小麦ERF类转录因子生物信息学分析 - abc
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G03<br />
小 麦 ERF 类 转 录 因 子<br />
生 物 信 息 学 分 析<br />
组 长 : 林 涛<br />
组 员 : 钟 礼 , 周 明 , 刘 佳 明<br />
1 月 11
PCR 引 物 设 计 及 其 分 析<br />
刘 佳 明<br />
TEL: 18910218863<br />
Email: 459494314@qq.com<br />
重 大 工 程 楼 523 室<br />
2013/1/22
引 物 设 计 时 应 注 意 的 问 题<br />
1、 引 物 长 度 (primer length) 15-30 bp 不 应 大 于 38<br />
2、 引 物 序 列 在 模 板 内 应 当 没 有 相 似 性 较 高 , 尤 其 是 3’ 端 相 似 性<br />
较 高 的 序 列 , 否 则 容 易 导 致 错 配 引 物 3’ 端 出 现 3 个 以 上 的 连 续<br />
碱 基 , 如 GGG 或 CCC, 也 会 使 错 误 引 发 机 率 增 加<br />
3、 序 列 Tm 值 (melting temperature)<br />
如 :Tm=4 ( G+C )+2 ( A+T )<br />
4、G+C 含 量 (composition) 40-60 %<br />
5、 引 物 二 聚 体 及 发 夹 结 构 (duplex formation and hairpin)<br />
6、 避 免 在 引 物 的 3’ 端 使 用 碱 基 A<br />
2013/1/22
引 物 设 计 的 软 件<br />
• Primer Primer5.0 ( 图 形 界 面 、 自 动 搜 索 )<br />
1<br />
• Oligo 6.0 ( 图 形 界 面 、 引 物 分 析 )<br />
2<br />
• Primer-Blast ( 同 源 序 列 分 析 )<br />
3<br />
• Primer3 ( 引 物 分 析 、 批 量 设 计 )<br />
4<br />
2013/1/22
2013/1/22<br />
Primer Primer5.0- 软 件 主 界 面
2013/1/22<br />
Primer Primer5.0- 序 列 导 入
2013/1/22<br />
序 列 分 析
2013/1/22<br />
引 物 搜 索 设 置
2013/1/22<br />
结 果 显 示
2013/1/22
2013/1/22<br />
结 果 的 保 存
2013/1/22<br />
引 物 合 成
2013/1/22<br />
Primer-BLAST
2013/1/22<br />
参 数 设 定
2013/1/22<br />
结 果 显 示
example<br />
• >Homo sapiens hemoglobin<br />
CATAAACCCTGGCGCGCTCGCGGGCCGGCACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACCATGG<br />
TGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTA<br />
TGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGAC<br />
CTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGG<br />
CGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGA<br />
CCCGGTCAACTTCAAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTC<br />
ACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACC<br />
GTTAAGCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTT<br />
GCACCGGCCCTTCCTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCAGCAAAAAAAAAAAAAAAAAA<br />
2013/1/22
研 究 背 景<br />
• ERF( 乙 烯 响 应 因 子 ) 转 录 因 子 在 植 物 响 应 非 生 物 胁 迫 以<br />
及 激 素 和 病 原 菌 应 答 中 发 挥 重 要 作 用 , 以 ERF 转 录 因 子 W17<br />
为 诱 饵 , 筛 选 小 麦 干 旱 处 理 的 cDNA 文 库 , 得 到 三 株 阳 性 克<br />
隆 :STPK、Hsp90、PPR, 利 用 基 因 克 隆 技 术 得 到 三 个 基 因<br />
全 长 , 对 这 三 个 基 因 实 时 定 量 分 析 , 推 测 受 多 种 非 生 物 胁<br />
迫 和 生 物 胁 迫 诱 导 表 达 的 基 因 , 这 三 个 基 因 表 达 的 蛋 白 可 能<br />
是 W17 互 作 蛋 白 , 利 用 酵 母 双 杂 交 、BIFC( 荧 光 双 分 子 互<br />
补 )PULL-DOWN 方 法 进 一 步 验 证 W17 与 STPK、Hsp90、PPR<br />
之 间 的 互 作 关 系 。 根 据 STPK、Hsp90、PPR 亚 细 胞 定 位 , 蛋<br />
白 保 守 域 , 已 经 报 道 的 文 献 , 推 测 它 们 之 间 可 能 的 互 作 关<br />
系 , 互 作 方 式 及 互 作 位 点 , 在 分 别 对 STPK、Hsp90、PPR 这<br />
三 个 基 因 进 行 筛 选 小 麦 干 旱 处 理 的 cDNA 文 库 , 找 到 互 作 蛋<br />
白 , 推 测 W17 转 录 因 子 可 能 参 与 的 信 号 通 路
具 体 操 作 : 利 用 Jemboss 软 件 克 隆 到 的 基<br />
因 分 析 其 ORF
• 克 隆 到 一 个 基 因 , 分 析 可 能 是 ERF 类 转 录 因 子 ,<br />
BLAST 分 析 与 小 麦 Tae005772 相 似 度 最 高
Tae005772 基 因 NCBI 比 对 及 进 化 树 分 析
与 玉 米 ethylene-responsive element binding protein 2 [Zea mays] 相<br />
似 度 最 高
扩 大 范 围 比 对 , 结 果 显 示 Tae005772 基 因 与 单 子 叶 植 物 亲 缘 关 系 最 近 , 来 源 于<br />
相 同 的 祖 先 , 有 相 同 的 起 源<br />
2013/1/22
拟 南 芥 基 因 BLAST 结 果 显 示
与 拟 南 芥 中 的 AT3G16770 相 似 度 最 高 , 通 过 了 解 此 基 因 能 初 步 分 析 亚 细 胞 定 位
Arabidopsis eFP Browser<br />
In the Xylem and cork express the highest amount<br />
2013/1/22
Abiotic stress<br />
Can endure high<br />
temperature<br />
2013/1/22
生 物 信 息 学 分 析 Tae005772 基 因<br />
蛋 白 与 拟 南 芥 中 的 Ethylene Responsive Element Bingding Factor 1 相 似
拟 南 芥 Ethylene Responsive Element Bingding Factor 1<br />
的 3D 结 构
2013/1/22<br />
Protein Interaction
2013/1/22
AP2 保 守 域<br />
噬 菌 体 cDNA<br />
cDNA<br />
W17<br />
STPK PPR HSP90<br />
?? ?? ??
2013/1/22<br />
STPK 基 因 NCBI BLAST 结 果
2013/1/22<br />
STPK 比 对 拟 南 芥 数 据 库
Arabidopsis eFP Browser<br />
2013/1/22 可 能 与 非 生 物 胁 迫 相 关
2013/1/22<br />
Tissue specific
2013/1/22<br />
PPR
2013/1/22
2013/1/22
2013/1/22
2013/1/22
2013/1/22
W17+PPR W17+STPK W17+HSP90 的<br />
BIFC( 双 分 子 荧 光 互 补 ) 验 证 ( 小 麦 原 生 质 体 )<br />
GFP<br />
TaW17-YN+PPR-YC<br />
TaW17-YN+STPK-YC<br />
TaW17-YN+HSP90-<br />
YC
• 目 前 已 经 初 步 验 证 互 作 , 具 体 互 作 机 制 还<br />
不 清 楚 , STPK、Hsp90、PPR 已 经 筛 选 cDNA<br />
文 库 , 下 一 步 就 是 继 续 找 到 互 作 蛋 白 。<br />
2013/1/22
2013/1/22