小麦ERF类转录因子生物信息学分析 - abc

G03
小 麦 ERF 类 转 录 因 子
生 物 信 息 学 分 析
组 长 : 林 涛
组 员 : 钟 礼 , 周 明 , 刘 佳 明
1 月 11

PCR 引 物 设 计 及 其 分 析
刘 佳 明
TEL: 18910218863
Email: 459494314@qq.com
重 大 工 程 楼 523 室
2013/1/22

引 物 设 计 时 应 注 意 的 问 题
1、 引 物 长 度 (primer length) 15-30 bp 不 应 大 于 38
2、 引 物 序 列 在 模 板 内 应 当 没 有 相 似 性 较 高 , 尤 其 是 3’ 端 相 似 性
较 高 的 序 列 , 否 则 容 易 导 致 错 配 引 物 3’ 端 出 现 3 个 以 上 的 连 续
碱 基 , 如 GGG 或 CCC, 也 会 使 错 误 引 发 机 率 增 加
3、 序 列 Tm 值 (melting temperature)
如 :Tm=4 ( G+C )+2 ( A+T )
4、G+C 含 量 (composition) 40-60 %
5、 引 物 二 聚 体 及 发 夹 结 构 (duplex formation and hairpin)
6、 避 免 在 引 物 的 3’ 端 使 用 碱 基 A
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引 物 设 计 的 软 件
• Primer Primer5.0 ( 图 形 界 面 、 自 动 搜 索 )
1
• Oligo 6.0 ( 图 形 界 面 、 引 物 分 析 )
2
• Primer-Blast ( 同 源 序 列 分 析 )
3
• Primer3 ( 引 物 分 析 、 批 量 设 计 )
4
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Primer Primer5.0- 软 件 主 界 面

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Primer Primer5.0- 序 列 导 入

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序 列 分 析

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引 物 搜 索 设 置

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结 果 显 示

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结 果 的 保 存

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引 物 合 成

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Primer-BLAST

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参 数 设 定

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结 果 显 示

example
• >Homo sapiens hemoglobin
CATAAACCCTGGCGCGCTCGCGGGCCGGCACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACCATGG
TGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTA
TGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGAC
CTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGG
CGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGA
CCCGGTCAACTTCAAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTC
ACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACC
GTTAAGCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTT
GCACCGGCCCTTCCTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCAGCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
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研 究 背 景
• ERF( 乙 烯 响 应 因 子 ) 转 录 因 子 在 植 物 响 应 非 生 物 胁 迫 以
及 激 素 和 病 原 菌 应 答 中 发 挥 重 要 作 用 , 以 ERF 转 录 因 子 W17
为 诱 饵 , 筛 选 小 麦 干 旱 处 理 的 cDNA 文 库 , 得 到 三 株 阳 性 克
隆 :STPK、Hsp90、PPR, 利 用 基 因 克 隆 技 术 得 到 三 个 基 因
全 长 , 对 这 三 个 基 因 实 时 定 量 分 析 , 推 测 受 多 种 非 生 物 胁
迫 和 生 物 胁 迫 诱 导 表 达 的 基 因 , 这 三 个 基 因 表 达 的 蛋 白 可 能
是 W17 互 作 蛋 白 , 利 用 酵 母 双 杂 交 、BIFC( 荧 光 双 分 子 互
补 )PULL-DOWN 方 法 进 一 步 验 证 W17 与 STPK、Hsp90、PPR
之 间 的 互 作 关 系 。 根 据 STPK、Hsp90、PPR 亚 细 胞 定 位 , 蛋
白 保 守 域 , 已 经 报 道 的 文 献 , 推 测 它 们 之 间 可 能 的 互 作 关
系 , 互 作 方 式 及 互 作 位 点 , 在 分 别 对 STPK、Hsp90、PPR 这
三 个 基 因 进 行 筛 选 小 麦 干 旱 处 理 的 cDNA 文 库 , 找 到 互 作 蛋
白 , 推 测 W17 转 录 因 子 可 能 参 与 的 信 号 通 路

具 体 操 作 : 利 用 Jemboss 软 件 克 隆 到 的 基
因 分 析 其 ORF

• 克 隆 到 一 个 基 因 , 分 析 可 能 是 ERF 类 转 录 因 子 ,
BLAST 分 析 与 小 麦 Tae005772 相 似 度 最 高

Tae005772 基 因 NCBI 比 对 及 进 化 树 分 析

与 玉 米 ethylene-responsive element binding protein 2 [Zea mays] 相
似 度 最 高

扩 大 范 围 比 对 , 结 果 显 示 Tae005772 基 因 与 单 子 叶 植 物 亲 缘 关 系 最 近 , 来 源 于
相 同 的 祖 先 , 有 相 同 的 起 源
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拟 南 芥 基 因 BLAST 结 果 显 示

与 拟 南 芥 中 的 AT3G16770 相 似 度 最 高 , 通 过 了 解 此 基 因 能 初 步 分 析 亚 细 胞 定 位

Arabidopsis eFP Browser
In the Xylem and cork express the highest amount
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Abiotic stress
Can endure high
temperature
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生 物 信 息 学 分 析 Tae005772 基 因
蛋 白 与 拟 南 芥 中 的 Ethylene Responsive Element Bingding Factor 1 相 似

拟 南 芥 Ethylene Responsive Element Bingding Factor 1
的 3D 结 构

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Protein Interaction

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AP2 保 守 域
噬 菌 体 cDNA
cDNA
W17
STPK PPR HSP90
?? ?? ??

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STPK 基 因 NCBI BLAST 结 果

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STPK 比 对 拟 南 芥 数 据 库

Arabidopsis eFP Browser
2013/1/22 可 能 与 非 生 物 胁 迫 相 关

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Tissue specific

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PPR

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W17+PPR W17+STPK W17+HSP90 的
BIFC( 双 分 子 荧 光 互 补 ) 验 证 ( 小 麦 原 生 质 体 )
GFP
TaW17-YN+PPR-YC
TaW17-YN+STPK-YC
TaW17-YN+HSP90-
YC

• 目 前 已 经 初 步 验 证 互 作 , 具 体 互 作 机 制 还
不 清 楚 , STPK、Hsp90、PPR 已 经 筛 选 cDNA
文 库 , 下 一 步 就 是 继 续 找 到 互 作 蛋 白 。
2013/1/22

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