa deve desaparecer completamentedas fases orgânica e aquosa).9. Remova o cloreto de césio precipitandoo DNA pela adição de 2 volumesde água destilada e 6 volumes deetanol absoluto. Incube por 30 minutosa 4 o C.10. Centrifugue a 12.000 rpm (rotorSS34) durante 30 minutos, a 4 o C. Descarteo sobrenadante e dissolva o precipitadoem 500 µl de tampão TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM).Conserve a solução a -20 o C.11. Quantifique a amostra de DNAatravés de leitura espectrofotométrica,medindo a absorbância da solução nocomprimento de onda de 260 nm. Aconcentração de DNA da amostra serádada pela seguinte fórmula:[DNA] = 50 µg/ml x D x A260;onde: D é o fator de diluição usadopara fazer a leitura espectrofotométricae A260 é a leitura obtida no comprimentode onda de 260 nm.ReferênciasBrasileiro ACM, Carneiro VTC (eds)(1998) Manual de Transformação Genéticade Plantas. Brasília, Embrapa-SPI/Embrapa-Cenargen. 309 p.Dellaporta SL, Wood J, Hicks JB(1983) A plant DNA minipreparation:version II. Plant Mol Biol Rep 1: 19-21.Rogers SO, Bendich AJ (1994) Extractionof total cellular DNA from plants,algae and fungi. In: Gelvin SB, SchilperoortRA (eds) Plant molecular biologymanual. Kluwer Academic Publishers,Dordrecht.Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T(1989) Molecular cloning: a labaratorymanual. 2 nd Edition. Cold Spring HarborLaboratory Press, New York.Shioda M, Marakami-Muofushi K(1987) Selective inhibition of DNA polymeraseby a polysaccharide purified fromslime of Phisarum polycephalum. BiocemBiophys Res Commum 146:61-66.Weising K, Nybom H, Wolff K, MeyerW (1995) DNA fingerprinting in plantsand fungi. CRC Press, Boca Raton.ABFigura 2: Purificação de DNAtotal de plantas por meio degradiente de cloreto de césio.(A) Separação dos diferentescomponentes presentes nasolução após o isolamento doDNA total e ultracentrifugaçãoem rotor de ângulo fixo. (B)Eliminação do brometo deetídio da solução de DNA.Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 43

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SEÇÃO DE CARTASCARTASPara entrar em contato com Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento você pode enviar sua correspondênciavia Internet, fax ou carta para esta seção. A critério do editor, as mensagens poderão serpublicadas resumidamente. Nossos endereços são:Redação de Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento: SRTV/Sul – Quadra 701 – Ed. Palácio do Rádio II,sala 215 – Cep 70340-902 – Brasília –DF Tel: (061) 225-1512 Fax: (061)224-2830Home-page: http://www.biotecnologia.com.br Email: kl3@biotecnologia.com.brMi nombre es Ricardo Albarran y megustaria me mandaran informacion sobreel uso de la biotecnologia para tratarresiduos peligrosos y tambien el uso debioenzimas para biodegradar materiaorganica de origen humano, grasas deorigen animal o vegetal, lacteos etc.Formo parte de una empresa dedicadaa la ingenieria ambiental y me gustariaampliar mi informacion sobre esta area.Favor mandar informacion al mailtrimmor@df1.telmex.net.mxllllSou estudante de biologia pela UniversidadeFederal do Pará e lendo a reportagem“Clones Tecnológicos, a Salvaçãoda Lavoura do Cacau”, da edição número3, de Biotecnologia, Ciência & Desenvolvimento,interessei-me muitopelas variedades resistentes à Vassourade-bruxa.Gostaria de entrar em contatocom quem está trabalhando com essematerial, e como devo proceder paraconseguir sementes e mudas estandoem Belém. Gunther Barbosa, e-mailgunther@ufpa.br.Prezado Sr. Gunther,Temos os telefones da Ceplac onde oSenhor poderá conseguir informação.CEPLAC: Geraldo Lessa (assessor de comunicação)021.73.214-3015; RaulRene Valle (diretor de pesquisa)021.73.214-3003 e 226-7585, 225-8041. Endereço: Caixa Postal 07 – Itabuna(BA), CEP 45600-000. A reportagemfoi feita por Lucas Tadeu Ferreira eo e-mail é:deluca@tba.com.brllllGostaria de saber se vocês podem medar uma dica: onde posso encontrarinformações recentes sobre produção,consumo e regulamentação deflavors produzidos por biotransformação?Hannah Rozenbaum. E-mail:hannah@netgate.com.brllllPreciso fazer um trabalho sobre “Tratamentode Efluentes Industriais”. Peçoque vocês se possuírem alguma coisasobre este assunto enviem-me e-mail.Raquel: e-mail:97311315@inf.ucp.brllllMeu nome é Isabel Cristina, sou estudantedo curso de biologia. Adorei amatéria sobre vacinas polivalentes antihelmintos.Gostaria de obter maisinformações a respeito. Seria possívelconseguir mais alguma coisa sobre oassunto? Isabel Cristina, e-mail:isabel@sunnet.com.brllllPublicamos os e-mails acima paraque os leitores entrem em contato comos interessados.Aos interessados na discussão dosprojetos de lei de acesso aos recursosgenéticos brasileiros, informamos queestão disponíveis no site da RevistaBiotecnologia:www.biotecnologia.com.br, seçãode Legislação, todos os projetos emtramitação no Congresso Nacional.Prezados Senhores,Estamos desenvolvendo um projeto deuma fazenda auto-sustentada no Sulde Minas, no Município de Camanducaia.Gostaríamos de saber informaçõessobre Seleção de Embriões. Os Senhorestem alguma informação a respeito?Poderiam indicar algum consultor noassunto que estivesse próximo a estaregião?Caso necessitem de mais informações,terei grande prazer em explicar maisdetalhadamente nossas necessidades.Aguardando seu retorno, agradeço desdejá sua atenção.Fernando Lopezfernando&neusa@xpnet.com.brllllParabéns pelo projeto. Estamos divulgandoseu e mail para que alguminteressado entre em contato.Comunicamos o lançamento do livro “Manual de transformação genética deplantas” organizado pelas pesquisadoras da Embrapa Recursos Genéticos eBiotecnologia Vera Tavares Campos Carneiro e Ana Cristina Miranda Brasileiro,publicado pela própria Embrapa. Interessados podem adquiri-lo pela livrariavirtual da Embrapa, no site www.spi.embrapa.br, ou pelos telefones (021)61.348-4236 e 348-4708.As autoras do artigo “Probióticos – Uso de probióticos na alimentação defrangos de corte”, publicado na Revista número 3 (maio/junho 1999),solicitam a inclusão de uma referência bibliográfica, fazendo umaretificação. Trata-se de um manual técnico publicado em 1997 pela extintaempresa “Biotecnal” denominado “O Fantástico Mundo dos Probióticos”.46 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento