Tiit Ãrd

TARTU ÜLIKOOL 

LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND 

MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT 

MOLEKULAARBIOLOOGIA ÕPPETOOL 

Tiit Örd 

5' mittetransleeritava regiooni mõju translatsiooni 

initsiatsioonile eukarüootses rakus 

Bakalaureusetöö 

Juhendajad 

vanemteadur Tõnis Örd 

prof. Jaanus Remme 

TARTU 2008

SISUKORD 

SISUKORD ..................................................................................................................................... 2 

KASUTATUD LÜHENDID ........................................................................................................... 5 

SISSEJUHATUS............................................................................................................................. 7 

1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE.................................................................................................. 8 

1.1. Eukarüootsete organismide translatsiooni initsiatsiooni üldiseloomustus ...................... 8 

1.2. mRNA-sisene translatsiooni initsiatsioon ....................................................................... 9 

1.3. Translatsiooni initsieerimise skaneerimismehhanism ..................................................... 9 

1.3.1. mRNA m 7 G capi olulisus...................................................................................... 10 

1.3.2. Esimese AUG kasutamise reegel (startkoodoni asukoht)...................................... 10 

1.3.3. Startkoodoni kontekst ja leaky scanning ............................................................... 10 

1.3.4. Alternatiivsed startkoodonid ................................................................................. 11 

1.3.5. 5’ UTR-is leiduvad sekundaarstruktuurid ............................................................. 11 

1.3.6. 5’ UTR-ile seonduvad valgud ............................................................................... 12 

1.4. Reinitsiatsioon ja upstream ORF-id .............................................................................. 12 

1.4.1. uORF-ide inhibeeriv mõju geeniekspressioonile .................................................. 13 

1.4.2. uORF-ilt sünteesitava peptiidi olulisus.................................................................. 14 

1.5. eIF2α fosforüleerimisest sõltuv translatsiooni regulatsioon.......................................... 16 

1.5.1. Pärmseente general control noninducible 4 (GCN4)............................................ 17 

1.5.2. Selgroogsete activating transcription factor 4 (ATF4)......................................... 17 

2. EKSPERIMENTAALOSA ................................................................................................... 19 

2.1. Materjal ja metoodika.................................................................................................... 19 

2.1.1. mRNA 5’ UTR-ide otsinguprogrammide valmistamine ....................................... 19 

2.1.2. Valmistatud otsinguprogrammide ülesehitus ........................................................ 19 

2.1.3. mRNA-de selektsiooni käsitsi läbiviidud etapid ................................................... 20 

2

2.1.4. Kasutatud cDNA-de segu ...................................................................................... 20 

2.1.5. Kasutatud kommertsiaalsed plasmiidid................................................................. 21 

2.1.6. Polümeraasi ahelreaktsioonide teostamine............................................................ 22 

2.1.6.1. Plasmiidsete konstruktide valmistamiseks kasutatud DNA fragmentide 

paljundamine PCR-iga....................................................................................................... 22 

2.1.6.2. Bakterikolooniate analüüs PCR-i abil ........................................................... 23 

2.1.7. DNA analüüs elektroforeesi abil agaroosgeelis..................................................... 24 

2.1.8. DNA puhastamine reaktsioonisegudest................................................................. 25 

2.1.9. DNA restriktsioon ................................................................................................. 25 

2.1.10. DNA 5’ üleulatuvate otste täitmine Klenow fragmendiga .................................... 25 

2.1.11. Restrikteeritud DNA 5’ otste defosforüleerimine ................................................. 25 

2.1.12. DNA fragmentide ligeerimine............................................................................... 26 

2.1.13. Bakterirakkude transformatsioon .......................................................................... 26 

2.1.14. Plasmiidse DNA eraldamine ................................................................................. 26 

2.1.15. DNA sekveneerimine ............................................................................................ 27 

2.1.16. Ülevaade 5’ UTR-i sisaldavate esialgsete reporterkonstruktide valmistamisest... 28 

2.1.17. GeneRacer RNA oligos sisalduva ORF-i kaotamine reporterplasmiididest ......... 29 

2.1.18. Koekultuuri rakkude kasvatamine......................................................................... 30 

2.1.19. Koekultuuri rakkude transfektsioon ...................................................................... 30 

2.1.20. Stressivastuse indutseerimine koekultuuri rakkudes ............................................. 31 

2.1.21. Lutsiferaasi aktiivsuse määramine......................................................................... 31 

2.1.22. Totaalse RNA eraldamine ..................................................................................... 32 

2.1.23. Totaalse RNA töötlus DNaasiga............................................................................ 32 

2.1.24. cDNA esimese ahela süntees................................................................................. 32 

2.1.25. Reaalaja PCR mRNA tasemete kontrollimiseks ................................................... 32 

3

2.1.26. Tulemuste statistiline analüüs................................................................................ 33 

2.2. Tulemused ja arutelu ..................................................................................................... 34 

2.2.1. Bioinformaatiline otsing leidmaks geene, mille mRNA-d sarnanevad uORF-ide 

paiknemise poolest ATF4 ja GCN4 mRNA-dele, mille transleerimine on reguleeritud eIF2α 

fosforüleerimise poolt............................................................................................................ 34 

2.2.2. Ülevaade rakukultuuris katsetamiseks valitud 5’ UTR-idest ................................ 36 

2.2.2.1. 5’ UTR-id, mis on võimalikult sarnased ATF4 mRNA 5’ UTR-ile.............. 36 

2.2.2.2. Laiendatud kriteeriumitega valitud 5’ liiderjärjestused................................. 38 

2.2.3. RefSeq andmekogust väljavalitud mRNA-de esindatuse kontrollimine ER stressi 

alla kannatavates HepG2 rakkudes........................................................................................ 41 

2.2.4. 5’ UTR-i sisaldavate reporterkonstruktide valmistamine...................................... 42 

2.2.5. mRNA 5’ UTR-ide mõju uurimine reportergeeni ekspressioonile stressi korral.. 42 

2.2.5.1. ATF5 5’ UTR-i transleeritavus tõuseb ER stressi korral .............................. 43 

2.2.5.2. ATF5 mRNA 5’ UTR-iga reporterkonstrukti reageerimine toitainepuudustele 

44 

2.2.5.3. Laiendatud kriteeriumitega valitud 5’ UTR-ide katsetamine........................ 45 

KOKKUVÕTE .............................................................................................................................. 49 

SUMMARY .................................................................................................................................. 51 

KIRJANDUSE LOETELU............................................................................................................ 52 

KASUTATUD VEEBIAADRESSID ........................................................................................... 58 

4

KASUTATUD LÜHENDID 

ATF4 activating transcription factor 4 (aktiveeriv transkriptsioonifaktor 4) 

ATF5 activating transcription factor 5 (aktiveeriv transkriptsioonifaktor 5) 

BLAST Basic Local Alignment Search Tool 

bZIP basic region-leucine zipper (aluselist piirkonda ja leutsiini tõmblukku sisaldav) 

cDNA complementary DNA (komplementaarne DNA) 

CDS coding sequence (valku kodeeriv järjestus) 

CIAP calf intestine alkaline phosphatase (vasika soole aluseline fosfataas) 

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media 

DMSO dimetüülsulfoksiid 

DPP9 dipeptidylpeptidase 9 (dipeptidüül peptidaas 9) 

EDTA ethylenediamine tetraacetic acid (etüleendiamiintetraäädikhape) 

eIF eukarüootne initsiatsioonifaktor 

ER endoplasmaatiline retiikulum 

ERK extracellular-signal-regulated kinase (rakuvälise signaali poolt reguleeritav 

kinaas) 

EST expressed sequence tag (ekspresseeritud järjestuse märgis) 

FCS fetal calf serum (veise loote seerum) 

fluc firefly luciferase (põrnika lutsiferaas) 

GCN2 general control non-depressible 2 (aminohapete biosünteesi geenide üldise 

regulatsiooni mitteindutseeritav mutant 2) 

GCN4 general control noninducible 4 (aminohapete biosünteesi geenide üldise 

regulatsiooni mitteindutseeritav mutant 4) 

HRI haem-regulated inhibitor (heemi poolt reguleeritud inhibiitor) 

HSV-TK Herpes Simplex viiruse tümidiinkinaas 

IMDM Iscove’s modified Dulbecco’s medium 

IRE iron-responsive element (raua tasemele IRP kaudu tundlik mRNA element) 

IRES internal ribosome entry site (sisemine ribosoomi sisenemiskoht) 

IRP iron regulatory protein (raua ainevahetust reguleeriv valk) 

LAR Luciferase Assay Reagent (lutsiferaasi proovianalüüsi reagent) 

LB sööde Luria-Bertoni sööde 

luc+ modifitseeritud firefly (põrnika) lutsiferaas 

5

m 7 G 7-metüülguanosiin cap (otsak) 

MAPK mitogeen-aktiveeritav proteiinkinaas 

MEK1 MAPK-i/ERK-i kinaas 1 

NACA nascent polypeptide-associated complex alpha subunit (kasvava polüpeptiidiga 

seotud kompleksi α-subühik) 

NCBI National Center for Biotechnology Information 

PEI polüetüleenimiin 

PERK PKR-like endoplasmatic reticulum kinase (PKR-sarnane ER-is paiknev kinaas) 

PKR protein kinase R (valgukinaas R) 

PLB passive lysis buffer (passiivne lüüsipuhver) 

RefSeq Reference Sequence (referentsjärjestus) 

RLU relative light unit (suhteline valguse ühik) 

Rluc Renilla luciferase (Renilla lutsiferaas) 

rpm revolutions per minute (pööret minutis) 

RT-qPCR reverse transcription quantitative PCR (pöördtranskriptsiooniga reaalaja PCR) 

SLC35C2 solute carrier family 35, member C2 (lahustunud aine kandja perekond 35, liige 

C2) 

SMEK2 SMEK (suppressor of MEK1) homolog 2 (MEK1 vaigistaja homoloog 2) 

SV40 Simian Virus 40 

TAE TRIS-atsetaat-EDTA puhver 

T m 

TPM 

uAUG 

uORF 

UTR 

melting temperature (sulamistemperatuur) 

transcripts per million (transkriptide arv miljoni kohta) 

upstream AUG (ülesvoolu asuv AUG koodon) 

upstream ORF (ülesvoolu asuv ORF) 

untranslated region (mittetransleeritav ala) 

6

SISSEJUHATUS 

Eukarüootsed mRNA-d algavad 5’ otsas modifitseeritud nukleotiidiga ehk capiga, millele järgneb 

tihti paarsada nukleotiidi pikk 5’ mittetransleeritav regioon (5’ untranslated region, 5’ UTR). 

Üldise mudeli järgi alustab ribosoomi väike subühik seotuna, eukarüootsete 

initsiatsioonifaktoritega (eIF), mRNA 5’ capi juurest 5’ → 3’ suunas mööda mRNA-d liikumist 

ja esimesele initsiaatorkoodonile jõudes alustab valgusünteesi. Kõik startkoodonid ei ole 

ühesuguse efektiivsusega kasutatavad ja 5’ UTR võib sisaldada ka valgu startkoodonist ülesvoolu 

asuvaid lühikesi avatud lugemisraame (upstream open reading frame, uORF). Sellised omadused 

võimaldavad reguleerida kodeeritava valgu sünteesi initsiatsiooni tasemel. 

Regulatsioon translatsiooni tasemel on sageli oluline geenide puhul, mis on seotud rakutsükli 

kontrollimisega, diferentseerumisega ja reageerimisega stressile. Selliste geenide ekspressioonis 

esineb muutusi pahaloomuliste kasvajate korral ja samuti on rakustress iseloomulik paljudele 

haigustele. Rakk muudab ka translatsiooniaparaadi toimimist sõltuvalt kasvutingimustest. 

Üks olulisemaid sündmusi, mis stressi käes kannatavas eukarüootses rakus aset leiab, on 

valgusünteesi pidurdumine, tingituna translatsiooni alustamise võtmekomponendi, 

initsiatsioonifaktori eIF2α fosforüleerimisest. Kui valdaval osal mRNA-dest põhjustab eIF2α 

fosforüleerimine translatsiooni inhibeerimise, siis mõnedel mRNA-del (transkriptsioonifaktorite 

ATF4 mRNA selgroogsetes organismides ja GCN4 mRNA pärmseentes) on tulemuseks hoopiski 

sünteesitava valgu hulga mitmekordistumine. See on tingitud ATF4 ja GCN4 mRNA-de 5' UTRide 

erilisest uORF-ide paigutusest, mis on tugevalt konserveerunud. 

Käesoleva töö eksperimentaalse osa eesmärgiks on bioinformaatiliselt otsida uusi eIF2α 

fosforüleerimisest sõltuvat translatsioonilist ülesreguleerimist võimaldavate 5’ UTR-idega 

mRNA-sid ning seejärel katsetada valitud 5’ UTR-ide mõju translatsioonile inimese koekultuuri 

rakkudes stressi- ja normaalolekus. 

7

1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE 

1.1. Eukarüootsete organismide translatsiooni initsiatsiooni 

üldiseloomustus 

Eukarüootides on translatsiooni initsiatsioon märkimisväärselt keeruline protsess, kus osaleb 

vähemalt 12 initsiatsioonifaktorit (tähistatakse eIF; eukaryotic initiation factor), mis hõlmavad 

vähemalt 23 erinevat polüpeptiidi (ülevaated Hellen ja Pestova, 2006; Kapp ja Lorsch, 2004). 

Translatsiooni initsiatsiooni esimeseks etapiks loetakse kolmikkompleksi (ternary complex) 

eIF2•GTP•Met-tRNA i moodustumist. Kuna eIF2 on pärast iga initsiatsiooni tugevalt seotud 

GDP-ga, siis on vaja eIF2B abil asendada see GTP-ga. Kolmikkompleks seostub vähemalt kolme 

faktori (eIF1, eIF1A ja eIF3) kaasabil ribosoomi väikese (40S) subühikuga. Tekkinud kompleksi, 

kus Met-tRNA i paikneb aktseptorsaidis (A-saidis), kutsutakse 43S kompleksiks. 

Eukarüootide mRNA-dele on iseloomulik 5’ otsas 7-metüülguanosiini (m 7 G) olemasolu, mida 

nimetatakse capiks. Capile järgneb 5’ mittetransleeritav regioon (untranslated region, UTR; 

nimetatakse ka 5’ flank või liiderjärjestus), mis on sageli mitusada nukleotiidi pikk ja 

sekundaarstruktuuridega. 5’ capiga seondub moodustuv eIF4F kompleks (koosneb eIF-idest 4A, 

4E ja 4G), mis vähendab 5’ UTR-is kõrgemat järku struktuure ATP energia arvel (täpsemalt on 

ATPaasne aktiivsus eIF4A-l). Samuti on eukarüootsetele mRNAdele omane 3’ polü(A)-saba, mis 

lisaks 5’ capile on oluline 43S kompleksi asetumisel mRNA-le (teostavad eIF4F kompleks, eIF3 

ja polü(A)-siduv valk). 

Kui 43S kompleks on mRNA-le seondunud, hakkab ta oletatavasti mööda seda 5’ → 3’ suunas 

ATP jõul liikuma ehk skaneerima. Esimesele AUG tripletile jõudmisel toimub enamasti koodonantikoodon 

paardumine initsiaator-tRNA-ga ja kolmikkompleksis oleva GTP hüdrolüüs eIF5 

abil. eIF2•GDP loovutab Met-tRNA i , mis liigub 40S subühiku peptidüülsaiti (P-saiti). eIF2•GDP 

ise vabaneb initsiatsioonikompleksi küljest ja dissotsieerub veel hulk initsiatsioonifaktoreid. 

Seejärel ribosoomi suur (60S) subühik seondub 40S•Met-tRNA i •mRNA kompleksiga (oluline on 

eIF5B-ga seotud GTP, mis hüdrolüüsub GDP-ks) ja järgneb polüpeptiidi süntees translatsiooni 

elongatsioonifaasis. 

8

1.2. mRNA-sisene translatsiooni initsiatsioon 

Ülal kirjeldatud skaneeriv (mRNA 5’ otsast algav) mehhanism on translatsiooni initsiatsioonil 

valdav, kuid esineb ka mRNA-sisest translatsiooni algatamist IRES (internal ribosome entry site) 

järjestustelt. Põhjalikult on uuritud viiruslikke IRES elemente. Näiteks kollatõve viirus C 

vastavat järjestust uurides on selgunud, et sealt initsieerimiseks pole vaja eIF4F-i (mille 

funktsiooniks on ribosoomi 40S subühik mRNA 5’ otsale paigutada) ja selle asemel on 

seondumiseks tarvilik spetsiifilise RNA ruumilise struktuuri olemasolu (Siridechadilok jt., 2005). 

Samas on IRES elemente (eriti just rakulisi) käsitlevate artiklite suhtes esitatud tugevat kriitikat. 

Nimelt töötavad oletatavad IRES-id tihti väga nõrgalt, võrreldes mRNA otsast skaneeriva 

initsiatsiooniga, mis annab põhjust kahtlustada katseprotseduuride osas ebatäpsusi (valepositiivne 

traditsiooniline initsiatsioon madalal tasemel) ning seab isegi katsete korrektsuse puhul kahtluse 

alla IRES-ide suutlikkuse täita neile omistatavat bioloogilist rolli (Kozak, 2005). Kuna IRES-id ei 

vaja initsiatsiooniks kõiki eIF-e, siis on see võimalus pääseda üldisest regulatsioonist ja neid 

elemente peetaksegi olulisteks olukordades, kus tavaline initsiatsioon on pidurdatud, näiteks 

rakuliste valkude tootmine stressi korral ja viirusvalkude tootmine (ülevaated Baird jt., 2006; 

Yamasaki ja Anderson, 2008). IRES-idel on väga raske leida ühiseid motiive, mis teeb 

tänapäeval võimatuks ka nende bioinformaatilise ennustamise (Baird jt., 2006). See asjaolu ja 

rakuliste IRES-ide haruldus on põhjused, miks nende elementide toimimise mehhanisme siin töös 

pikemalt ei käsitleta ja lähtutakse eelkõige skaneerivast mudelist. 

1.3. Translatsiooni initsieerimise skaneerimismehhanism 

Nagu mainitud punktis 1.1., põhineb translatsiooni initsiatsiooni skaneerimismehhanism 

tähelepanekul, et ribosoomi väike subühik seondub mRNA-ga selle 5’ otsas ja liigub sealt 3’ 

suunas, otsides startkoodonit. Üldiselt on eukarüootide mRNA-d monotsistroonsed ja enamasti 

initsieeritakse translatsioon kõige esimeselt AUG tripletilt. Siiski on mitmed mRNA struktuursed 

elemendid võimelised mõjutama transleeritava ORF-i valikut ja translatsiooni efektiivsust just 

initsiatsioonietapi kaudu. Käesoleva töö jaoks kõige olulisem aspekt, skaneerimise 

reinitsiatsioon, on esitatud eraldi peatükina (1.4.). Translatsioonilisi regulatsioonimehhanisme 

kaaludes tuleb aga meeles pidada, et eukarüootides on valgu tasemete määramisel väga olulised 

ka promootorite, splaissingu ning mRNA ja valgu stabiilsuse muutmine. 

9

1.3.1. mRNA m 7 G capi olulisus 

Rakuliste ja enamiku viiruslike mRNA-de 5’ otsas paikneb m 7 G cap. Ilma capita mRNA-sid 

transleeritakse pärmis vähem kui 10% efektiivsusega võrreldes capi omavatega (Lo jt., 1998). 

Siiski ei tähenda cap-sõltumatu translatsiooni initsiatsioon automaatselt IRES-e kasutamist, sest 

ka ilma capita mRNA puhul on näidatud, et valgusüntees algab skaneerivale mehhanismile 

omaselt vaid esimeselt AUG koodonilt (Kozak, 1998). 

1.3.2. Esimese AUG kasutamise reegel (startkoodoni asukoht) 

Oluliseks tähelepanekuks skaneeriva initsiatsiooni osas on, et mitme järjestikku paikneva AUG 

korral kasutatakse vaid esimest (juhul, kui nad on mõlemad ”tugevas kontekstis”, millest on juttu 

järgmises alateemas) isegi siis, kui startkoodonid paiknevad väga lähestikku (Kozak, 1995). 

Samas võib esimene startkoodon paikneda mRNA 5’ otsast näiteks 1700 nt kaugusel ja niivõrd 

pikk 5’ UTR ei pärsi oluliselt translatsiooni (pärmis, Berthelot jt., 2004). 

1.3.3. Startkoodoni kontekst ja leaky scanning 

Translatsiooni alguspunkti valiku puhul ei ole siiski oluline ainult startkoodon vaid ka seda 

vahetult ümbritsevad nukleotiidid (kontekst). Juhul, kui kontekst on ebasoodne, võib 

translatsioon mitte alata kõige esimeselt AUG tripletilt. Imetajates on kõige efektiivsem kontekst 

GCCRCCAUGG, kus alla on joonitud startkoodon ja R tähistab A või G nukleotiidi. Kõige 

olulisem mõju on A või G paiknemisel positsioonis -3 ja G paiknemisel positsioonis +4 

(positsiooniks +1 on võetud A tripletis AUG). Nende tingimuste täitmisel alustatakse 

valgusünteesi üle kümne korra sagedamini kui mõlema mittetäitmisel (vastavalt ”tugev” ja 

”nõrk” kontekst) (Kozak, 1986; Kozak, 1997). 

Nõrgas kontekstis oleva AUG korral jätkab märkimisväärne osa 40S subühikutest skaneerimist 

pärast selle tripleti läbimist (leaky scanning, lekkiv skaneerimine). Leaky scanning on üks 

võimalus alustada translatsiooni mitte-esimeselt AUG-lt ja sellel võib olla bioloogiline roll 

näiteks ühelt mRNA-lt valgu eri vormide saamisel (Leissring jt., 2004). 

Leaky scanning võib olla põhjustatud ka AUG paiknemisest mRNA 5’ otsale liiga lähedal ja 

sellisel juhul esineda ka tugeva kontekstiga startkoodoni korral. Kindlasti on võimalus leaky 

scanningu jaoks, kui AUG kaugus mRNA 5’ otsast on alla ~30 nt ja selle osakaal suureneb 

distantsi lühenedes (Ruan jt., 1994; Sedman jt., 1990; Werten jt., 1999). 

10

Nõrga kontekstiga AUG korral võib leaky scanning mitte esineda, kui startkoodonist näiteks 14 

nt (vastab ligikaudu poolele ribosoomi läbimõõdust) 3’ suunas paikneb juuksenõel (∆G = -19 

kcal/mol), mis oletatavasti aeglustab 40S subühiku liikumist ja jätab koodon-antikoodon 

äratundmiseks rohkem aega (Kozak, 1990). 

1.3.4. Alternatiivsed startkoodonid 

Mitte-AUG startkoodonitelt, näiteks CUG, ACG jm ühenukleotiidilised muutused, võidakse 

valgusünteesi alustada küüliku retikulotsüüdi lüsaadi süsteemis, aga selliste startkoodonite 

efektiivsus on võrdlemisi väike isegi siis, kui ümbritsev kontekst on ideaalne. Alternatiivsest 

startkoodonist 3’ suunas paiknev juuksenõel võib suurendada initsiatsiooni tõenäosust, nagu on 

leitud ka nõrga kontekstiga AUG koodoni korral (eelmine alateema) (Kozak, 1990). Proteoomika 

meetoditega läbi viidud uuring näitab, et inimese mRNA-de peamistele ORF-idele alternatiivsed 

mitte-AUG koodonitelt alustatud peptiidid ja valgud rikastavad ”ORFeoomi”, ekspresseerudes 

tõenäoliselt siiski madalal tasemel (Oyama jt., 2007). 

1.3.5. 5’ UTR-is leiduvad sekundaarstruktuurid 

Imetajate üsna paljude mRNA-de 5’ UTR-id on GC-rikkad ja on näidatud, et paardunud 

regioonid 5’ liiderjärjestuses vähendavad translatsiooni efektiivsust (Short ja Pfarr, 2002). Kui 

rakk vajab valku suuremal määral, siis võidakse inhibeeriv struktureeritud 5’ UTR promootori 

tasemel lihtsama ja efektiivsemat translatsiooni võimaldava 5’ UTR-i vastu välja vahetada (Han 

jt., 2003). Lisaks on alternatiivse splaissingu uurimisel mRNA erinevates piirkondades leitud, et 

alternatiivne splaissing on kõige sagedasem 5’ UTR-is (Mironov jt., 1999). Seega on oluline 

omada informatsiooni mRNA-de populatsiooni kohta uuritavatel tingimustel. 

Ribosoomid on kõige tundlikumad mRNA 5’ otsa lähedal olevatele struktuuridele: näiteks 

juuksenõel (∆G = -30 kcal/mol) takistab capist 12 nt kaugusel paiknedes 40S subühikut (ilmselt 

seetõttu, et ei lase mRNA-le seonduda), aga ei takista capist 52 nt kaugusel, kus 40S subühik on 

juba seondunud ja skaneerib. Tugevama sekundaarstruktuuriga juuksenõel (∆G = -61 kcal/mol) 

takistab 40S subühikut ka 72 nt kaugusel capist. Samas suudab elongeeriv 80S ribosoom läbida 

mõlemad need struktuurid (Kozak, 1989). Lisaks võivad sekundaarstruktuurid mõjutada 

startkoodoni äratundmist (1.3.3. ja 1.3.4.). 

11

1.3.6. 5’ UTR-ile seonduvad valgud 

On teada, et imetajate rakkudes raua taset kontrollivad valgud, iron regulatory proteinid (IRP), 

avaldavad toimet geeniekspressioonile translatsiooni tasemel, seondudes teatud mRNA-de 5’ 

UTR-is leiduvatele iron-responsive elementidele (IRE). IRE on konserveerunud järjestus, mis 

moodustab juuksenõela-struktuuri ja IRP seondumine sellele pärsib translatsiooni, takistades 40S 

subühiku seondumist mRNA 5’ otsaga (Muckenthaler jt., 1998; ülevaade Rouault, 2006). 

1.4. Reinitsiatsioon ja upstream ORF-id 

Suur osa inimese erinevatest transkriptidest sisaldavad valku kodeerivast ORF-ist eespool 

lühikesi lugemisraame ehk upstream ORF-e (uORF) (41% Peri ja Pandey, 2001 järgi). 

Bioinformaatiliselt on leitud, et valgu startkoodonist ülesvoolu (5’ UTR-is) asuvad AUG 

koodonid (upstream AUG, uAUG) on haruldasemad kui oleks statistiliselt oodatav, kuid samas 

on nad 5’ UTR-is üksikutest koodonitest kõige enam konserveerunud (kui võrrelda inimese, hiire 

ja roti ortoloogseid järjestusi) (Churbanov jt., 2005). 

Juhul, kui uORF-ide startkoodonid on tugevas kontekstis, toimub sealt efektiivne translatsiooni 

initsiatsioon ja peptiidide süntees. uORF-ide poolt kodeeritavad peptiidid on sageli alla 30 

aminohappe pikad, kusjuures alla 20- ja eriti alla 10-koodonilised uORF-id on oluliselt 

sagedamini konserveerunud (Churbanov jt., 2005). Nii lühikeste peptiidide otsest detekteerimist 

raskendab oletatavasti nende kiire lagundamine rakus. Siiski on saadud immunoloogilist 

kinnitust, et väikeste lugemisraamide transleerimine tõepoolest toimub (Matza-Porges jt., 2005; 

Matza-Porges jt., 2003). Kaasaegsete proteoomika meetoditega on näidatud endogeensete 

upstream peptiidide olemasolu rakus (Oyama jt., 2007). Rutiinne meetod näitamaks, et 

kodeerivast alast ülesvoolu asuvalt AUG koodonilt initsieeritakse valgusüntees, on reportervalku 

kodeeriva DNA järjestuse liitmine selle järele (näiteks Lu jt., 2004). Arvestades neid tõendeid 

tuleb märkida, et nimetusele mittevastavalt sisaldavad 5’ UTR-id sageli alasid, mida 

transleeritakse. 

Erinevalt täispika tsistroni transleerimise lõpul toimuvast mRNA ja ribosoomi lahkuminekust 

suudab osa ribosoome pärast uORF-i transleerimist valgusünteesi uuesti algatada sama mRNA 

molekuli kaugemal paiknevalt AUG-lt (reinitsiatsioon). Selle nähtuse mehhanismi kohta on vähe 

teada, kuid oletatakse, et 60S subühik dissotsieerub terminatsioonil, aga 40S jääb seotuks 

12

mRNA-ga ja skaneerib edasi 5’ → 3’ suunas ning pärast eIF2•GTP•Met-tRNA i 

kolmikkompleksiga liitumist on taas võimeline initsiatsiooniks (Kapp ja Lorsch, 2004). 

Reinitsiatsiooni efektiivsuse määramisel on kriitiline uORF-i pikkus. Küüliku retikulotsüüdi 

lüsaadi süsteemis on leitud, et vähem kui 13 koodoniga uORF-id käituvad pikkusest sõltumatult 

üksteisega sarnaselt, põhjustades järgnevalt AUG-lt reportervalgu sünteesi vähenemise umbes 

30%-ni (100% oli uORF-ideta kontroll), ja uORF-i edasine pikendamine 33 koodonini põhjustab 

veel kolm korda suurema languse (Kozak, 2001). Pärmis saadi sarnane tulemus: reinitsiatsiooni 

viimaseks detekteeritavaks piiriks osutus 35 koodonit, kuid erinevusena oli ka 5- ja 11- 

koodoniliste uORF-ide vahel juba märgatav reportervalgu sünteesi vähenemine (Rajkowitsch jt., 

2004). uORF-i pikkuse mõju seletamiseks on välja pakutud, et mõned initsiatsioonifaktorid ei 

dissotsieeru kohe pärast elongatsiooni algust, vaid mõningase aja möödudes elongatsiooni käigus 

(McCarthy, 1998). Aja olulisust kinnitab reinitsiatsiooni vähenemine elongeeriva ribosoomi 

aeglustamisel sekundaarstruktuuri sisseviimisega uORF-i (Kozak, 2001) või tRNA-de tasemete 

alandamise abil (Rajkowitsch jt., 2004). Seega ei piisa reinitsiatsiooni tõenäosuse leidmiseks 

uORF-i pikkuse teadmisest. 

Vajadus kolmikkompleksi uuesti omandada põhjustab reinitsiatsiooni efektiivsuse suurenemise 

stopp- ja startkoodoni vahemaa kasvades (Abastado jt., 1991; Kozak, 1987). Umbes 100 nt 

pikkuse lõigu korral on tõhusus üldiselt juba maksimaalne, aga täpseid reegleid distantsi kohta 

pole võimalik defineerida, sest oluline on jällegi skaneerimiseks kuluv aeg ja mRNA 

sekundaarstruktuur saab mängida olulist rolli, kuna pidurdab ribosoomi liikumist (Vattem ja 

Wek, 2004). 

uORF-ide abil toimuvad geeniekspressiooni regulatsiooniviisid võib jaotada kolmeks: 1) 

valgusünteesi inhibeerimine reinitsiatsiooni või leaky scanningu vajalikkuse tõttu, 2) 

regulatsioon sünteesitava peptiidi abil ja 3) Met-tRNA i taasomandamise kiirusest sõltuv 

ekspressioon. Neist viimane on käesoleva töö seisukohalt kõige tähtsam ja on käsitletud eraldi 

(peatükis 1.5.). 

1.4.1. uORF-ide inhibeeriv mõju geeniekspressioonile 

Eespool viidatud töödest selgub, et reinitsiatsioon on võrdlemisi ebaefektiivne ja suur osa 

ribosoome dissotsieerub mRNA-lt pärast minitsistroni transleerimist. Sellest tuleneb ka kõige 

lihtsam ja sagedasem viis uORF-ide abil geeniekspressiooni reguleerida, milleks on mRNA 

transleeritavuse vähendamine. 

13

uORF-e sisaldavate 5’ liiderjärjestuste korral on näidatud, et inhibeeriv mõju on suurem tugevas 

kontekstis startkoodonitega uORF-idel (Wang ja Rothnagel, 2004). Samas võib uORF-ide 

osakaal ekspressiooni inhibitsioonis olla võrdlemisi väike, kui 5’ UTR on tugevalt struktureeritud 

(Araud jt., 2007). 

Konkreetse uORF-i täpne mõju võib sõltuda rakuliinist: mRNA 5’ capist 14 nukleotiidi kaugusel 

algav uORF osutus järgnevale reporterile inhibeerivaks T-rakulise kasvaja liinis Jurkat, kuid 

mitte HeLa emakakaelavähi rakkudes. Oletatavasti ei jõudnud HeLa puhul ribosoomid 

initsieerida uORF-i transleerimist ja toimus leaky scanning. uORF-ile eelneva järjestuse 

pikendamisel 47-nukleotiidiseks saavutati inhibitsioon ka HeLa puhul. (Ruan jt., 1994). 

Väga tugeva inhibeeriva mõjuga on uORF-id, mis lähevad valku kodeeriva (selle mRNA niiöelda 

peamise) ORF-i sisse ja seda erinevas raamis. Kui ei järgne alternatiivset startkoodonit (mis 

võimaldaks sünteesida valgu lühemat vormi, mis võib siiski olla funktsionaalne), siis ei saa 

uORF-i transleerinud ribosoom kuidagi valku toota, sest tagurpidi suunas skaneerimist ei toimu 

(Kozak, 2001). Ainus võimalus sellistelt mRNA-delt valku ekspresseerida on kontekstist sõltuv 

leaky scanning uORF-i AUG juures. Sellise regulatsiooni näideteks on roti A 2A adenosiini 

retseptor (Lee jt., 1999) ja inimese thrombopoietin (Ghilardi jt., 1998). 

On kirjeldatud ka uORF-e, mis sisaldavad mõnda haruldast koodonit, mis oluliselt aeglustab 

nende transleerimist. Selline olukord on näiteks Xenopuse Connexin41 mRNA-s, kus esimene 

uORF sisaldab vähekasutatavat leutsiini koodonit. Kuigi sellelt uORF-ilt alustatakse 

translatsiooni harva, takistab ka üksik sellel uORF-il aeglaselt elongeeriv ribosoom teiste 40S 

subühikute skaneerimist ja efekt valgu hulgale on suur (Meijer ja Thomas, 2003). 

Bioinformaatiliselt uORF-e sisaldavate ja mittesisaldavate mRNA-de ekspressiooni tasemeid ja 

eluigasid võrreldes leiti, et uORF-idega mRNA-del on keskmiselt madalam ekspressioon ja seda 

oletatavasti just kiirema lagundamise tõttu (Matsui jt., 2007). Seega võib uORF-idel lisaks 

translatsiooni inhibeerimisele olla ka üldine omadus vähendada valkude hulka mRNA 

lagundamise esilekutsumise kaudu ning valgu ekspressiooni uurimise katsetes on oluline 

kontrollida mRNA tasemeid. 

1.4.2. uORF-ilt sünteesitava peptiidi olulisus 

On teada juhtumeid, kus uORF-i kodeeritav aminohappejärjestus on väga tähtis ja selle 

muutmisel võib väheneda, kuid jääb siiski alles, uORF-i inhibeeriv roll. Praegu teadaolevalt on 

14

sellised uORF-id haruldased, samas ei kontrollita tihti esmajärjekorras aminohappelise järjestuse 

olulisust, kuna sünteesitud valgu hulga suurenemist nähakse ka lihtsalt uORF-ide startkoodoneid 

kaotades. 

Üheks selliseks näiteks on inimese onkogeen mdm2, mille normaalne transkript sisaldab kaht 

inhibeerivat uORF-i (inimesel mõlemad 15 koodonit pikad), millest ühe inhibeeriva mõju suurus 

sõltub tema aminohappelisest järjestusest (Jin jt., 2003). Kasvajarakkudes võib ekspressioon 

toimuda teiselt promootorilt, mis toodab uORF-e mittesisaldava transkripti, suurendades tugevalt 

valgu taset (Brown jt., 1999). 

Tsütomegaloviiruse glükoproteiini gpUL4 transkript sisaldab järjest kolme uORF-i, millest 

keskmisel, 23-koodonilisel, on leitud oluline järjestusespetsiifiline inhibeeriv mõju. Määravaks 

osutus peptiidi C-terminaalne järjestus, eriti kaks proliini jääki kõige lõpus, ja oletatakse, et 

toimemehhanismiks on ribosoomi terminatsiooni takistamine (in cis toime) (Alderete jt., 2001; 

Degnin jt., 1993). 

Imetajate polüamiinide biosünteesis olulise ensüümi S-adenosüülmetioniini dekarboksülaasi 

(AdoMetDC) mRNA sisaldab inhibeerivat uORF-i, mille kodeeritav peptiid on vaid kuus 

aminohapet pikk ja milles on muteerimisele tundlikud peamiselt positsioonid 4 ja 5 (Mize jt., 

1998). Oletatakse, et ka siin on takistatud terminatsioon ja on näidatud, et polüamiinide 

suurendatud kontsentratsioon stabiliseerib mitte-termineeruva kompleksi teket (Raney jt., 2002). 

Huvitav näide on seentel leitud uORF-ilt ekspresseeritav konserveerunud arginine attenuator 

peptide (AAP), mis takistab selektiivselt arginiini olemasolu korral arginiini biosünteesiraja 

teatud geeni mRNA translatsiooni. Mehhanismiks on elongeeriva ribosoomi peatamine kasvava 

peptiidi kaudu in cis ja kunstlike konstruktidega on näidatud, et efekt avaldub ka siis, kui AAP 

järjestus asetada suurema valgu keskele (Fang jt., 2004). Täiendavalt on näidatud, et ribosoomide 

peatumine AAP-l põhjustab mRNA nonsense-vahendatud lagundamist, suurendades veelgi efekti 

valgu hulgale (Gaba jt., 2005). 

Kokkuvõttes on järjestusespetsiifilisi uORF-e praegu vähe teada ja on raske leida ühiseid 

omadusi nende kodeeritavates aminohappelistes järjestustes, mis teeb nende ennustamise 

keeruliseks. Sarnasusena esineb väikeses arvus positsioonides suur tundlikkus aminohappe 

asendustele, mis terminatsiooni takistavatel peptiididel paiknevad stoppkoodoni lähedal. Ka 

nõrga kontekstiga algaval, aga ribosoomi tugevalt peataval uORF-il võib olla märkimisväärne 

15

inhibeeriv mõju, kuna 40S subühikud skaneerivad mRNA-d lineaarselt ja üks pidurdatud 

ribosoom takistab järgnevaid 40S subühikuid. 

Bioinformaatiliselt uORF-ide konserveerumist DNA ja peptiidi tasemel inimese ja hiire vahel 

võrreldes leiti üle 200 kandidaadi, mille puhul võiks oluline olla just kodeeritav peptiid (Crowe 

jt., 2006). Sobilik metoodika uuritava uORF-i kodeeritava peptiidi järjestuse olulisuse 

välistamiseks on ühenukleotiidilise raaminihke sisseviimine uORF-i, mis muudab RNA 

struktuuri minimaalselt, aga peptiidi oma maksimaalselt. Teine oluline kontroll, RNA struktuuri 

rolli uurimiseks, oleks peptiidi koodonite asendamine sünonüümsetega ja ka stoppkoodonile 

järgneva mõnekümne nukleotiidi asendamine. Seni ei ole publitseeritud eksperimentaalseid 

andmeid, mis kinnitaksid mainitud bioinformaatilise uurimustöö poolt ennustatut. 

1.5. eIF2α fosforüleerimisest sõltuv translatsiooni regulatsioon 

Kõige olulisem muutus translatsiooniaparaadis vastusena erinevatele rakulistele stressidele on 

eIF2 α-subühiku fosforüleerimine positsioonis seriin 51 (ülevaated Wek jt., 2006; Yamasaki ja 

Anderson, 2008). Pärast iga initsiatsiooni vabaneb eIF2•GDP, mis on vaja tagasi viia aktiivseks 

vormiks eIF2•GTP ja seda muutmist teostab eIF2B. eIF2α fosforüleerimine muudab ta eIF2B 

suhtes substraadi asemel inhibiitoriks ja rakus langeb eIF2•GTP kontsentratsioon, mis vähendab 

stressivastuse ajal üldist translatsiooni initsiatsiooni tasemel. 

Imetajatel on teada neli kinaasi, mis fosforüleerivad eIF2α vastusena erinevatele stressidele: 

• general control non-depressible 2 (GCN2) – aktiveeritakse aminohappepuuduse, UVkiirguse 

ja proteasoomi inhibitsiooni korral, 

• haem-regulated inhibitor (HRI) – aktiveeritakse heemipuuduse, oksüdatiivse ja 

kuumastressi poolt erütrotsüütide eellastes, 

• protein kinase R (PKR) – aktiveeritakse kaheahelalise RNA esinemisel 

(viirusinfektsioonid) 

• PKR-like endoplasmatic reticulum kinase (PERK) – aktiveeritakse vale 

konformatsiooniga valkude kuhjumise korral ER-is (endoplasmaatilises retiikulumis) 

eIF2•GTP taseme languse tõttu kulub pärast uORF-i transleerimist reinitsieeruvatel ribosoomidel 

Met-tRNA i uuesti omandamiseks stressi korral rohkem aega kui normaalolekus ja nad 

skaneerivad enne reinitsiatsioonivõime saavutamist keskmiselt kaugemale. Seega saab vastava 

16

uORF-ide paigutuse korral eIF2•GTP tase mõjutada, millist allavoolu asuvat AUG koodonit 

kasutatakse reinitsiatsiooniks pärast uORF-i transleerimist. 

1.5.1. Pärmseente general control noninducible 4 (GCN4) 

GCN4 on transkriptsioonifaktor, mis aktiveerib pärmis aminohapete sünteesi geene vastusena 

mõne aminohappe puudusele. GCN4 ekspressiooni indutseeritakse stressi poolt translatsiooni 

tasemel eIF2α fosforüleerimisest sõltuvalt. 

GCN4 mRNA sisaldab 5’ liiderjärjestuses nelja väga lühikest (kaks kuni kolm aminohapet) 

uORF-i. Hinnebuschi töögrupi poolt teostatud põhjalik uurimistöö näitab, et piisab ainult 

esimesest (uORF1) ja viimasest (uORF4), et toimuks indutseerimine stressi korral (ülevaade 

Hinnebusch, 2005). uORF1 initsiatoorseks koodoniks on mRNA esimene AUG ja seda uORF-i 

transleeritakse efektiivselt – leaky scanning praktiliselt puudub. Seejuures umbes 50% 

ribosoomidest (mis on väga suur osakaal) on võimelised reinitsieerima translatsiooni. Seevastu 

uORF4 kujutab endast takistust edasisele translatsioonile: tema stoppkoodonile järgnev RNA 

sekundaarstruktuur vähendab reinitsiatsioonivõimeliste ribosoomide arvu, oletatavasti 

transleerimise aega pikendades (Grant ja Hinnebusch, 1994; Mueller jt., 1988). Lisaks põhjustab 

väike distants uORF4 lõpust GCN4 startkoodonini väheste reinitsiatsioonivõimeliste ribosoomide 

möödaskaneerimist GCN4 initsiaatorkoodonist, kuna pole jõutud uuesti omandada 

kolmikkompleksi (Miller ja Hinnebusch, 1989). 

Seega, kui transleeritakse uORF4, siis GCN4 ORF-ilt saadakse valku väga vähe. Regulatsioon 

tuleneb asjaolust, et stressi puudumise korral jõuavad praktiliselt kõik pärast uORF1 skaneerima 

jäänud ribosoomid uORF4 juures reinitsieeruda ja pärast terminatsiooni dissotsieeruvad. Stressi 

all kannatavas rakus jõuab uORF4 juures reinitsieeruda vaid 50% skaneerima jäänud 

ribosoomidest ja ülejäänud 50% jõuavad transleerida GCN4 valku. Tulemuseks on GCN4 väga 

suur translatsiooniline induktsioon. 

1.5.2. Selgroogsete activating transcription factor 4 (ATF4) 

Selgroogsetes on leitud analoogne regulatsioonisüsteem transkriptsioonifaktori ATF4 puhul. 

ATF4 kuulub basic region-leucine zipper (bZIP) transkriptsioonifaktorite perekonda ja reguleerib 

paljusid stressiga seotud geene (Ameri ja Harris, 2008). Erinevad stressivastuse rajad rakus 

konvergeeruvad ühes punktis, milleks on eIF2α fosforüleerimine (nelja erineva kinaasi poolt, 

17

nagu ülalpool kirjeldatud) ja järgnev valgusünteesi üldine pidurdumine. ATF4 mRNA 

transleerimine stressi ajal aga ei vähene, vaid erandlikult suureneb hulk kordi. 

Joonis 1. eIF2α fosforüleerimine suurendab ATF4 translatsiooni reinitsiatsioonist sõltuva mehhanismiga. ATF4 mRNA on 

kujutatud joonena ja ristkülikud tähistavad uORF-e 1 ja 2 ning ATF4 kodeerivat regiooni. Ribosoomi 40S subühik on 

tumendatud, kui ta on seotud kolmikkompleksiga (eIF2•GTP•Met-tRNA i ). On näidatud ATF4 mRNA transleerimine 

normaaloleku ja stressi korral. Mõlemal juhul transleeritakse uORF1. Normaaloleku korral on kolmikkompleksi tase rakus kõrge 

ja jõutakse reinitsieeruda uORF2 translatsiooniks. uORF2 kattub osaliselt ATF4 kodeeriva regiooniga ja ATF4 valku toodetakse 

vähe. Stressi korral on eIF2α fosforüleerimise tõttu eIF2-GTP tase madal, 40S subühik skaneerib kauem enne kolmikkompleksi 

omandamist ja möödub uORF2 startkoodonist, mille järel saab transleerida ATF valku. (joonis Wek ja Cavener, 2007 järgi) 

ATF4 mRNA 5’ liiderjärjestus sisaldab kahte konserveerunud uORF-i (joonis 1.). Esimene 

(uORF1) on vaid 12 nt pikk ja teine (uORF2) 180 nt, kuid kattub 83 nt osas ATF4 kodeeriva 

ORF-iga erinevas lugemisraamis (pikkused inimese järgi). uORF1 transleeritakse efektiivselt ja 

paljud ribosoomid on võimelised pärast seda reinitsieeruma. Kuna uORF2 kattub ATF4 ORF-iga 

erinevas raamis, siis uORF2 transleerinud ribosoomil pole võimalik toota ATF4 valku. uORF1 

stopp- ja uORF2 startkoodonite vahemaa on inimesel 87 nt ja see kaugus on indutseerimise jaoks 

kriitiline (täpsemalt skaneerimise aeg). eIF2α ulatusliku fosforüleerimise korral ei jõua pärast 

uORF1 transleerimist skaneerima jäänud 40S subühikud omandada uuesti Met-tRNA i ja liiguvad 

mööda uORF2 startkoodonist ning toodetakse ATF4 valku (Lu jt., 2004; Vattem ja Wek, 2004). 

Selle töö tegemise ajal avaldati kaks artiklit selle kohta, et ATF5 (activating transcription factor 

5) omab translatsioonilist ülesreguleerimise mehhanismi, mis on väga sarnane ATF4 omale 

(Zhou jt., 2008; Watatani jt., 2008). 

18

2. EKSPERIMENTAALOSA 

2.1. Materjal ja metoodika 

2.1.1. mRNA 5’ UTR-ide otsinguprogrammide valmistamine 

Programmid potentsiaalsete stressi korral reinitsiatsiooniliselt ülesreguleeritavate geenide 

leidmiseks kirjutati Java keeles kasutades töökeskkonnana Eclipse’i (http://www.eclipse.org/). 

mRNA järjestuste allikana kasutati inimese RefSeq (Reference Sequence) kureeritud 

mittekorduvat kollektsiooni (Pruitt jt., 2007), mis on koostatud NCBI (National Center for 

Biotechnology Information) poolt (kättesaadav ftp://ftp.ncbi.nih.gov, allalaadimise kuupäev 21. 

september 2007). 5’ UTR-iks loeti järjestuse alguse ja kodeeriva järjestuse alguse (CDS, coding 

sequence) vaheline piirkond. Eksperimentaalset kinnitust leidnud mRNA-d on kogus tähistatud 

accessioni eesliitega ”NM”. 

uORF-ide transleeritavuse kontekst loeti tugevaks ehk väga heaks, kui oli olemas positsioonis -3 

A või G ja +4 G (ehk A/GNNAUGG). Kui oli täidetud üks või mitte ükski neist tingimustest, siis 

loeti uORF selle töö eesmärkide jaoks ebapiisavas kontekstis olevaks. 

2.1.2. Valmistatud otsinguprogrammide ülesehitus 

Programmeerimisel kasutati objektorienteeritud lähenemist. Esmalt loeti andmefailist mRNA 

informatsioon. Andmekogust eraldati mRNA järjestus, RefSeqi sissekande kood ja CDS-i 

alguspositsioon. Ühe mRNA informatsiooni hoidis vastava klassi (programmi alaosa) isend, 

millele anti ette andmekogust saadud väärtused. Iga isend otsis kõik oma mRNA uORF-id ja 

nende andmed ning hoidis selle mRNA uORF-ide isendite nimekirja. Samuti salvestati selle 

klassi isendile antud mRNA ekspressiooniandmed ja tähis UniGene’i andmebaasis. Ühe uORF-i 

andmete salvestamise klassi isend säilitas järgnevat informatsiooni: uORF-i algus- ja lõpppositsioon, 

pikkus nukleotiidides, kas uORF on osaliselt CDS-i sees sellest erinevas 

lugemisraamis ning hinnang uORF-i startkoodoni kontekstile. mRNA-de sorteerimist 

(selektsiooni) teostas klass, mis omas selleks vastavaid meetodeid. Efektiivsuse mõttes rakendati 

selektsioonitingimusi järjekorras, mis eeldatavasti vähendaks kandidaatide arvu kõige kiiremini. 

Tulemused kirjutati tekstifaili. 

19

Eraldi klassid valmistati mRNA ekspressiooniandmete kogumiseks. Kuna see etapp teostati kõige 

lõpus, siis oli järele jäänud vähe mRNA-sid ja andmete kogumiseks oli soblik kasutada päringuid 

NCBI serveris asuvasse UniGene EST (expressed sequence tag) Profile Viewerisse. 

Ekspressiooniandmete lehelt eraldati kõigi väljatoodud kudede kohta TPM (transcripts per 

million) väärtused ja loeti ka kokku mitmes koes TPM ületas meie soovitud väärtuse 50. 

Tulemused salvestati iga mRNA isendile. 

2.1.3. mRNA-de selektsiooni käsitsi läbiviidud etapid 

Erinevate mRNA-de ekspressiooni hinnati EST-de sekveneerimisandmete põhjal, mille päritolu 

on kirjeldatud eelmises alateemas. 

Alternatiivsete mRNA isovormide vaatamiseks kasutati Entrez Gene’i sissekandeid ja 

homoloogsete geenide leidmiseks teistes organismides UniGene’i (mõlemad NCBI poolt). 

RNA sekundaarstruktuuride kontrollimiseks kasutati programmi mfold (versioon 3.2) (Mathews 

jt., 1999; Zuker, 2003). 

uORF-ide struktuur loeti konserveerunuks, kui säilinud oli tugeva kontekstiga uORF-ide arv, 

paigutus mRNA-l (uORF-ide omavaheline kaugus ja viimase uORF-i kaugus CDS-i algusest; 

lubatav kõikumine umbes ±30 nt) ja tugeva kontekstiga uORF-ide pikkus (lubatav kõikumine 

umbes ±20%). Kui kõikumised olid lubatavatest suuremad, kuid säilinud oli tugeva kontekstiga 

uORF-de arv, siis teostati multiple alignment ClustalW abil (Chenna jt., 2003). 

Konserveerumise tuvastamist piiras 5’ otsast täispikkade või piisavalt pikkade cDNA järjestuste 

olemasolu eri liikidel ja seetõttu on välja toodud vähe näiteid, kus leiti mittekonserveerumine. 

uORF-ide konserveerumise hindamiseks andmete saamiseks rakendati ka NCBI BLAST-i (Basic 

Local Alignment Search Tool) EST-dest, kuna 5’ otsast sekveneeritud EST-d katavad tihti ära 5’ 

UTR-i. Inimahvidel ja makaakidel oli konserveerumine peaaegu alati leitav ja seda ei ole eraldi 

välja toodud. 

2.1.4. Kasutatud cDNA-de segu 

Töös uuritavate järjestuste ülespaljundamisel lähtuti tapsigargiini poolt indutseeritud ER stressi 

all kannatavate HepG2 inimese hepatoomi rakkude summaarse RNA pealt sünteesitud cDNA-de 

segust (valmistatud Tõnis Ördi poolt). Segu valmistati GeneRacer kitiga (Invitrogen), mis 

põhineb 5’ RACE-il (rapid amplification of cDNA ends). Selle käigus ligeeriti mRNA 5’ capi 

20

asemele GeneRacer RNA oligonukleotiid (järjestusega 5’-CGA CUG GAG CAC GAG GAC 

ACU GAC AUG GAC UGA AGG AGU AGA AA-3’, alla on joonitud tugevas kontekstis ORF, 

mille hiljem eemaldasime mutageneesiga). Pöördtranskriptsioonil kopeeritakse see järjestus 

cDNA-sse ja järgneval amplifikatsioonil sellelt järjestuselt praimeerides on tulemuseks mRNA 5’ 

otsani ulatuvad cDNA-d, mis sisaldavad 5’ otsas ka GeneRacer RNA oligonukleotiidi järjestust. 

2.1.5. Kasutatud kommertsiaalsed plasmiidid 

Väljavalitud mRNA 5’ UTR-ide testimisel valiti lähtevektoriks pGL3-Control (Promega) (joonis 

2A). Plasmiid sisaldab SV40 (Simian Virus 40) varajast promootorit ja enhaanserit. 

Transkriptsiooni alguspunktid asuvad positsioonides 185, 191 ja 196 (pCAT3 Control Vectori 

põhjal, mis sisaldab sama promootorit; http://www.promega.com/faq/catfaq.html#q16 ja mõlema 

vektori sekventsid). Reportervalk on modifitseeritud Photinus pyralise (firefly) lutsiferaas (luc+ 

või fluc). 

Tulemuste normaliseerimiseks kahe lutsiferaasi reportersüsteemis valiti vektor pRL-TK 

(Promega) (joonis 2B). Plasmiid sisaldab HSV-TK (Herpes Simplex viiruse tümidiinkinaas) 

promootorit, mis on võrreldes teiste levinud viiruslike promootoritega vähemtundlik erinevatele 

kasvutingimustele (http://www.promega.com/enotes/faqspeak/9912/fq0013.htm). Reportervalk 

on modifitseeritud Renilla reniformise lutsiferaas (Rluc), mille ekspressiooni tõstimiseks on 

vektorisse pandud ka intron. 

Joonis 2. Töös kasutatud kommertsiaalsete plasmiidide tähtsamad komponendid tsirkulaarsetel kaartidel. Mõlemad on 

firmalt Promega. A. pGL3-Control, B. pRL-TK. Joonised pärinevad Promega käsiraamatutest. Tähistused: luc+, modifitseeritud 

firefly lutsiferaas; Rluc, Renilla lutsiferaas; Amp r , ampitsilliini resistentsusgeen E. colis; ori, replikatsiooni alguspunkt E. colis; 

nooled näitavad transkriptsiooni suunda (f1 ori puhul ssDNA sünteesi suunda); -^-, introni asukoht. 

21

2.1.6. Polümeraasi ahelreaktsioonide teostamine 

Järgnevates alapunktides on välja toodud põhimõtted, millest lähtuti PCR-ide tegemisel. Kõik 

PCR-id teostati aparaadiga Mastercycler Gradient (Eppendorf). Reaktsioonisegud valmistati jääl. 

Sulamistemperatuurid (T m ) määrati firma Finnzymes koduleheküljel oleva veebirakenduse abil 

(https://www.finnzymes.fi/tm_determination.html), mis kasutab nearest-neighbor meetodit 

(Breslauer jt., 1986). 

2.1.6.1. Plasmiidsete konstruktide valmistamiseks kasutatud DNA 

fragmentide paljundamine PCR-iga 

Kloneerimisel kasutati ensüümi Phusion (Finnzymes), et vähendada punktmutatsioonide tekke 

tõenäosust. Kuna produkti vajati edasiseks töötlemiseks, siis teostati reaktsioonid suuremas 

ruumalas (25 või 50 µl). 

Kasutati geenispetsiifilist praimerit iga väljavalitud mRNA (cDNA) 5’ flanki lõpust (valgu 

startkoodoni juurest) ning enamasti mittespetsiifilist praimerit cDNA 5’ otsast, mis vastas kõigil 

cDNA-del seal olevale lisajärjestusele (2.1.4.). Oligonukleotiidide 5’ otstesse asetati add-on 

mutageneesi jaoks restriktsioonisaidid ja lisanukleotiidid (vajalikud, et ensüüm lõikaks; 

http://www.fermentas.com/techinfo/re/restrdigpcrii.htm). Kasutatud järjestused on toodud tabelis 

1. 

Tabel 1. Oligonukleotiidid, mida kasutati mRNA (cDNA) 5’ UTR-ide amplifitseerimisel ja modifitseerimisel PCR-i abil. 

Alla on joonitud restriktsioonisaidid (Hind III – AAGCTT, Nco I – CCATGG, Pag I – TCATGA). GenR-5mut-H3 järjestuses on 

mustal taustal initsiatoorse koodoni kaotamiseks tehtud mutatsioon. 

Nimi Järjestus (5’→ 3’) Seondumiskoht 

Sense praimerid 

GENRACE-5-H3 CCC AAG CTT CGA CTG GAG CAC GAG GAC ACT GAC iga täispika cDNA algus 

GenR-5mut-H3 CCC AAG CTT GAG GAC ACT GAC AAG GAC TGA AGG AG iga täispika cDNA algus 

ATF4-Hind-5PR CCC AAG CTT GGA CTG AAG GAG TAG AAA CAT TTC ATF4 mRNA 5’ ots 

NACA-Hind-5PR CCC AAG CTT GGA CTG AAG GAG TAG AAA AAG TAC NACA mRNA 5’ ots 

Antisense praimerid 

hNACA-Nco-AS CCGCCATGGGCATTTCCTTTTCTGGATCCTGTG NACA mRNA 5’ UTR-i lõpp ja CDS-i algus 

hATF5-Pag-AS CCCTCATGAGTGACATGGCTGTAGCACAGGTG ATF5 mRNA 5’ UTR-i lõpp ja CDS-i algus 

22

hATF4-Pag-AS CCCTCATGACGGTCATGTTGCGGTGCTTTGCTG ATF4 mRNA 5’ UTR-i lõpp ja CDS-i algus 

SMEK2-Pag-AS CCCTCATGACCGACATGGTGGCTGCTGTCTCCA SMEK2 mRNA 5’ UTR-i lõpp ja CDS-i algus 

SLC35-Pag-AS CTCTCATGATCCCCATTCGTGGCGGCTGCAGCA SLC35C2 mRNA 5’ UTR-i lõpp ja CDS-i algus 

hDPP9-Nco-AS CAACCATGGTGGCCATCCTCTCAGCCCCCTC DPP9 mRNA 5’ UTR-i lõpp ja CDS-i algus 

Reaktsioonisegu (25 µl reaktsiooni kohta): 

Komponent 

Lõppkontsentratsioon 

5X Phusion HF puhver (Finnzymes) 1X 

DMSO (100%) (Finnzymes) 3% 

4dNTP-d (25 mM igaüks) (Fermentas) 300 µM igaüks 

praimerid (100 µM) (DNA Technology A/S) 500 nM kumbki 

matriits cDNA-d 0,2 µl / 25 µl segu; plasmiidi 10 ng / 25 µl 

Phusion DNA pol. (2 U/µl) (Finnzymes) 0,02 U/µl 

H 2 O mahuni 25 µl 

Erandlikult kasutati cDNA-de segust paljundamisel mitte-spetsiifilist 5’ otsa praimerit 

(GENRACE-5-H3) kolmekordses kontsentratsioonis. 

PCR-i programm: 

Algne denaturatsioon: 98 °C 30 sekundit 

35 tsüklit cDNA-de segust, 25 tsüklit plasmiidilt: 

Denaturatsioon: 98 °C 10 sekundit 

Seondumine: T m + 3° 10 sekundit 

Süntees: 72 °C 30 sekundit/kb 

Otste täissünteesimine: 72 °C 2 minutit 

Kui T m + 3° oli vähemalt 72 °C, siis teostati two-step PCR, kus jäeti ära eraldi seondumise etapp. 

Vajadusel, ja kui praimerid võimaldasid, teostati two-step PCR-i ka seondumine/süntees 76 °C 

juures. 

2.1.6.2. Bakterikolooniate analüüs PCR-i abil 

Pärast transformeerimist analüüsiti bakterikolooniaid PCR-iga Taq polümeraasi abil. 

Amplikoniks valiti tavaliselt plasmiidi sisestatud fragment, et hinnata võimalikult täpselt selle 

pikkust. mRNA (cDNA) 5’ UTR-i lõpule vastav praimer oli geenispetsiifiline, kontrollimaks 

23

proovi õigsust, ja 5’ UTR-i algusele vastav praimer oli enamasti mitte-geenispetsiifiline 

(praimerid on toodud tabelis 1 eelmises alateemas). Kui oli vajalik kontrollida inserdi suunda või 

mitme inserdi olemasolu, siis võeti üks või mõlemad praimerid vektori selgroost. Kasutati 

inserdist eestpoolt oligonukleotiidi pGL3-Not (süntees sense suunas, 5’- 

GGTACGGGAGGTACT-3’) ja tagantpoolt Luc2-AS-i (antisense suunas, 5’- 

GGCGTATCTCTTCATAGCCTTATGCAG-3’). 

Reaktsioonisegu (10 µl reaktsiooni kohta): 

Komponent 


10X puhver Yellow (Naxo) 

1X 

MgCl 2 (25 mM) (Naxo) 

2 mM 

4dNTP-d (25 mM igaüks) (Fermentas) 200 µM igaüks 

praimerid (100 µM) (DNA Technology A/S) 300 nM igaüks 

Smart-Taq Hot-Start (10 U/µl) (Naxo) 0,05 U/µl 


kolooniast steriilse tikuga baktereid - 

PCR-i programm: 

Denaturatsioon ja ensüümi aktivatsioon: 95 °C 15 minutit 

25 tsüklit: 

Denaturatsioon: 95 °C 30 sekundit 

Praimerite seondumine: T m - 5° 30 sekundit 

Süntees: 72 °C 60 sekundit/kb 

Otste täissünteesimine: 72 °C 5 minutit 

2.1.7. DNA analüüs elektroforeesi abil agaroosgeelis 

DNA fragmentide pikkust kontrolliti elektroforeesiga 1X TAE puhvris agaroosgeelis. DNA 

visualiseerimiseks lisati geeli etiidiumbromiidi (EtBr) lõppkonsentratsiooniga 0,05 µg/ml. 

Elektroforees viidi läbi elektrivälja tugevusel 5 V/cm. Markeritena kasutati GeneRuler 100 bp 

DNA Ladderit (Fermentas) ja faagi λ DNA-d, mis oli lõigatud restriktaasiga Eco91I (BstEII) 

(Fermentas). 

Kindla pikkusega DNA fragmentide kättesaamiseks segust tehti preparatiivne geelelektroforees. 

Geel ühendati puhvriga filterpaberist sildade abil. Rakendati elektrivälja tugevusega 4-7 V/cm. 

24

Pärast elektroforeesi lõigati skalpelliga 366 nm UV all geelist välja soovitud fragmendid. Tuubid 

geelitükkidega külmutati ja seejärel sulatati, et kätte saada DNA-d sisaldav lahus. 

2.1.8. DNA puhastamine reaktsioonisegudest 

DNA väljapuhastamine PCR- või restriktsioonisegust toimus sidumiskolonnil põhineva 

QIAquick PCR Purification Kiti (QIAGEN) abil, kasutades mikrotsentrifuugi. Järgiti tootja 

protokolli, kusjuures elueeriti 30 µl eluatsioonipuhvriga (10 mM Tris-Cl, pH 8,5). 

2.1.9. DNA restriktsioon 

DNA restriktsioonil kasutati ensüüme ja puhvreid firmalt Fermentas. Reaktsioonisegu ruumala 

oli ühe ensüümiga lõikamisel 15 µl ja kahe ensüümiga üheaegsel lõikamisel 30 µl. Kahe 

ensüümiga üheaegsel lõikamisel kasutati puhvri valimiseks Fermentase DoubleDigest 

veebirakendust (http://www.fermentas.com/doubledigest/index.html). Ensüümi pandi segusse 10 

U (vajadusel kahte ensüümi, kumbagi 10 U) ja sobivat puhvrit lõppkontsentratsioonini 1X. Kui 

lõigatav DNA oli PCR-produkt, siis see puhastati QIAquick kolonniga ja võeti eluaati kuni 

soovitud segu ruumalani. Kui DNA oli plasmiid (~5000 bp), siis seda võeti 3 µg ja lisati Milli-Q 

vett soovitud segu ruumalani. Restriktsioon toimus 37 °C juures 1-4 tundi. Vajadusel inaktiveeriti 

restriktaasid termiliselt vastavalt tootja soovitustele. 

2.1.10. DNA 5’ üleulatuvate otste täitmine Klenow fragmendiga 

Restriktsioonil tekkinud 5’ üleulatuvad otsad tömbistati vajadusel DNA polümeraas I Klenow 

fragmenti kasutades. 30 µl inaktiveeritud restrikteeritud DNA lahusele, mis sisaldas 3 µg 

plasmiidi, lisati 30 µl 1X Klenow puhvrit (Fermentas), 4dNTP-d lõppkontsentratsiooniga 0,25 

mM (Fermentas) ja 10 U Klenow fragmenti (Fermentas). Reaktsioon kestis 15 minutit 37 °C 

juures. Vajadusel inaktiveeriti ensüüm termiliselt. 

2.1.11. Restrikteeritud DNA 5’ otste defosforüleerimine 

Lõigatud vektoritele teostati iseendaga ligeerumise vältimiseks fosfataasiga töötlus. Kasutati calf 

intestine alkaline phosphatase’i (CIAP) (Fermentas). Seda lisati restriktsioonisegusse 

restriktsiooni järel 0,5 U ja inkubeeriti 37 °C juures 1 tund. Vajadusel inaktiveeriti fosfataas 

kuumutades reaktsioonisegu 85 °C juures 20 minutit. 

25

2.1.12. DNA fragmentide ligeerimine 

Ligeerimised teostati ruumalas 10 µl ja kasutati 2 ühikut T4 DNA ligaasi (Fermentas). 

Reaktsioon viidi läbi 1X ligeerimispuhvris (Fermentas). Kui vektor ei olnud geelil puhastatud, 

siis võeti seda 50 ng. Kui vektor oli geelil puhastatud, siis võeti 3 µl geelitükist välja sulanud 

lahust. Kui insert ei olnud geelil puhastatud, siis võeti 0,5 µl inaktiveeritud restriktsioonisegu. 

Kui insert oli geelil puhastatud, võeti geelitükist välja sulanud lahust 6 µl. Alati tehti ka ilma 

inserdita kontroll-ligeerimine. Ligeerimisreaktsioon toimus toatemperatuuril vähemalt 2 tundi. 

2.1.13. Bakterirakkude transformatsioon 

Kasutati kompetentseid E. coli DH5α rakke, mis olid valmistatud Tõnis Ördi poolt Inoue 

meetodil (Inoue jt., 1990). Rakud sulatati aeglaselt ning 80 µl rakususpensioonile lisati 5 µl 

ligeerimissegu ja inkubeeriti jääl 15 minutit. Teostati heat-shock 42 °C vesivannil 30 sekundit. 

Seejärel pipeteeriti suspensioonile peale 1 ml LB söödet ja hoiti taastumiseks 1 tund 37 °C juures. 

Suspensioonist plaaditi leegi kõrval välja 80 µl ampitsilliini (100 µg/ml) sisaldavatele LB 

tardsöötme selektiivtassidele. Tasse inkubeeriti 12-18 tundi 37 °C juures. 

Tassidel loendati kolooniad ja võrdluses ilma inserdita ligeerimisega järeldati positiivsete 

(inserdiga) kolooniate osakaal. Ruudustikuga tassile külvati välja 5-10 kolooniat edasiseks 

analüüsiks PCR-iga. 

2.1.14. Plasmiidse DNA eraldamine 

Midipreparatsiooni jaoks kasvatati plasmiidiga E. coli DH5α kolooniast rakke 50 ml LB söötmes, 

kuhu oli lisatud ampitsilliini (100 µg/ml), 16 tundi 37 °C loksutil. Bakterid tsentrifuugiti kokku 

[10 min, 5000 rpm (4800 g) (Sorvall RC-5B, rootor HS-4)] ja plasmiidi eraldamiseks kasutati 

QIAGEN Plasmid Midi Kiti (QIAGEN). 

Minipreparatsiooni jaoks kasvatati plasmiidiga E. coli DH5α rakke 3 ml LB söötmes, kuhu oli 

lisatud ampitsilliini (100 µg/ml), 12 tundi 37 °C loksutil. Plasmiidi eraldamiseks kasutati 

Invisorb Spin Plasmid Mini Two Kiti (Invitek). 

DNA kontsentratsioon määrati spektrofotomeetriliselt 260 nm juures ning hinnati 

geelelektroforeesil. 

26

2.1.15. DNA sekveneerimine 

DNA sekveneerimiseks teostati tsüklilist sekveneerimist fluorestseeruvate 

terminaatornukleotiididega. Kasutati BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kiti 

komponente (Applied Biosystems). Plasmiidi pGL3-Control (Promega) sisestatud fragmentide 

kontrollimiseks kasutati tootja poolt soovitatud järjestustega oligonukleotiide RVprimer3 (sense 

suunas, 5’-CTAGCAAAATAGGCTGTCCC-3’) ja GLprimer2 (antisense suunas, 5’- 

CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA-3’) (http://www.promega.com/tbs/tm033/tm033.pdf) ning 

Luc2-AS (antisense suunas, 5’-GGCGTATCTCTTCATAGCCTTATGCAG-3’). 

Sekveneerimisreaktsiooni segu (10 µl reaktsiooni kohta): 

Komponent 


BigDye 3.1 Sequencing Buffer (5X) (Applied Biosystems) 1X 

praimer (5 µM) (DNA Technology A/S) 

160 nM 

Sequencing Mix BigDye 3.1 (Applied Biosystems) 0,7 µl/10 µl segu 

plasmiidi lahjendus (300 ng/µl) 

300 ng/10 µl segu 


Reaktsioon teostati aparaadiga Mastercycler Gradient (Eppendorf) kasutades järgnevat 

programmi: 30 tsüklit: 95 °C 25 sekundit, 50 °C 20 sekundit, 60 °C 60 sekundit. 

Pärast reaktsiooni lisati segule produkti sadestamiseks 2 µl kandjat (roosa dekstraan, ilma EDTAta) 

ja 3 mahtu (30 µl) 96% etanooli ning inkubeeriti 10 minutit -20 °C juures. Seejärel 

tsentrifuugiti mikrotsentrifuugiga 15 minutit kiirusel 13000 rpm (16060 g). Supernatant 

eemaldati, lisati 200 µl 70% etanooli ja tsentrifuugiti 10 minutit kiirusel 13000 rpm (16060 g). 

Supernatant eemaldati täielikult ja pandi peale 10 µl formamiidi sisaldavat MegaBACE Loading 

Solutionit (GE Healthcare Life Sciences). 

Reaktsiooniproduktide analüüsiks kasutati Eesti Biokeskuse sekveneerimise tuumiklabori 

teenust. Sekveneerimisel saadud andmete analüüsimisel kasutati programme BioEdit (Hall, 1999) 

ning NCBI koduleheküljel asuvat BLAST-i. 

27

2.1.16. Ülevaade 5’ UTR-i sisaldavate esialgsete 

reporterkonstruktide valmistamisest 

Käesolevas alateemas mainitud meetodite täpsed kirjeldused on toodud eraldi vastavates 

teemades. 

Soovitud mRNA-de 5’ UTR-idele vastavate DNA fragmentide saamiseks teostati PCR ER 

stressis HepG2 inimese hepatoomi rakkudel põhinevast cDNA-de segust. Sense praimeriks oli 

kõigil juhtudel GENRACE-5-H3 ja antisense praimeriks vastavalt hATF4-Pag-AS, hATF5-Pag- 

AS, hNACA-Nco-AS, SMEK2-Pag-AS, SLC35-Pag-AS või hDPP9-Nco-AS. Fragmentide 

otstesse tekitati 5’ add-on mutageneesi abil restriktsioonisaidid. Kasutati two-step PCR-i: ATF4, 

ATF5 ja NACA jaoks sünteesitemperatuuriga 72 °C ning SLC35C2, DPP9 ja SMEK2 jaoks 76 

°C. 

PCR-i abil paljundatud 5’ UTR-id ligeeriti plasmiidi pGL3-Control (Promega) SV40 promootori 

järele (Hind III ja Nco I saitide vahele) nii, et uuritava mRNA valgu initsiatoorsest koodonist 

algav lugemisraam liitub õiges faasis lutsiferaasi kodeeriva alaga (lisati peale 5’ UTR-i ka 2-3 

aminohapet lutsiferaasile, järjestused on toodud joonisel 3 järgmises alateemas). 

Enne restrikteerimist puhastati DPP9, SLC35C2 ja SMEK2 5’ UTR-idele vastavad DNA 

fragmendid preparatiivsel geelil ja amplifitseeriti täiendaval PCR-il (two-step PCR 

sünteesitemperatuuriga 72 °C). Seejärel puhastati kõik PCR-il saadud DNA fragmendid 

sidumiskolonniga (QIAquick). ATF4, ATF5, SMEK2 ja SLC35C2 5’ UTR-idele vastavad DNA 

fragmendid restrikteeriti Hind III-ga, puhastati segu uuesti ja restrikteeriti Pag I-ga. NACA 5’ 

UTR-ile vastav DNA fragment lõigati üheaegselt Hind III ja Nco I-ga. DPP9 5’ UTR-ile vastav 

DNA fragment lõigati ainult Nco I-ga. ATF4, ATF5 ja NACA 5’ UTR-idele vastavad 

restriktsioonisegud inaktiveeriti termiliselt. Ülejäänud DNA fragmendid puhastati preparatiivsel 

geelil. 

Vektor kõigile peale DPP9 5’ UTR-i restrikteeriti üheaegselt Hind III ja Nco I-ga, seejärel 

töödeldi fosfataasiga (CIAP) ja inaktiveeriti (85 °C 20 min). Vektor DPP9 5’ UTR-i jaoks lõigati 

Hind III-ga, inaktiveeriti termiliselt, täideti E. coli DNA polümeraas I Klenowi fragmendiga 

üleulatuvad 5’ otsad, puhastati segust (QIAquick), lõigati Nco I-ga ja eraldati preparatiivsel 

geelil. 

28

Kõik ligeerimised olid kleepuvate otstega (välja arvatud DPP9 5’ UTR-ile vastava DNA 

fragmendi mitte-Nco I ots) ja erinevate üleulatuvate järjestustega 5’ ja 3’ otsas. Vajadusel 

kasutati asjaolu, et Pag I ja Nco I moodustavad omavahel paarduvad otsad. 

Ligeerimisseguga transformeeriti baktereid, PCR-iga selekteeriti positiivne koloonia ja sellest 

eraldati plasmiid minipreparatsiooniga. 

2.1.17. GeneRacer RNA oligos sisalduva ORF-i kaotamine 

reporterplasmiididest 

Käesolevas alateemas mainitud meetodite täpsed kirjeldused on toodud eraldi vastavates 

teemades. 

cDNA molekulide alguses olevas GeneRacer RNA oligonukleotiidile komplementaarses osas 

sisaldub lühike (9 nt) avatud lugemisraam, mis on tugeva kontekstiga translatsiooni 

initsiatsiooniks (joonis 3). See ORF kaotati ära uuritavates 5’ UTR-iga reporterplasmiidides. 

ATF5 5’ UTR-i sisaldavas reporterplasmiidis puudus see ORF algusest peale, ilmselt tingituna 

GeneRacer RNA oligonukleotiidi sünteesil aset leidnud veast (ATF5 5’ UTR-i plasmiidi 

GeneRacer oligonukleotiidile vastavas lõigus puuduvad ORF-i initsiatoorse koodoni nukleotiidid 

A ja T). 

ATF4 ja NACA 5’ UTR-ide jaoks disainiti spetsiifilised sense praimerid ATF4-Hind-5PR ja 

NACA-Hind-5PR. Vastaspraimerid olid nagu cDNA-st PCR-il (eelmine alateema). Nende 

praimerite abil paljundati PCR-iga esialgsetelt plasmiididelt uuesti vastavad 5’ UTR-id, mis olid 

nüüd lühendatud nii, et ei sisalda GeneRacer oligonukleotiidi ORF-i. Otse cDNA-st PCR-il ei 

saanud selliseid oligonukleotiide kasutada, sest see oleks ära määranud produktide 5’ otsa, mida 

me aga tahtsime katseliselt kontrollida. 

DPP9, SLC35C2 ja SMEK2 5’ UTR-ide puhul kasutati lugemisraami kaotamiseks PCR-i 

esialgselt plasmiidilt punktmutatsiooni sisaldava oligonukleotiidiga GenR-5mut-H3 (ORF-i 

startkoodonis ATG → AAG) ja geenispetsiifiliste vastaspraimeritega nagu esialgsel 

amplifikatsioonil (eelmine teema). Gradiendikatse põhjal leiti sobivaks seondumistemperatuuriks 

62 °C (andmed pole näidatud). Otse cDNA-st selle praimeriga ei olnud võimalik reaktsiooni 

teostada, sest spetsiifika tagamiseks oleks 62 °C olnud liiga madal. 

29

Muteeritud fragmentidest koostati plasmiidid nagu esialgselt (eelmine teema), valmistati 

midipreparatsioon ja saadud plasmiidide korrektsust kinnitati sekveneerimisega. Saadud lõplike 

plasmiidide insertide alguse ja lõpu järjestused on toodud joonisel 3. 

Joonis 3. Töö jaoks koostatud lõplike plasmiidide insertide algus- ja lõpposa konstruktsioonid. Plasmiidid on joonisel 

nimetatud 5’ UTR-i päritolugeeni järgi. Toodud on järjestused sense ahelalt. 5’ otsast kloneeriti kõik fragmendid vektorisse 

pGL3-Control Hind III saiti (DPP9 puhul tömbistati see Klenow fragmendiga ja ligeeriti tömbilt). Näha on cDNA-de 5’ otsast 

täispikkuse kindlustamiseks mRNA-de külge ligeeritud GeneRacer RNA oligo. Poolpaksus kirjas on toodud selle sees asuv ORF 

ja iga plasmiidi juures on välja toodud selle kaotamise tulemus. Inserdi lõpus, mis on ühtlasi uuritava 5’ UTR-i lõpp, on 

poolpaksus kirjas kaks samas raamis startkoodonit: esimene pärineb uuritavast cDNA-st ja teine on vektori originaalne firefly 

lutsiferaasi (luc+) startkoodon. Alla on joonitud inserdi (5’ UTR-i) 3’ otsa ligeerimiskoht (restriktaasid: Nco I – CCATGG, Pag I 

+ Nco I – TCATGG). 

2.1.18. Koekultuuri rakkude kasvatamine 

Katsetes kasutati HepG2 inimese hepatoomirakkude liini (American Type Culture Collection). 

Rakke kasvatati söötmes IMDM (Iscove’s modified Dulbecco’s medium) (Gibco), millele lisati 

10% veise loote seerumit (fetal calf serum, FCS) (Gibco) ning penitsilliini 100 U/ml ja 

streptomütsiini 100 ng/ml. Rakke inkubeeriti 37 ºC ja 5% CO 2 sisalduse juures. 

2.1.19. Koekultuuri rakkude transfektsioon 

Transfektsioon teostati polüetüleenimiinil (PEI) põhineva ExGen 500 in vitro Transfection 

Reagenti (Fermentas) abil. 

Enne transfektsiooni vahetati 60-75% konfluentsetel rakkudel sööde. Lähtuti tootja protokollist. 

24 kannuga plaadil HepG2 rakkude jaoks kasutati kannu kohta 0,5 ml söödet ning ExGen/DNA 

segu sisaldas 50 µl 0,15 M NaCl, 0,5 µg uuritavat plasmiidi, 0,05 µg pRL-TK plasmiidi ja 1,65 µl 

ExGen 500. Plaati tsentrifuugiti 5 minutit kiirenduse 280 g (~1000 rpm) juures (Jouan CR 422). 6 

cm tassidel HepG2 rakkudel kasutati tassi kohta 3,5 ml söödet ning ExGen/DNA segu sisaldas 

200 µl 0,15 M NaCl, 2,5 µg uuritavat plasmiidi, 0,25 µg pRL-TK plasmiidi ja 8,2 µl ExGen 500. 

Kõiki rakke inkubeeriti pärast transfektsiooni 24 tundi ekspressiooni stabiliseerumiseks. 

30

2.1.20. Stressivastuse indutseerimine koekultuuri rakkudes 

Stressitingimused rakendati 24 tundi pärast transfektsiooni. Kõigil rakkudel vahetati sööde 

vahetult enne stressi tekitavatele tingimustele eksponeerimist. 

Endoplasmaatilise retiikulumi (ER) stressi indutseerimiseks kasutati tapsigargiini (Sigma- 

Aldrich) lõppkonsentratsiooniga 1 µM (kui pole öeldud teisiti). Rakke inkubeeriti tapsigargiini 

sisaldavas söötmes 6 tundi. 

Teatud toitaine puudusest tingitud stressi esilekutsumiseks kasutati söötme tegemisel DMEM-i 

(Dulbecco's Modified Eagle Media), kust oli puudu L-tsüsteiin, L-metioniin, L-leutsiin, L- 

glutamiin, D-glükoos, fosfaat ja inositool (Chemicon). Soovitud toitained lisati vastavalt DMEM 

Labeling Media Kiti (Chemicon) juhendile. Söötmele lisati 10% dialüüsitud FCS-i (HyClone). 

Kontrollrakkudele tehti alati samadest komponentidest täissööde. Enne miinussöötme lisamist 

pesti rakke 2 korda 1X PBS-iga. Rakke inkubeeriti teatud toitainet mittesisaldavas söötmes 8 

tundi. 

Arseniidi stressi esilekutsumiseks kasutati naatriumarseniiti (NaAsO 2 ) (Sigma), mida lisati 

söötmele lõppkontsentratsiooniga 20 µM. Rakke inkubeeriti arseniiti sisaldavad söötmes 6 tundi. 

2.1.21. Lutsiferaasi aktiivsuse määramine 

Erinevate 5’ UTR-ide mõju valgu translatsioonitasemele uuriti kahe lutsiferaasi reporteri 

süsteemiga [Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)]. Transfekteeritud rakud 

ekspresseerisid uuritavalt pGL3-põhinevalt plasmiidilt firefly lutsiferaasi ja pRL-TK 

kontrollplasmiidilt Renilla lutsiferaasi. Uuritavat ja kontrollplasmiidi võeti massisuhtes 10:1. 

24-kannusel plaadil HepG2 rakkudelt eemaldati sööde, lisati 100 µl 1X PLB-d (Passive Lysis 

Buffer) (Promega) ja asetati plaat 15 minutiks loksutile. Rakulüsaat koguti pipetiga 1,5 ml tuubi. 

Luminomeetri tuubi (Turner Designs) või mõõtmiseks kasutatud 1,5 ml tuubi pandi 25 µl LAR II 

lahust (Luciferase Assay Reagent) (Promega). Vahetult enne mõõtmist lisati 5 µl rakulüsaati ning 

segati 10 korda pipetiga sisse-välja. Luminomeetriga (Turner Designs TD-20/20) fikseeriti proovi 

firefly lutsiferaasi aktiivsus. Seejärel lisati 25 µl 1X Stop & Glo reagenti (Promega), segati 

vortexil 10 sekundit ja mõõdeti luminomeetriga Renilla lutsiferaasi aktiivsus. 

Lutsiferaasi aktiivsus esitati relative light unitites (RLU) (jagati iga proovi firefly lutsiferaasi 

aktiivsus läbi sama proovi Renilla lutsiferaasi aktiivsusega). Proovide stressi- ja normaaloleku 

31

tulemused normaliseeriti vastava oleku modifitseerimata pGL3-Controli tulemustele. Stressiga 

indutseeritavuse määra saamiseks jagati töödeldud proovi tulemus läbi töötlemata proovi 

tulemusega. 

Igast katsest tehti 1-3 sõltumatut transfektsiooni ning igas neist iga uuritav olukord vähemalt 

duplikaatsena. 

2.1.22. Totaalse RNA eraldamine 

6 cm tassidel kasvatatud HepG2 rakkudest eraldati totaalne RNA kasutades RNeasy Mini Kiti 

(QIAGEN) protokolli ”Purification of Total RNA from Animal Cells Using Spin Technology”. 

RNA kontsentratsioon määrati spektrofotomeetriliselt 260 nm juures. 

2.1.23. Totaalse RNA töötlus DNaasiga 

Reaalaja PCR-il kasutamiseks töödeldi totaalset RNA-d DNaasiga, et vabaneda DNA saastusest. 

Reaktsioon teostati ruumalas 10 µl kasutades RNaasivaba vett (Fermentas), 1 µg totaalset RNAd, 

1X DNase I puhvrit MgCl 2 ga (Fermentas), 1 U DNase I, RNase free (Fermentas) ja 10 U 

RiboLock RNaasi inhibiitorit (Fermentas). Inkubeeriti 30 minutit 37 °C juures. Inaktiveerimiseks 

lisati esmalt EDTA-d (Fermentas) lõppkontsentratsioonini 2,5 mM ja hoiti seejärel 65 °C juures 

10 minutit. 

2.1.24. cDNA esimese ahela süntees 

DNaasiga töödeldud totaalsele RNA-le sünteesiti cDNA esimene ahel kasutades RevertAid H- 

Minus First Strand cDNA Synthesis Kiti (Fermentas). Lähtuti tootja protokollist. 

Pöördtranskriptsiooniks võeti 0,5 µg DNaasiga töödeldud totaalset RNA-d ja kasutati oligo(dT) 18 

praimerit. 

2.1.25. Reaalaja PCR mRNA tasemete kontrollimiseks 

Plasmiididelt ekspresseeritud firefly ja Renilla lutsiferaaside mRNA-de tasemed määrati reaalaja 

PCR-iga. Meetodi rakendamisel arvestati üldprotokolli (Nolan jt., 2006). 

Reaktsioonid teostati ruumalas 20 µl kasutades SYBR Green I põhist Maxima SYBR Green 

qPCR Master Mixi (2X) (Fermentas). See sisaldab ka master mixi hulga normaliseerimiseks 

vajalikku ROX passiivset referentsvärvi. Reaktsioonisegu koosnes 1X master mix, cDNA 

vastavalt 50 ng totaalsele RNA-le või varieeruv hulk lineariseeritud plasmiidi ning praimerid 

32

lõppkontsentratsiooniga 50 nM. Praimerite järjestused valiti publitseeritud artikli järgi (Watatani 

jt., 2008). 

Reaalaja PCR-i tulemuste kvantifitseerimiseks kasutati relatiivse standardkõvera meetodit. 

Renilla lutsiferaasi jaoks koostati standardkõver 10 1 kuni 10 7 ja firefly lutsiferaasi jaoks 10 2 kuni 

10 7 arvutuslikku koopiat lineariseeritud plasmiidi reaktsioonisegus (lisaks segu kompleksuse 

jaoks totaalset RNAd mittetransfekteeritud rakkudest 50 ng reaktsiooni kohta). Saadud 

standardkõverate R-ruut väärtus oli üle 0,999 ja kõik uuritavad paiknesid kõvera ulatusse. 

Reaktsioon tehti aparaadiga 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) ja 

kasutati programmi 95 °C 10 minutit, 40 tsüklit: 95 °C 15 sekundit, 60 °C 60 sekundit. Lõpus 

koostati ka sulamiskõver. 

Kõik reaktsioonid viidi läbi duplikaatsetena. Praimeri dimeeride kontrolliks tehti ka ilma 

matriitsita kontrollid ja DNA saastuse kontrolliks pöördtranskribeerimata RNA-ga kontrollid. 

Tulemuste normaliseerimisel võeti uuritavaks (unknown) firefly lutsiferaas ja selle tase jagati läbi 

kontrolliks (control) valitud Renilla lutsiferaasi tasemega. Normaliseeritud firefly lutsiferaasi 

mRNA tasemete esitamisel võeti modifitseerimata pGL3-Controli tase võrdseks ühega 

(calibrator). 

2.1.26. Tulemuste statistiline analüüs 

Katsetes saadud tulemuste erinevuste olulisuse kontrollimiseks rakendati Studenti t-testi (paired, 

two-tailed). Erinevus loeti statistiliselt oluliseks, kui tõenäosus, et valimid pärinevad samast 

populatsioonist oli alla 0,05. 

33

2.2. Tulemused ja arutelu 

2.2.1. Bioinformaatiline otsing leidmaks geene, mille mRNA-d 

sarnanevad uORF-ide paiknemise poolest ATF4 ja GCN4 mRNAdele, 

mille transleerimine on reguleeritud eIF2α fosforüleerimise 

poolt 

Geenide otsimist, mille ekspressioon võiks tõusta stressi alla kannatavas rakus translatsiooni 

tasemel toimuva regulatsiooni abil, alustati andmekogu RefSeq inimese mRNA järjestuste 

analüüsimisega. Esimesed etapid viidi läbi arvutiprogrammide abil. 

Koostati arvutiprogrammid järgnevate selektsioonitingimuste rakendamiseks, mis tuletati 

analüüsides ATF4 ja GCN4 mRNA-de struktuure ning nende muteerimise tulemusi (Hinnebusch, 

2005; Lu jt., 2004; Vattem ja Wek, 2004) ja uORF-ide üldiseid omadusi (1.4.): 

1. 5’ UTR-i pikkus peaks olema vähemalt 50 nt – lühema 5’ UTR-i korral ei saaks praegu 

teadaolevate looduslike järjestuste näidetel reinitsiatsioonilist ülesreguleerimist toimuda; 

2. Nukleotiidsel järjestusel on eksperimentaalne kinnitus – et välistada mRNA variandid, 

mida tegelikult võib-olla ei esine või mis võivad olla väga haruldased; 

3. mRNA omab vähemalt kaht väga hea kontekstiga uORF-i – see on minimaalne uORF-ide 

arv praegu teadaoleva mehhanismi jaoks; 

4. 5’ UTR-i pikkus on alla 600 nt ja uORF-e alla nelja – pikemad 5’ UTR-id on sageli 

keerulised, sisaldades palju uORF-e, ja on esindatud tihti mitmete isovormidena; 

5. Kõige esimene väga hea kontekstiga uORF on lühem kui 16 koodonit – pikema uORF-i 

transleerimise järel muutub reinitsiatsioon ebaefektiivseks isegi tugevate 

sekundaarstruktuuride puudumisel (Kozak, 2001). Selle, mRNA esimese tugeva 

kontekstiga ORF-i, funktsioon oleks ribosoomid (40S subühikud) pärast selle 

transleerimist skaneerima jätta; 

6. Selleks, et leida veel täpsemalt ”ATF4-stiilis” kandidaate [eespoolne uORF, mis 

võimaldab reinitsiatsiooni ja tagumine, mis kodeerivasse järjestusse (CDS, coding 

sequence) sisseminekuga seda välistab] rakendati täiendavalt tingimusi: 

34

a. Vähemalt üks väga hea kontekstiga uORF, mis ei lähe valku kodeerivasse osasse 

sisse; 

b. Vähemalt üks väga hea kontekstiga uORF, mis läheb valku kodeerivasse osasse 

sisse ja seda valgu lugemisraamist erinevas lugemisraamis; 

c. uORFide paar, mis vastas tingimustele punktidest a ja b ei kattu üksteisega. 

Valmistati ka arvutiprogrammid, mille ülesandeks oli otsida välja vaatlusaluste mRNA-de 

ekspressiooniandmed organismi erinevates kudedes [kasutades andmebaasi UniGene EST-de 

(expressed sequence tag) analüüsi tulemusi]. Toodud tingimuste abil saadi umbes 300 kandidaatmRNA-d 

(neist alla saja ”ATF4-stiilis”), mida vaadati edasi koos arvuti poolt edastatud 

informatsiooniga ekspressiooni kohta kudede lõikes. 

Hindamisel rakendati järgnevaid kriteeriume: 

1. Vähemalt 25% kudedest on mRNA tase üle 50 TPM (transcripts per million) – sooviti 

analüüsida mRNA-sid, mis oleks organismis olemas üsna kõrgel tasemel paljudes 

kudedes ja seda stressi puudumise korral (nagu on olukord ATF4 mRNA-ga), sest sellisel 

juhul saab nende mRNA-de transleerimine alata kohe stressivastuse käivitumisel (eIF2α 

fosforüleerimisel); 

2. uORF-ide paigutus, kontekst ja pikkus võimaliku regulatsiooni jaoks reinitsiatsiooni 

vahendusel – lähtudes kirjanduse ülevaates toodud skaneerimismudeli omadustest (1.3. ja 

1.4.) ning ATF4 ja GCN4 mehhanismidest (1.5.). Arvutiprogrammile ei defineeritud väga 

täpseid kriteeriume, kuna sekundaarstruktuurid teevad võimatuks ennustamise üksnes 

nukleotiidide arvu järgi (Kozak, 2001; Vattem ja Wek, 2004); 

3. uORF-ide konserveerumine teistel organismidel – laialdane konserveerumine erinevatel 

organismidel viitaks uORF-ide funktsionaalsele olulisusele; 

4. mRNA isovormide arv inimesel – mRNA isovormide diferentsiaalne süntees sõltuvalt 

olukorrast rakus on alternatiivne lahendus, mis võimaldab toota vajalikku valku sobivas 

koguses (Brown jt., 1999; Han jt., 2003). 

Programmiga mfold kontrolliti üle ka väljavalitud mRNA-de 5’ UTR-ide sekundaarstruktuurid. 

Tugevaid juuksenõelasid uORF-ide läheduses või uORF-ide vahelises alal ei tuvastatud ja ilmselt 

suure GC-sisalduse tõttu olid struktuurid üldiselt kõrgete energiatega võrreldes näiteks AU-rikka 

GCN4 mRNA 5’ UTR-iga (andmed pole näidatud). 

35

2.2.2. Ülevaade rakukultuuris katsetamiseks valitud 5’ UTR-idest 

Käesolevas peatükis on toodud arvutiotsingu ja sellele järgnenud analüüsi tulemused. Sulgudes 

toodud koodid on kõnealuste järjestuste tähised NCBI GenBankis. 

2.2.2.1. 5’ UTR-id, mis on võimalikult sarnased ATF4 mRNA 5’ UTR-ile 

Esimeses järjekorras valiti võimalikult ATF4 mRNA 5’ UTR-i sarnaseid 5’ UTR-e, kuna ATF4 

puhul on ülesreguleerimise mehhanism hästi kirjeldatud ja töötab imetaja rakus. Joonisel 4 on 

toodud 5’ UTR-id, mis valiti bioinformaatilise otsingu tulemusena katsetamiseks koekultuuri 

rakkudes ja joonisele järgnevad nende geenide lühikesed iseloomustused. 

Joonis 4. Inimese ATF4 (GenBanki sissekanne NM_182810), ATF5 (NM_012068) ja NACA (NM_005594) mRNA-de 5’ 

liiderjärjestuste struktuurid. Ristkülikutega on tähistatud valgu startkoodonist ülesvoolu asuvad avatud lugemisraamid (uORFid), 

mis on konserveerunud ja tugeva kontekstiga. Noolega on tähistatud valku kodeeriva ala algus. Arvud tähistavad vahemaade 

pikkuseid nukleotiidides (uORF-ide pikkused on koos stoppkoodoniga). Sulgudes olevad arvud tähistavad vahemaad 5’ otsast 

esimese uORF-ini meie poolt kloneeritud cDNA molekulides, mis erinesid vahemaadest RefSeq sissekannetes (kõigil juhtudel oli 

erinevus järjestuse otsas; ATF4 puhul olid lisandunud nukleotiidid CA, mis esinesid ka genoomsel järjestusel). Joonisel pole 

näidatud ühte ATF4 uORF-i, mis on ebasoodsas kontekstis ja pole konserveerunud. 

ATF4: activating transcription factor 4 (NM_182810) 

Ootuspäraselt oli ATF4 nende geenide hulgas, mis arvutiprogrammi poolt andmekogust välja 

valiti (kinnitades ühtlasi, et arvutiprogramm on koostatud korrektselt). ATF4 võeti katsetesse 

positiivseks kontrolliks; tema regulatsiooni ja rolli on kirjeldatud kirjanduse osas (1.5.2.). ATF4 

mRNA on ohtralt olemas peaaegu kõikjal organismis (79/80 koest TPM > 50). Tema 5’ UTR-i 

struktuur on konserveerunud nii imetajatel (inimesel, hiirel, rotil, lehmal) kui ka teistel 

selgroogsetel (kanal, sebrakalal) (Vattem ja Wek, 2004). 

36

ATF5: activating transcription factor 5 (NM_012068) 

ATF5 kuulub nagu ATF4-gi bZIP transkriptsioonifaktorite perekonda ja suurim sarnasus nende 

vahel ongi C-terminaalses bZIP regioonis (Hansen jt., 2002). On näidatud, et ATF5 võib 

inhibeerida apoptoosi (Persengiev jt., 2002), on kõrgelt ekspresseeritud teatud tüüpi 

kasvajarakkudes (Monaco jt., 2007) ja osaleb neuronite diferentseerumises (Angelastro jt., 2003). 

ATF5 5’ UTR on leitutest kõige sarnasem ATF4 5’ UTR-ile. Esimese uORF-i lõpu ja teise 

uORF-i alguse ning teise uORF-i alguse ja CDS-i alguse distantsid on mõlemad ~20 nt suuremad, 

kui ATF4 puhul, kuid see oletatavasti ei muuda regulatsiooni võimalikkust. 

ATF5 mRNA esindatus on võrdlemisi kõrge: 42/80 koest TPM > 50 ja 5’ UTR-i struktuur on 

konserveerunud inimesel (NM_012068), hiirel (NM_030693) ja kannuskonnal 

(NM_001006820). Inimesel on UniGene’is toodud üks ATF5 mRNA isovorm (NM_012068), 

kuid on leitud ka alternatiivne 5’ UTR, millel on uORF-id teisiti ja millelt ei toimu stressi korral 

translatsioonilist ülesregulatsiooni ning mille ekspressiooni osakaal organismis on ebaselge 

(Watatani jt., 2008). 

NACA: nascent polypeptide-associated complex alpha subunit isoform b (NM_005594) 

NACA (ehk αNAC) ja βNAC on kasvava polüpeptiidiga seonduva kompleksi (nascent 

polypeptide-associated complex, NAC) komponendid ning on seega oletatavasti esimesed valgud, 

mis ribosoomil sünteesitava peptiidiga kokku puutuvad, kindlustades selle õige voltimise ja 

rakulise lokalisatsiooni (Beatrix jt., 2000). Lisaks on näidatud, et NACA on transkriptsiooni 

koaktivaator ja võib lokaliseeruda tuumas (Moreau jt., 1998; Yotov jt., 1998), samuti osaleda 

rakkude diferentseerumisel (Lopez jt., 2005). NACA-l esineb ka pikka lisaeksonit sisaldav valgu 

isovorm (RefSeqis isovorm a), mis on lihaskoe-spetsiifiline transkriptsioonifaktor (Yotov ja St- 

Arnaud, 1996). 

NACA 5’ UTR (NM_005594) erineb ATF4 omast esimese uORF-i pikkuse (39 nt) ja uORF-ide 

vahelise ala lühiduse (39 nt) poolest, kuid on näidatud, et 13 koodonilise uORF-i järel on 

reinitsiatsioon veel võrdlemisi efektiivne (Kozak, 2001) ja et mitte-stressis jõuab stop-AUG 

distantsiga 45 nt märkimisväärne osa ribosoomidest saavutada reinitsiatsioonivõime (Kozak, 

1987). Seega võiks normaalolekus osa ribosoome transleerida NACA teist uORF-i, mis ulatub 

CDS-i sisse sellest erinevas lugemisraamis, kuid stressi korral sellest mööda skaneerida ja 

37

transleerida NACA valku. Sarnaselt ATF4-le on NACA kõrge ekspressiooniga väga paljudes 

kudedes (79/80 koest TPM > 50). 

NACA puhul esineb uORF-ide paigutuse konserveerumine hiirel (DT906595), aga lehma ainsal 

RefSeqi kantud transkriptil NM_001014916 pole uORF-e. Vaid 5’ otsast lühikesed (võimalik, et 

mittetäielikud) mRNA sekventsid on olemas RefSeqis kannuskonna (NM_001091917), sebrakala 

(NM_173264) ja roti (NM_001105939) NACA-l. Samas on NACA valk väga suure 

identsustasemega paljude selgroogsete võrdluses 

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/clust.cgi?ORG=Hs&CID=505735). 

Inimese NACA puhul kodeerivad kolm neljast teadaolevast mRNA isovormist valgu isovormi b. 

Kahel valgu isovormi b kodeerival mRNA isovormil on 5’ UTR nagu joonisel 4 (NM_005594 ja 

NM_001113201) ning ühel puuduvad uORFid (NM_001113202). Valgu isovormi a kodeerib 

uORF-ideta transkript (NM_001113203). 

2.2.2.2. Laiendatud kriteeriumitega valitud 5’ liiderjärjestused 

Koekultuuris testiti ka 5’ UTR-e, mis ei vastanud nii täpselt ATF4 5’ UTR-i struktuurile, et 

uurida mehhanismi võimalikku paindlikkust. Olulisima erinevusena loobuti nõudest, et mitteesimene 

väga hea kontekstiga uORF peab ulatuma CDS-i sisse (CDS-i raamist erinevas raamis), 

kuna teatav ülesregulatsioon võiks toimuda ka ilma selleta. Kui lähtuda sellest, et reinitsiatsioon 

on üldiselt ebaefektiivne (Kozak, 2001), siis uORF-ide sobiva kauguse korral skaneeriks 

ribosoom pärast ühe uORF-i transleerimist stressi korral mööda järgmise uORF-i AUG-st, 

vältides reinitsiatsiooni sellelt (erinevalt olukorrast stressi puudumise korral), ning CDS-i 

transleerimiseni jõuaks suurem osa ribosoomidest. Märkimisväärne on, et ilma CDS-i sisse 

ulatuvate uORF-ideta töötab ATF4-le sarnast rolli täitva pärmi transkriptsioonifaktori GCN4 

translatsiooniline ülesregulatsioon, kuid GCN4 korral on lisaks näidatud, et vaja on mRNA erilist 

sekundaarstruktuuri, mis vähendab pärast viimast uORF-i reinitsiatsiooni (Hinnebusch, 2005). 

Samas võib oletada, et sellise struktuuri puudumise suudaks kompenseerida uORF-i suurem 

pikkus, mis on samuti reinitsiatsiooni vähendav (Kozak, 2001). 

Nendest kaalutlustest lähtuva otsingu tulemustest valiti edasiseks uurimiseks välja geenid DPP9, 

SLC35C2 ja SMEK2, mille 5’ UTR-ide skeemid on toodud joonisel 5. Joonisele järgnevad nende 

geenide lühikesed iseloomustused. 

38

Joonis 5. Inimese DPP9 (GenBanki sissekanne NM_139159), SLC35C2 (NM_015945) ja SMEK2 (NM_020463) mRNA-de 

5' UTR-ide struktuurid. Ristkülikutega on tähistatud valgu startkoodonist ülesvoolu asuvad avatud lugemisraamid (uORF-id), 

mis on tugeva kontekstiga ja konserveerunud. Noolega on tähistatud valku kodeeriva ala algus. Arvud tähistavad vahemaade 

pikkuseid nukleotiidides (uORF-ide pikkused on antud koos stoppkoodoniga). Sulgudes olevad arvud tähistavad vahemaad 5’ 

otsast esimese uORF-ini meie poolt kloneeritud cDNA molekulides, mis erinesid vahemaadest RefSeq sissekannetes (kõigil 

juhtudel oli erinevus järjestuse otsas; SMEK2 puhul olid lisandunud nukleotiidid AA, mis esinesid ka genoomsel järjestusel). 

Joonisel pole näidatud uORF-e, mis on nõrgas kontekstis ja pole konserveerunud (üks SMEK2-l, üks SLC35C2-l). 

DPP9: dipeptidylpeptidase 9 (NM_139159) 

Dipeptidüül peptidaas 9 (DPP9) on ensümaatiliselt aktiivne mitteklassikaline seriin-proteaas ja 

lõikab peptiidsetel substraatidel, millel on proliin positsioonis 2, N-terminaalsest otsast ära 

dipeptiidi (Bjelke jt., 2006). DPP9 võib pakkuda meditsiinilist huvi, kuna ta on dipeptidüül 

peptidaas IV (DPP IV) homoloog (Olsen ja Wagtmann, 2002) ja DPP IV inhibiitorid on uus klass 

diabeedi ravimeid (ülevaade Barnett, 2006). Lisaks on leitud, et DPP9 üleekspressioon nõrgendab 

rakkude adhesiooni ja migratsioonivõimet ning suurendab tundlikkust apoptoosi indutseerimisele 

(Yu jt., 2006). 

DPP9 5’ UTR-is on esimese uORF-i lõpu ja teise uORF-i alguse vahemaa 80 nt, mis on sarnane 

ATF4 omale ja võiks olla ribosoomidele piisav reinitsiatsioonivõime saavutamiseks 

normaalolekus, aga mitte stressis. Ülesregulatsioon eIF2α fosforüleerimise korral võiks tuleneda 

asjaolust, et stressi korral teist uORF-i ei transleerita ja suurem osa ribosoome jääb mRNA-d 

skaneerima ning initsieerib valgusünteesi DPP9 kodeeriva regiooni startkoodonilt (teise uORF-i 

ja CDS-i alguse vahe, 126 nt, peaks võimaldama küllaldaselt aega). 

DPP9 mRNA esindatus on võrdlemisi kõrge: 42/80 koest TPM > 50. Inimesel on leitud vaid üks 

mRNA isovorm (NM_139159). Hiire RefSeqi ainsal transkriptil (NM_172624) on uORF-ide 

asetus samasugune kui inimese DPP9 mRNA-l ja EST-de põhjal esineb konserveerumine ka 

koeral (DN426339), seal (BX674500) ja rotil (DN932618). 

39

SLC35C2: solute carrier family 35, member C2 (NM_015945) 

SLC35C2 kuulub transporterite perekonda SLC35, mille liikmed on Golgi või ER membraanis 

paiknevad antiporterid, mis transpordivad nukleotiidiga seotud suhkru tsütosoolist luumenisse ja 

vastava nukleosiidmonofosfaadi samaaegselt välja (Ishida ja Kawakita, 2004). On näidatud, et 

SLC35C2 mRNA tase tõuseb hüpoksia korral (Leach jt., 2002). 

SLC35C2 mRNA 5’ UTR-is paiknevad tugevas kontekstis uORF-id on võrdlemisi pikad, 39 ja 

45 nt, kuid see peaks võimaldama veel reinitsiatsiooni pärast transleerimist (Kozak, 2001). 

uORF-ide vaheline ala on lühike, 36 nt, kuid on näidatud, et selline võib võimaldada 

reinitsiatsiooni (Kozak, 1987). Kuna see vahemaa on lühike, siis võib teise uORF-i juures 

translatsiooni alustamine olla eriti tundlik eIF2α fosforüleerimisest sõltuvale eIF2•GTP tasemele. 

SLC35C2 mRNA on organismis laialt levinud (60/80 koest TPM > 50). Inimesel on leitud kolm 

transkriptivarianti (NM_015945, NM_173073 ja NM_173179), millest osa omab 5’ otsas 

lisaeksonit, kuid tugeva kontekstiga uORF-id on kõigil identselt. uORF-ide asetus on 

konserveerunud erinevatel loomadel: inimesel (eespool toodud sissekanded), rotil 

(NM_001107803), koeral (DN351325), seal (BP435070), lehmal (EV687862) ja lambal 

(DY506167). 

SMEK2: SMEK homolog 2, suppressor of mek1 (NM_020463) 

SMEK2 on Dictyosteliumi arengut, stressivastust ja kemotaksist mõjutava valgu SMEK 

homoloog. SMEK toimib protein phosphatase 4 (PP4) aktiivsust reguleerides ning seetõttu 

nimetatakse tema homoloogi inimesel ka PP4R3 (protein phosphatase 4 regulatory subunit 3) 

(Mendoza jt., 2007). 

SMEK2 mRNA 5’ UTR erineb ülejäänutest teise tugeva kontekstiga uORF-i pikkuse poolest (69 

nt), mis võiks märgatavalt vähendada reinitsiatsiooni võrreldes lühema uORF-iga (Kozak, 2001). 

Samas on uORF-ide vaheline distants võrdlemisi pikk (156 nt), mis seab kahtluse alla, kas eIF2α 

fosforüleerimisest sõltuvalt muutub oluliselt reinitsiatsioonivõimeliste ribosoomide arv teise 

uORF-i startkoodoni juures. Lisaks on 5’ capi ja esimese uORF-i vahemaa väike (alla 30 nt) ning 

võib põhjustada endogeensel mRNA-l esimese uORF-i juures leaky scanningut (1.3.3.). Seega 

tuleks reportersüsteemis positiivse tulemuse korral kindlasti kontrollida reporter-mRNA capi ja 

esimese uORF-i vahelist distantsi. 

40

SMEK2 mRNA on organismis võrdlemisi hästi ekspresseeritud: 51/80 koest on TPM > 50. 

Inimesel on leitud kaks transkripti varianti (NM_020463 ja NM_001122964), mis kodeerivad 

valgu erinevaid isovorme, kuid omavad sama uORF-ide paigutust. uORF-id on konserveerunud 

rotil (NM_001108367), seal (BW978770) ja oraval (CO738353). 

2.2.3. RefSeq andmekogust väljavalitud mRNA-de esindatuse 

kontrollimine ER stressi alla kannatavates HepG2 rakkudes 

Et selgitada, kas andmekogust väljavalitud mRNA-sid toodetakse stressi all kannatavates 

rakkudes (UniGene’is on andmed nende geenide ekspressioonist üksnes normaalsetel tingimustel 

kasvanud rakkude kohta), amplifitseeriti PCR-iga ER stressis HepG2 rakkude cDNA-d, 

kasutades praimereid, mis on spetsiifilised ATF4, ATF5, NACA, SMEK2, SLC35C2 ja DPP9 5’ 

UTR-idele. 

Joonis 6. Uurimiseks valitud mRNA-de esindatuse kontrollimine stressi all kannatavates rakkudes. Agaroosgeelide 

elektroferogrammid, millel on analüüsitud ATF4, ATF5, NACA, SMEK2, SLC35C2 ja DPP9 mRNA 5’ UTR-idele vastavaid 

DNA fragmente, mis on saadud tapsigargiiniga töödeldud HepG2 rakkude cDNA PCR-il, kasutades 5’ UTR-idele spetsiifilisi 

praimereid. PCR-i programm ja geel: A. two-step PCR sünteesiga 72 °C ja 1.4% agaroosgeel, B. two-step PCR sünteesiga 76 °C 

ja 1.5% agaroosgeel. Umbes 100 bp pikkused hajuvad produktid on oletatavasti valepraimeerumise tulemused, sest nii arvukas ja 

lühike 5’ UTR oleks cDNA-de sekveneerimisel väga tõenäoliselt varem avastatud. Touch-down PCR-i ei rakendatud, sest 

kasutatud polümeraasi Phusion (Finnzymes) sünteesi maksimaalne soovituslik temperatuur two-step PCR-il on 72 °C. 

Kuna mitmetel uuritavatest geenidest on leitud mRNA isovorme, mis erinevad 5’ UTR-i poolest 

(2.2.2.), siis on oluline teada ka mRNA isovormide esindatust stressi korral, et valida katsetes 

iseloomustatavate plasmiidsete konstruktide valmistamiseks arvukamalt esinevad 5’ UTR-id 

(uuritavate geenide puhul, välja arvatud NACA, sobivad praimerid kõigile UniGene’is toodud 

mRNA isovormidele). PCR-i produktide analüüs elektroforeesi abil agaroosgeelis näitas, et 

nimetatud geenide mRNA-de 5’ UTR-id on oodatud pikkusega (umbes 300-400 nt) ja võrdlemisi 

homogeensed stressitingimustes HepG2 rakkudes (joonis 6). Hilisem nukleotiidjärjestuste 

41

sekveneerimine kinnitas, et PCR-iga ülespaljundatud DNA fragmendid pärinevad RefSeqi 

sissekannetele vastavatest mRNA-de isovormidest, millest geenide valikul lähtuti. 

2.2.4. 5’ UTR-i sisaldavate reporterkonstruktide valmistamine 

5’ UTR-ide testimiseks lutsiferaasi reportersüsteemis ligeeriti mRNA-de 5’ otsani ulatuvad 

cDNA fragmendid, mille valmistamist kirjeldati eelmises teemas, vektorisse pGL3-Control 

(Promega), mis sisaldab SV40 promootorit ja enhaanserit. Kuna esialgsed DNA fragmendid 

sisaldasid 5’ RACE-il kasutatud RNA oligonukleotiidis olevat uORF-i, mis võib mõjutada 

lutsiferaasi ekspresseerumist, siis eemaldati see uORF kõigist analüüsitavatest konstruktidest. 

Tulemuseks on plasmiidid, millelt sünteesitavad mRNA-d algavad SV40 promootorist pärineva 

lõiguga (~60 nt), millele järgneb osa GeneRacer RNA oligonukleotiidist, käesolevas töös uuritav 

5’ UTR ning seejärel firefly lutsiferaasi kodeeriv piirkond ja polü(A) saba. Joonisel 7 on esitatud 

ATF5 mRNA 5’ UTR-i sisaldava konstrukti skeem ja kuna ülejäänud valmistatud plasmiidid 

erinevad sellest üksnes uuritava 5’ UTR-i poolest, siis nende skeeme ära toodud ei ole. Sel 

kombel konstrueeritud plasmiididele viidatakse joonistel edaspidi mRNA 5’ UTR-i päritolugeeni 

järgi (”ATF4”, ”ATF5”, ”NACA”, ”SLC35C2”, ”SMEK2” ja ”DPP9”). 

Joonis 7. ATF5 mRNA 5’ UTR-i testimiseks valmistatud konstrukti skeem. Plasmiidi valmistamisel lähtuti vektorist pGL3- 

Control (Promega). Kujutatud on SV40 (Simian Virus 40) promootor ja transkriptsiooni alguspunktid (TSS, transcription start 

site). ATF5 mRNA 5’ UTR-ile vastav DNA fragment sisestati restriktsioonisaitide Hind III ja Nco I vahele. luc+ tähistab 

modifitseeritud firefly lutsiferaasi. Sünteesitavate mRNA-de polüadenüleerimiseks on vektoris SV40 hiline polü(A) signaal. 

Joonis ei ole skaalas. 

2.2.5. mRNA 5’ UTR-ide mõju uurimine reportergeeni ekspressioonile 

stressi korral 

Kloneeritud mRNA 5’ UTR-ide transleeritavuse uurimiseks stressi ja normaaloleku korral 

kasutati HepG2 inimese hepatoomi rakukultuuri ja kahe lutsiferaasi reporteri süsteemi. Rakke 

kasvatati 24-kannustel plaatidel 24 tundi enne transfektsiooni ja seejärel transfekteeriti 

polüetüleenimiini abil kannu kohta 0,5 µg uuritavat plasmiidi, mis ekspresseeris firefly 

lutsiferaasi, ja 0,05 µg kontrollplasmiidi, mis ekspresseeris Renilla lutsiferaasi. 24h pärast 

transfektsiooni rakendati pooltele kannudele stress. 

42

2.2.5.1. ATF5 5’ UTR-i transleeritavus tõuseb ER stressi korral 

Esmalt katsetati ATF5 ja NACA 5’ UTR-idega reporterkonstrukte ning positiivse kontrollina 

ATF4 5’ UTR-iga plasmiidi. Tapsigargiin, mis on endoplasmaatilise retiikulumi Ca 2+ -ATPaasi 

inhibiitor, indutseerib ER stressi ja aktiveerib eIF2α kinaasi PERK (Harding jt., 1999). 

Tapsigargiini (lõppkontsentratsiooniga 1 µM) sisaldavas söötmes oli võrreldes kontrollsöötmega 

oluliselt (p < 0,05) suurem nii ATF4, ATF5 kui ka NACA 5’ UTR-iga plasmiidilt ekspresseeritud 

reporteri aktiivsus (joonis 8A). ATF5 korral oli aktiivsuse kasv (4,5x) võrreldav ATF4 omaga 

(3,4x) ja NACA korral (1,9x) küll väiksem kui ATF4 ja ATF5 5’ UTR-idel, kuid siiski selgelt 

avalduv (indutseeritavuseks 1,0x võeti kontrolli aktiivsuse kasv). 

Joonis 8. Tapsigargiini abil HepG2 rakkudes esile kutsutud ER stress aktiveerib ATF5, ATF4 ja NACA mRNA-de 5’ 

flankidega lutsiferaasi reporterkonstrukte. A. ATF5, ATF4 ja NACA plasmiidide suhtelised lutsiferaasi aktiivsused (relative 

light unit, RLU) 1 µM tapsigargiini (Tg+) ja normaalse söötme (Tg-) korral, normaliseerituna lähtevektori pGL3-Control 

(Promega) vastava olukorra tulemuse järgi. Välja on toodud aktiivsuse kasv kordades stressi korral (induktsioon). ATF5 ja ATF4 

korral on kasutatud kolme sõltumatu transfektsiooni andmeid, NACA puhul ühe. B. ATF4 ja ATF5 reporterkonstruktide 

induktsiooni uurimine erinevatel tapsigargiini kontsentratsioonidel. Normaaloleku (0 µM tapsigargiini) tase on võetud võrdseks 

ühega. Kasutatud on kahe sõltumatu transfektsiooni andmeid (0,3 ja 6 µM puhul ühe). Tärn tähistab statistiliselt olulist erinevust 

stressi ja mitte-stressi tasemete vahel (Studenti t-test, p < 0,05). Kõik stressitingimused kestsid 6 tundi. Vearibad märgivad 

standardhälvet. 

Edasi keskenduti mõneks ajaks ATF5 5’ UTR-i iseloomustamisele, kuna tema indutseeritavus oli 

võrreldav ATF4 5’ UTR-i indutseeritavusega, ATF5-l oli kirjeldatud potentsiaalset rolli 

rakustressi korral (Persengiev jt., 2002) ning ATF5 mRNA-l polnud kirjeldatud alternatiivseid 

isovorme, mis võiksid translatsioonilise regulatsiooni tähtsust vähendada [hiljutises 

43

publikatsioonis Watatani jt. (2008) toovad välja alternatiivse mRNA isovormi, kuid selle 

funktsioon ja esindatus organismis on ebaselge]. 

Selleks, et uurida, kas ATF5 5’ UTR-i indutseeritavus muutub erinevatel tapsigargiini 

kontsentratsioonidel, varieeriti seda vahemikus 0,3 kuni 6 µM (joonis 8B). ATF5 reporteri 

aktiivsuse kasv stressi korral (~3,5-5x) oli igal kontsentratsioonil suurem ATF4 omast (kasv 

stressi korral ~2-3x), kuid olulisi erinevusi erinevate tapsigargiini kontsentratsioonide vahel ühe 

uuritava 5’ UTR-i võrdluses polnud [välja arvatud võrdluses 0 µM ehk normaalolekuga, kus 

statistiliselt olulise erinevuse (p < 0,05) saavutasid kõik eksperimendid, millest oli tehtud 

rohkem kui üks transfektsioon]. Saadud tulemused on kooskõlas varasema tööga, kus leiti, et 

HepG2 rakkudes on üldise valgusünteesi pidurdatus 0,1 µM tapsigargiini korral praktiliselt sama 

tugev kui 1 µM tapsigargiini korral (Wong jt., 1993). Võib oletada, et ka kõige madalam 

käesolevas töös kasutatud tapsigargiini kontsentratsioon (0,3 µM) kustub esile sedavõrd 

intensiivse stressivastuse, et eIF2α fosforüleerimine toimub maksimaalsel tasemel (seega ei 

suurene tapsigargiini kontsentratsiooni tõstmisel), mistõttu ei suurene ka ATF4 ja ATF5 mRNAde 

5’ UTR-ide indutseeritavus. On huvitav märkida, et kuigi valgusünteesi pidurdatus on 

maksimaalne juba 0,1 µM tapsigargiini korral, siis isegi 6 µM tapsigargiiniga söötmes kuus tundi 

inkubeeritud HepG2 rakkudel polnud veel märgata suremist (andmed pole näidatud). 

Kuigi meie ekspressioonikonstruktid polnud täielikult omavahel võrreldavad, võib märkida, et 

kõigil valitud 5’ UTR-idega plasmiididel oli reporteri aktiivsus alati märgatavalt madalam 

kontrollplasmiidi pGL3-Controli omast (normaliseeritult 1,0) (joonis 8A). See on oodatav 

tulemus varasemate katsete põhjal ATF4-ga, mis näitasid, et ATF4 5’ UTR on märkimisväärne 

takistus translatsioonile võrreldes mittestruktureeritud (uORF-ideta) 5’ UTR-iga ka stressi korral 

(Lu jt., 2004). 

2.2.5.2. ATF5 mRNA 5’ UTR-iga reporterkonstrukti reageerimine 

toitainepuudustele 

eIF2α fosforüleerimist saavad imetaja rakkudes teadaolevalt teostada neli erinevat kinaasi 

vastusena mitmetele stressidele (1.5.). Seega, kui ATF5 ülesregulatsiooni mehhanism on sõltuv 

eIF2α fosforüleerimisest, siis peaks efekt avalduma lisaks ER stressile ka teiste stresside, näiteks 

toitainete puudumiste, korral. Selle oletuse kontrollimiseks inkubeeriti reporterkonstruktidega 

transfekteeritud HepG2 rakke söötmes, milles puudus kas asendamatu aminohape leutsiin, 

asendatav aminohape glutamiin või glükoos. ATF5 (joonis 9A) ja kontrollina kasutatud ATF4 

44

(joonis 9B) puhul oli kõigi nälgimistingimuste korral näha tapsigargiini kasutamisega võrreldavat 

induktsiooni. Statistiline usaldusväärsus jäi paraku mitmes toitainepuuduse katses saavutamata 

korduste väikese arvu või suurte kõikumiste tõttu duplikaatide vahel. 

Joonis 9. A. ATF5 ja B. ATF4 mRNA-de 5’ UTR-idega lutsiferaasi reporterkonstruktide reageerimine erinevatele 

toitainepuudustele HepG2 rakkudes. Andmed on esitatud suhtelistes lutsiferaasi ühikutes (relative light unit, RLU) 

normaliseerituna lähtevektori pGL3-Control (Promega) vastava olukorra tasemete vastu. K tähistab täissöötmega kontrolli, Glcglükoosipuudust, 

Leu- leutsiinipuudust ja Gln- glutamiinipuudust (kõigi stresside kestvus 8h). Induktsioon on lutsiferaasi 

aktiivsuse (ekspressiooni) kasv (kordades) miinussöötmes võrrelduna täissöötmega. Glc- ja Leu- korral on kasutatud kahe 

sõltumatu transfektsiooni ja Gln- korral ühe transfektsiooni andmeid. Tärn märgib statistiliselt olulist erinevust stressi ja mittestressi 

tasemete vahel (Studenti t-test, p < 0,05). Märkimisväärselt lähedal olulisusele olid ka ATF5 Leu- (p = 0,055), ATF5 Gln- 

(p = 0,065) ja ATF4 Leu- (p = 0,059). Vearibad märgivad standardhälvet. 

2.2.5.3. Laiendatud kriteeriumitega valitud 5’ UTR-ide katsetamine 

Kui avaldati tööd, mis kinnitasid meie oletust, et ATF5 on tõepoolest translatsiooni tasemel 

ülesreguleeritud eIF2α fosforüleerimisest sõltuva reinitsiatsioonilise mehhanismiga (Zhou jt., 

2008; Watatani jt., 2008), otsustasime viia läbi katsed ka nende mRNA-de 5’ UTR-idega, mis 

esialgu olid tagaplaanil, kuna ei vastanud täielikult soovitud uORF-ide paigutusele. 

SLC35C2, DPP9 ja SMEK2 mRNA-de 5’ UTR-idel on sarnaselt ATF4-ga kaks tugevas 

kontekstis uORF-i, kuid tagumine uORF (ehk uORF2) ei kattu valku kodeeriva järjestusega. 

Seega on võimalus, et pärast uORF2 transleerimist suudab osa ribosoome reinitsieeruda valgu 

ORF-ilt, kuid lähtudes sellest, et reinitsiatsioon on üldiselt ebaefektiivne, (Kozak, 2001) lootsime, 

et stressi korral uORF2-est mööda skaneerides on tulemuseks mõningane translatsiooni kasv 

valgu ORF-ilt. Lisaks omab SMEK2 võrdlemisi pikka teist uORF-i (23 koodonit), mis peaks 

45

einitsiatsiooni märkimisväärselt inhibeerima (Kozak, 2001). Nagu on kirjeldatud kirjanduse 

ülevaate peatükis 1.5.1., toimub valku kodeeriva järjestusega mittekattuva uORF-i vahendusel 

GCN4 mRNA transleerimise regulatsioon pärmseentes. 

SLC35C2, DPP9 ja SMEK2 mRNA-de 5’ UTR-idega lutsiferaasi reporterkonstrukte katsetati 

paralleelselt NACA, positiivse kontrolli (siin ATF5) ja tühja vektoriga pGL3-Control (aktiivsuste 

normaliseerimiseks). Arseniidi stressi korral, mis aktiveerib mitmeid eIF2α kinaase (Zhou jt., 

2008), tõusid stressi korral võrreldes normaalolekuga statistiliselt olulisel määral ATF5, 

SLC35C2, DPP9 ja NACA konstruktide signaalid (joonis 10). SLC35C2 ja DPP9 näidud 

kasvasid vähe (vastavalt 1,3 ja 1,6 korda keskmiselt) võrreldes ATF5-ga (6,9x), kuid ületasid 

siiski kontrolli (mille induktsioon loeti võrdseks 1,0x-ga). NACA puhul oli kasv (2,2x) võrreldav 

tapsigargiiniga esile kutsutud ER stressi tulemusega (1,9x). 

Joonis 10. Arseniidi stressi mõju valitud 5’ UTR-idega mRNA-sid ekspresseerivatele lutsiferaasi reporterkonstruktidele 

HepG2 rakkudes. Välja on toodud suhtelised lutsiferaasi aktiivsused (relative light unit, RLU) normaaloleku (As-) ja 20 µM 

arseniidi (As+) korral. Control tähistab modifitseerimata lähtevektori pGL3-Control (Promega) tulemusi, mille mõlema olukorra 

järgi on vastavalt normaliseeritud kõik teised tulemused. Stressitingimused kestsid 6 tundi. Induktsioon tähistab lutsiferaasi 

aktiivsuse kasvu kordades stressi korral võrreldes normaalolekuga. Kõigi plasmiidide puhul on kasutatud kahe sõltumatu 

transfektsiooni andmeid. Tärn tähistab statistiliselt olulist erinevust stressi ja mitte-stressi tasemete vahel (Studenti t-test, p < 

0,05). Vearibad märgivad standardhälvet. 

Kvantitatiivse reaalaja PCR-iga mRNA tasemete analüüsi tulemused mõnedel plasmiididel on 

toodud joonisel 11. Kuna mõõtmisi on teostatud vaid üks kord, siis 5’ UTR-ide indutseeritavuse 

näitude normaliseerimist mRNA tasemete järgi ei teostatud. Siiski võimaldavad kvantitatiivse 

reaalaja PCR-iga saadud andmed teha mõningaid tähelepanekuid. Kui kahe lutsiferaasi süsteemis 

46

olid kontrollvektori pGL3-Controli Renilla järgi korrigeeritud firefly lutsiferaasi aktiivsused 

stressi ja normaaloleku korral lähedased [ehk stressiga indutseeritavus umbes 1 (andmed pole 

näidatud; normaliseeriti täpselt 1,0)], siis mRNA tasemete suhe firefly/Renilla lutsiferaasidel 

vähenes stressiga umbes 2x kõigi uuritud plasmiidide puhul (andmed pole näidatud). Seega võib 

lutsiferaaside akumuleerumine enne stressi anda olulise panuse pGL3-Controli aktiivsusele 

stressi korral, mis omakorda vähendab pärast pGL3-Controli järgi normaliseerimist uuritavate 5’ 

UTR-ide indutseeritavuse määra. Promega andmetel on meie kasutatud firefly lutsiferaasi 

pooleluiga imetaja rakus umbes 3 tundi (http://www.promega.com/faq/lucifer.html). Seega, 

destabiliseeritavate lisajärjestustega lutsiferaasi kasutamine [vektorite seeriast pGL4 (Promega)] 

võimaldaks tõenäoliselt täpsemalt mõõta 5’ UTR-ide indutseeritavust lühiajalises katses. 

fluc /Rluc mRNA suhe 

2,5 

2 

1,5 

1 

0,5 

0 

pGL3-Control ATF5 DPP9 

As- 

As+ 

Joonis 11. Kvantitatiivse reaalaja PCR-iga saadud andmed pGL3-Controli ning ATF5 ja DPP9 5’ UTR-idega 

plasmiididelt ekspresseeritava firefly lutsiferaasi (fluc) mRNA tasemete kohta normaliseerituna pRL-TK-lt 

ekspresseeritava Renilla lutsiferaasi (Rluc) mRNA taseme järgi vastavas proovis. Plasmiidid transfekteeriti HepG2 

rakkudesse. As+ tähistab arseniidiga proovi (20 µM, 6 tundi) ja As- ilma stressita kontrolli. Stressiga proovid on normaliseeritud 

pGL3-Controli stressi tulemuse järgi ja normaaloleku proovid pGL3-Controli vastava tulemuse järgi. Kasutatud on ühe 

transfektsiooni andmeid ja reaktsioonid viidi läbi duplikaatsetena. Vearibad märgivad standardhälvet. 

Samuti võib mRNA tasemete tulemustest järeldada, et tugevaid promootoreid või enhaansereid 

ATF5 ja DPP9 5’ UTR-ide cDNA lõigud ei sisalda. Küll aga on DPP9 ja ATF5 plasmiididel 

nähtav keskmiselt ~1,5x firefly lutsiferaasi mRNA taseme tõus stressi korral võrreldes pGL3- 

Controliga (joonis 11), mis võib olla DPP9 relatiivse lutsiferaasi aktiivsuse kasvu (1,6x) põhjus 

(joonis 10). Kuna mRNA tasemete mõõtmine vajab veel kordamist, siis ei saa seda kindlalt väita. 

DPP9 ja teiste 5’ UTR-ide indutseeritavuse sõltuvust uORF-ide vahendusel toimuvast 

regulatsioonist võimaldaks kinnitada katse plasmiidiga, kus on kaotatud üks või mõlemad uORFid 

(DPP9 ja SMEK2 5’ UTR-idest on sellised plasmiidid meil ka valmistatud, kuid ei ole veel 

katsetatud). 

47

Üllatav tulemus on, et SMEK2 ja DPP9 plasmiidid andsid tugevama (stressi korral vastavalt 1,1 

ja 4 korda) relatiivse lutsiferaasi signaali kui kontroll pGL3-Control (joonis 10). Kuigi selle töö 

eesmärk ei olnud võrrelda erinevate 5’ UTR-ide mõju omavahel, vaid stressi- ja normaaloleku 

vahel, on huvitav, et GC-rikast (68%) ja kahe tugevas kontekstis uORF-iga DPP9 5’ UTR-i 

sisaldav konstrukt annab lutsiferaasi suurema ekspressiooni (aktiivsuse), kui uORF-ideta ja 

tugevate sekundaarstruktuurideta (programmi mfold põhjal, andmed pole näidatud) 5’ 

liiderjärjestusega pGL3-Control. SMEK2 5’ UTR sisaldab 23-koodonilist tugevas kontekstis 

uORF-i, mis peaks reinitsiatsiooni oluliselt vähendama. Kahjuks puuduvad meil andmed SMEK2 

konstruktilt sünteesitava lutsiferaasi mRNA hulga kohta, kuid DPP9 konstruktilt sünteesitava 

mRNA hulk ilmselt ei ole ~4 korda suurem kontrollplasmiidilt pGL3-Control sünteesitavast 

mRNA hulgast (joonis 11). Siiski ei pruugi DPP9 konstrukti korral olla tegemist 

märkimisväärselt efektiivset translatsiooni võimaldava 5’ UTR-iga, vaid näiteks on võimalik, et 

lutsiferaasile N-terminaalselt lisatud 3 aminohapet suurendasid DPP9 plasmiidilt sünteesitava 

lutsiferaasi stabiilsust, mis põhjustab suurema akumuleerumise. Seda oletust saaks kontrollida, 

konstrueerides pGL3-Controlile sarnase plasmiidi, kus lutsiferaasi N-terminusele on lisatud 

samad aminohapped, mis on DPP9 plasmiidi lutsiferaasil (DNA järjestus joonisel 3). Samuti 

saaks mõõta lutsiferaasi valgu taset vastava antikehaga. Selgitamaks uORF-ide inhibeeriva mõju 

määra 5’ UTR-ide transleeritavusele oleks vajalik teha lisakatse plasmiididega, kus uORF-ide 

startkoodonid on muteeritud. 

Seega näitavad käesolevas töös saadud tulemused, et SMEK2, DPP9 ja SLC35C2 5’ UTR-ide 

indutseeritavus stressi korral HepG2 rakkudes on nõrk (kuid, välja arvatud SMEK2 puhul, 

saavutas statistilise olulisuse). Siiski on võimalik, et teatud rakutüüpides on nende 5’ UTR-ide 

indutseeritavus tugevam, ja bioloogiliselt oluline, kuna on leitud, et erinevat tüüpi rakkudes 

esineb küllalt suur varieeruvus translatsiooni reinitsiatsiooni võimes. Näiteks on teada, et 5’ capi 

lähedal paiknevalt uORF-ilt translatsiooni alustamises on umbes kahekordne erinevus T-rakkude 

ja HeLa vahel (Ruan jt., 1994). ATF5 puhul on näidatud, et HeLaS3 rakkudes on 

translatsiooniline induktsioon märgatavalt tugevam kui COS7 rakkudes (vastavalt 15,9x ja 4,6x), 

kusjuures kasutati arseniidi stressi (50 µM, 8 tundi), mis kutsus mõlemas rakukultuuris esile 

tugeva eIF2α fosforüleerimise (Watatani jt., 2008). Regulatsiooni sõltuvus rakuliinist oleks 

võimalik seletus meie katsetatud 5’ UTR-ide uORF-ide konserveerumisele ja ilmselt väärib 

täiendavat selgitamist. 

48

KOKKUVÕTE 

Käesoleva töö eesmärgiks oli leida bioinformaatiliste andmekogude abil geene, mille 

ekspressioon võiks olla stressi ajal translatsiooniliselt 5’ UTR-i (untranslated region) kaudu 

ülesreguleeritud ATF4 ekspressiooni regulatsioonile analoogilise mehhanismiga ja seejärel 

rakukultuuris katsetada nende geenide 5’ UTR-e. 

Selliste geenide otsimiseks valmistati arvutiprogrammid, milles geenide väljavaliku esmaseks 

kriteeriumiks oli uORF-ide (upstream ORF) paiknemine mRNA 5’ UTR-is ATF4 mRNA-le 

sarnasel viisil. Lisaks seati tingimusteks, et mRNA oleks arvestatavas koguses olemas organismi 

erinevates kudedes, et uORF-ide asetus 5’ UTR-is oleks konserveerunud erinevat liiki 

organismidel ning et geenil puuduksid sellised mRNA isovormid, millel on uORF-ide paigutus 

teistsugune (või oleks selliseid mRNA isovorme vähe). 

Arvutiprogrammide abil valiti välja viie mRNA (geenid ATF5, NACA, DPP9, SLC35C2 ja 

SMEK2) 5’ UTR-id rakukultuuris uurimiseks ja positiivseks kontrolliks võeti ATF4 mRNA 5’ 

UTR. 5’ UTR-idele vastavad DNA fragmendid amplifitseeriti PCR-i abil, kasutades HepG2 

inimese hepatoomirakkude cDNA-de segu [cDNA-d olid sünteesitud endoplasmaatilise 

retiikulumi (ER) stressi käes kannatavatest rakkudest eraldatud RNA-lt]. PCR-i produktide 

elektroforeetiline analüüs agaroosgeelis näitas, et uuritavate mRNA-de 5’ UTR-ide 

populatsioonid on valdavalt homogeensed. 

5’ UTR-idele vastavad DNA lõigud ligeeriti plasmiidi pGL3-Control (Promega), saades 

reporterkonstruktid, millelt sünteesitavas mRNA-s on käesolevas töös uuritav 5’ UTR asetatud 

lutsiferaasi kodeeriva ala ette. Reporterkonstrukte katsetati koekultuuris HepG2 rakkudes 

[kasutades kahe lutsiferaasi süsteemi (Promega)] ja näidati, et lutsiferaasi ekspressioon on ATF5 

ja NACA 5’ UTR-e sisaldavate plasmiidide korral statistiliselt olulisel määral ülesreguleeritud 

tapsigargiinist põhjustatud ER stressi käes kannatavates HepG2 rakkudes (võrrelduna 

normaalsetes tingimustes inkubeeritud rakkudega). Seejuures on ATF5 5’ UTR-i indutseeritavus 

võrreldav ATF4 5’ UTR-i omaga. Seejärel näidati, et ATF5 5’ UTR käitub ATF4 omale sarnaselt 

ka erinevate toitainepuuduste korral (glutamiini-, leutsiini- ja glükoosipuudused), mis on 

kooskõlas oletusega, et ATF5 mRNA 5’ UTR suurendab talle järgneva ORF-i transleerimist 

eIF2α fosforüleerimisest sõltuva mehhanismi abil. Käesoleva töö tegemise ajal publitseeriti 

sõltumatute töörühmade poolt, et ATF5 on tõepoolest translatsiooniliselt ülesreguleeritud meie 

poolt oletatud mehhanismiga. DPP9, SLC35C2, NACA ja SMEK2 5’ UTR-idega 

49

eporterplasmiide uuriti käesolevas töös arseniidi stressi tingimustes ja neist kolme esimese 5’ 

UTR-ide korral saadi tulemuseks HepG2 rakkudes statistiliselt oluline ülesregulatsioon. Selle 

selgitamiseks, kas DPP9, SLC35C2 ja NACA 5’ UTR-ide puhul on tegemist translatsioonilise 

ülesregulatsiooniga, on vaja läbi viia täiendavaid katseid. 

50

Regulation of translation initiation via the 5' untranslated region in eukaryotes 

Tiit Örd 

SUMMARY 

The literature part of this work focuses on the scanning mechanism of translation initiation in 

eukaryotes. According to the model, eukaryotic initiation factors (eIF) position the small (40S) 

ribosomal subunit onto the 5’ end of the mRNA molecule. The 40S subunit, complexed with 

initiation factors, begins scanning the 5’ untranslated region (UTR) of the mRNA for the 

initiation codon, and generally synthesis of the polypeptide starts at the first AUG triplet of the 

mRNA. However, a sizeable proportion of mRNA-s contain open reading frames (ORF-s) 

located upstream of the protein initiation codon (upstream ORF, uORF). Following the 

translation of a short uORF a percentage of ribosomes resume scanning and can reinitiate 

translation at a downstream AUG. Reinitiation is inefficient and therefore uORF-s generally have 

an inhibitory effect on the translation of the following ORF. 

In response to cellular stress, general protein synthesis is suppressed by the phosphorylation of 

the α-subunit of eIF2. Phenomenally, translation of the activating transcription factor 4 (ATF4) 

mRNA in vertebrates is upregulated in such conditions. eIF2α phosphorylation causes a delay in 

reinitiating ribosomes becoming competent to recognise an AUG codon, allowing for the site 

where translation reinitiates to be different in stress and non-stress conditions. The 5’ UTR of 

ATF4 contains two uORF-s, the second of which is highly inhibitory, and the increased synthesis 

of the ATF4 protein is a consequence of the second uORF being bypassed in stress conditions. 

In the experimental part of this work a set of criteria were devised to bioinformatically predict 

mRNA-s that might be upregulated by a mechanism similar to ATF4. Five candidate mRNA 5’ 

UTR-s were chosen for experiments in eukaryotic cell culture using a luciferase reporter system. 

Our results show that the ATF5 mRNA 5’ UTR causes considerable upregulation of luciferase 

activity in reponse to ER stress, various types of nutrient deprivation and arsenite stress. While 

this work was in progress, independent groups reported that ATF5 is indeed regulated as we had 

postulated. Several other 5’ UTR candidates for translational upregulation were tested for 

inducibility by arsenite stress and were found to increase reporter gene expression significantly in 

stressful conditions. Further investigation is necessary to clarify the degree to which the induction 

witnessed is due to the proposed translational mechanism. 

51

KIRJANDUSE LOETELU 

Abastado, J. P., Miller, P. F., Jackson, B. M. ja Hinnebusch, A. G. (1991). Suppression of 

ribosomal reinitiation at upstream open reading frames in amino acid-starved cells forms 

the basis for GCN4 translational control. Mol. Cell. Biol. 11: 486-496. 

Alderete, J. P., Child, S. J. ja Geballe, A. P. (2001). Abundant early expression of gpUL4 from a 

human cytomegalovirus mutant lacking a repressive upstream open reading frame. J. 

Virol. 75: 7188-7192. 

Ameri, K. ja Harris, A. L. (2008). Activating transcription factor 4. Int. J. Biochem. Cell Biol. 40: 

14-21. 

Angelastro, J. M., Ignatova, T. N., Kukekov, V. G., Steindler, D. A., Stengren, G. B., 

Mendelsohn, C. ja Greene, L. A. (2003). Regulated expression of ATF5 is required for the 

progression of neural progenitor cells to neurons. J. Neurosci. 23: 4590-4600. 

Araud, T., Genolet, R., Jaquier-Gubler, P. ja Curran, J. (2007). Alternatively spliced isoforms of 

the human elk-1 mRNA within the 5' UTR: implications for ELK-1 expression. Nucleic 

Acids Res 35: 4649-4663. 

Baird, S. D., Turcotte, M., Korneluk, R. G. ja Holcik, M. (2006). Searching for IRES. RNA 12: 

1755-1785. 

Barnett, A. (2006). DPP-4 inhibitors and their potential role in the management of type 2 

diabetes. Int. J. Clin. Pract. 60: 1454-1470. 

Beatrix, B., Sakai, H. ja Wiedmann, M. (2000). The alpha and beta subunit of the nascent 

polypeptide-associated complex have distinct functions. J. Biol. Chem. 275: 37838- 

37845. 

Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J. ja McCarthy, J. E. (2004). Dynamics 

and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Mol. Microbiol. 51: 987- 

1001. 

Bjelke, J. R., Christensen, J., Nielsen, P. F., Branner, S., Kanstrup, A. B., Wagtmann, N. ja 

Rasmussen, H. B. (2006). Dipeptidyl peptidases 8 and 9: specificity and molecular 

characterization compared with dipeptidyl peptidase IV. Biochem. J. 396: 391-399. 

Breslauer, K. J., Frank, R., Blocker, H. ja Marky, L. A. (1986). Predicting DNA duplex stability 

from the base sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83: 3746-3750. 

Brown, C. Y., Mize, G. J., Pineda, M., George, D. L. ja Morris, D. R. (1999). Role of two 

upstream open reading frames in the translational control of oncogene mdm2. Oncogene 

18: 5631-5637. 

Chenna, R., Sugawara, H., Koike, T., Lopez, R., Gibson, T. J., Higgins, D. G. ja Thompson, J. D. 

(2003). Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acids 

Res 31: 3497-3500. 

52

Churbanov, A., Rogozin, I. B., Babenko, V. N., Ali, H. ja Koonin, E. V. (2005). Evolutionary 

conservation suggests a regulatory function of AUG triplets in 5'-UTRs of eukaryotic 

genes. Nucleic Acids Res 33: 5512-5520. 

Crowe, M. L., Wang, X. Q. ja Rothnagel, J. A. (2006). Evidence for conservation and selection 

of upstream open reading frames suggests probable encoding of bioactive peptides. BMC 

genomics 7: 16. 

Degnin, C. R., Schleiss, M. R., Cao, J. ja Geballe, A. P. (1993). Translational inhibition mediated 

by a short upstream open reading frame in the human cytomegalovirus gpUL4 (gp48) 

transcript. J. Virol. 67: 5514-5521. 

Fang, P., Spevak, C. C., Wu, C. ja Sachs, M. S. (2004). A nascent polypeptide domain that can 

regulate translation elongation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101: 4059-4064. 

Gaba, A., Jacobson, A. ja Sachs, M. S. (2005). Ribosome occupancy of the yeast CPA1 upstream 

open reading frame termination codon modulates nonsense-mediated mRNA decay. Mol. 

Cell 20: 449-460. 

Ghilardi, N., Wiestner, A. ja Skoda, R. C. (1998). Thrombopoietin production is inhibited by a 

translational mechanism. Blood 92: 4023-4030. 

Grant, C. M. ja Hinnebusch, A. G. (1994). Effect of sequence context at stop codons on 

efficiency of reinitiation in GCN4 translational control. Mol. Cell. Biol. 14: 606-618. 

Hall, T. A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis 

program for Windows 95/98/NT. Nucl Acids Symp Ser 41: 95-98. 

Han, B., Dong, Z., Liu, Y., Chen, Q., Hashimoto, K. ja Zhang, J. T. (2003). Regulation of 

constitutive expression of mouse PTEN by the 5'-untranslated region. Oncogene 22: 

5325-5337. 

Hansen, M. B., Mitchelmore, C., Kjaerulff, K. M., Rasmussen, T. E., Pedersen, K. M. ja Jensen, 

N. A. (2002). Mouse Atf5: molecular cloning of two novel mRNAs, genomic 

organization, and odorant sensory neuron localization. Genomics 80: 344-350. 

Harding, H. P., Zhang, Y. ja Ron, D. (1999). Protein translation and folding are coupled by an 

endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature 397: 271-274. 

Hellen, C. ja Pestova, T. (2006) Translation Initiation: Molecular Mechanisms in Eukaryotes. 

Encyclopedia of Life Sciences. John Wiley & Sons, Ltd. 

Hinnebusch, A. G. (2005). Translational regulation of GCN4 and the general amino acid control 

of yeast. Annu. Rev. Microbiol. 59: 407-450. 

Inoue, H., Nojima, H. ja Okayama, H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli 

with plasmids. Gene 96: 23-28. 

Ishida, N. ja Kawakita, M. (2004). Molecular physiology and pathology of the nucleotide sugar 

transporter family (SLC35). Pflugers Arch. 447: 768-775. 

Jin, X., Turcott, E., Englehardt, S., Mize, G. J. ja Morris, D. R. (2003). The two upstream open 

reading frames of oncogene mdm2 have different translational regulatory properties. J. 

Biol. Chem. 278: 25716-25721. 

Kapp, L. D. ja Lorsch, J. R. (2004). The molecular mechanics of eukaryotic translation. Annu. 

Rev. Biochem. 73: 657-704. 

53

Kozak, M. (1986). Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that 

modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell 44: 283-292. 

Kozak, M. (1987). Effects of intercistronic length on the efficiency of reinitiation by eucaryotic 

ribosomes. Mol. Cell. Biol. 7: 3438-3445. 

Kozak, M. (1989). Circumstances and mechanisms of inhibition of translation by secondary 

structure in eucaryotic mRNAs. Mol. Cell. Biol. 9: 5134-5142. 

Kozak, M. (1990). Downstream secondary structure facilitates recognition of initiator codons by 

eukaryotic ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87: 8301-8305. 

Kozak, M. (1995). Adherence to the first-AUG rule when a second AUG codon follows closely 

upon the first. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92: 2662-2666. 

Kozak, M. (1997). Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in 

position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6. EMBO 

J. 16: 2482-2492. 

Kozak, M. (1998). Primer extension analysis of eukaryotic ribosome-mRNA complexes. Nucleic 

Acids Res 26: 4853-4859. 

Kozak, M. (2001). Constraints on reinitiation of translation in mammals. Nucleic Acids Res 29: 

5226-5232. 

Kozak, M. (2005). A second look at cellular mRNA sequences said to function as internal 

ribosome entry sites. Nucleic acids research 33: 6593-6602. 

Leach, R. E., Duniec-Dmuchowski, Z. M., Pesole, G., Tanaka, T. S., Ko, M. S., Armant, D. R. ja 

Krawetz, S. A. (2002). Identification, molecular characterization, and tissue expression of 

OVCOV1. Mamm. Genome 13: 619-624. 

Lee, Y. C., Chang, C. W., Su, C. W., Lin, T. N., Sun, S. H., Lai, H. L. ja Chern, Y. (1999). The 5' 

untranslated regions of the rat A2A adenosine receptor gene function as negative 

translational regulators. J. Neurochem. 73: 1790-1798. 

Leissring, M. A., Farris, W., Wu, X., Christodoulou, D. C., Haigis, M. C., Guarente, L. ja Selkoe, 

D. J. (2004). Alternative translation initiation generates a novel isoform of insulindegrading 

enzyme targeted to mitochondria. Biochem. J. 383: 439-446. 

Lo, H. J., Huang, H. K. ja Donahue, T. F. (1998). RNA polymerase I-promoted HIS4 expression 

yields uncapped, polyadenylated mRNA that is unstable and inefficiently translated in 

Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 18: 665-675. 

Lopez, S., Stuhl, L., Fichelson, S., Dubart-Kupperschmitt, A., St Arnaud, R., Galindo, J. R., 

Murati, A., Berda, N., Dubreuil, P. ja Gomez, S. (2005). NACA is a positive regulator of 

human erythroid-cell differentiation. J. Cell Sci. 118: 1595-1605. 

Lu, P. D., Harding, H. P. ja Ron, D. (2004). Translation reinitiation at alternative open reading 

frames regulates gene expression in an integrated stress response. J. Cell Biol. 167: 27-33. 

Mathews, D. H., Sabina, J., Zuker, M. ja Turner, D. H. (1999). Expanded sequence dependence 

of thermodynamic parameters improves prediction of RNA secondary structure. J. Mol. 

Biol. 288: 911-940. 

54

Matsui, M., Yachie, N., Okada, Y., Saito, R. ja Tomita, M. (2007). Bioinformatic analysis of 

post-transcriptional regulation by uORF in human and mouse. FEBS Lett. 581: 4184- 

4188. 

Matza-Porges, S., Horresh, I., Tavor, E., Panet, A. ja Honigman, A. (2005). Expression of an anti 

apoptotic recombinant short peptide in mammalian cells. Apoptosis 10: 987-996. 

Matza-Porges, S., Tavor, E., Panet, A. ja Honigman, A. (2003). Intracellular expression of a 

functional short peptide confers resistance to apoptosis. Exp. Cell Res. 290: 60-67. 

McCarthy, J. E. (1998). Posttranscriptional control of gene expression in yeast. Microbiol. Mol. 

Biol. Rev. 62: 1492-1553. 

Meijer, H. A. ja Thomas, A. A. (2003). Ribosomes stalling on uORF1 in the Xenopus Cx41 5' 

UTR inhibit downstream translation initiation. Nucleic Acids Res 31: 3174-3184. 

Mendoza, M. C., Booth, E. O., Shaulsky, G. ja Firtel, R. A. (2007). MEK1 and protein 

phosphatase 4 coordinate Dictyostelium development and chemotaxis. Mol. Cell. Biol. 

27: 3817-3827. 

Miller, P. F. ja Hinnebusch, A. G. (1989). Sequences that surround the stop codons of upstream 

open reading frames in GCN4 mRNA determine their distinct functions in translational 

control. Genes Dev. 3: 1217-1225. 

Mironov, A. A., Fickett, J. W. ja Gelfand, M. S. (1999). Frequent alternative splicing of human 

genes. Genome Res. 9: 1288-1293. 

Mize, G. J., Ruan, H., Low, J. J. ja Morris, D. R. (1998). The inhibitory upstream open reading 

frame from mammalian S-adenosylmethionine decarboxylase mRNA has a strict 

sequence specificity in critical positions. J. Biol. Chem. 273: 32500-32505. 

Monaco, S. E., Angelastro, J. M., Szabolcs, M. ja Greene, L. A. (2007). The transcription factor 

ATF5 is widely expressed in carcinomas, and interference with its function selectively 

kills neoplastic, but not nontransformed, breast cell lines. Int. J. Cancer 120: 1883-1890. 

Moreau, A., Yotov, W. V., Glorieux, F. H. ja St-Arnaud, R. (1998). Bone-specific expression of 

the alpha chain of the nascent polypeptide-associated complex, a coactivator potentiating 

c-Jun-mediated transcription. Mol. Cell. Biol. 18: 1312-1321. 

Muckenthaler, M., Gray, N. K. ja Hentze, M. W. (1998). IRP-1 binding to ferritin mRNA 

prevents the recruitment of the small ribosomal subunit by the cap-binding complex 

eIF4F. Mol. Cell 2: 383-388. 

Mueller, P. P., Jackson, B. M., Miller, P. F. ja Hinnebusch, A. G. (1988). The first and fourth 

upstream open reading frames in GCN4 mRNA have similar initiation efficiencies but 

respond differently in translational control to change in length and sequence. Mol. Cell. 

Biol. 8: 5439-5447. 

Nolan, T., Hands, R. E. ja Bustin, S. A. (2006). Quantification of mRNA using real-time RT- 

PCR. Nat Protoc 1: 1559-1582. 

Olsen, C. ja Wagtmann, N. (2002). Identification and characterization of human DPP9, a novel 

homologue of dipeptidyl peptidase IV. Gene 299: 185-193. 

Oyama, M., Kozuka-Hata, H., Suzuki, Y., Semba, K., Yamamoto, T. ja Sugano, S. (2007). 

Diversity of translation start sites may define increased complexity of the human short 

ORFeome. Mol Cell Proteomics 6: 1000-1006. 

55

Peri, S. ja Pandey, A. (2001). A reassessment of the translation initiation codon in vertebrates. 

Trends Genet. 17: 685-687. 

Persengiev, S. P., Devireddy, L. R. ja Green, M. R. (2002). Inhibition of apoptosis by ATFx: a 

novel role for a member of the ATF/CREB family of mammalian bZIP transcription 

factors. Genes Dev. 16: 1806-1814. 

Pruitt, K. D., Tatusova, T. ja Maglott, D. R. (2007). NCBI reference sequences (RefSeq): a 

curated non-redundant sequence database of genomes, transcripts and proteins. Nucleic 

Acids Res 35: D61-65. 

Rajkowitsch, L., Vilela, C., Berthelot, K., Ramirez, C. V. ja McCarthy, J. E. (2004). Reinitiation 

and recycling are distinct processes occurring downstream of translation termination in 

yeast. J. Mol. Biol. 335: 71-85. 

Raney, A., Law, G. L., Mize, G. J. ja Morris, D. R. (2002). Regulated translation termination at 

the upstream open reading frame in s-adenosylmethionine decarboxylase mRNA. J. Biol. 

Chem. 277: 5988-5994. 

Rouault, T. A. (2006). The role of iron regulatory proteins in mammalian iron homeostasis and 

disease. Nature chemical biology 2: 406-414. 

Ruan, H., Hill, J. R., Fatemie-Nainie, S. ja Morris, D. R. (1994). Cell-specific translational 

regulation of S-adenosylmethionine decarboxylase mRNA. Influence of the structure of 

the 5' transcript leader on regulation by the upstream open reading frame. J. Biol. Chem. 

269: 17905-17910. 

Sedman, S. A., Gelembiuk, G. W. ja Mertz, J. E. (1990). Translation initiation at a downstream 

AUG occurs with increased efficiency when the upstream AUG is located very close to 

the 5' cap. J. Virol. 64: 453-457. 

Short, J. D. ja Pfarr, C. M. (2002). Translational regulation of the JunD messenger RNA. J. Biol. 

Chem. 277: 32697-32705. 

Siridechadilok, B., Fraser, C. S., Hall, R. J., Doudna, J. A. ja Nogales, E. (2005). Structural roles 

for human translation factor eIF3 in initiation of protein synthesis. Science (New York, 

N.Y 310: 1513-1515. 

Zhou, D., Palam, L. R., Jiang, L., Narasimhan, J., Staschke, K. A. ja Wek, R. C. (2008) 

Phosphorylation of eIF2 Directs ATF5 Translational Control in Response to Diverse 

Stress Conditions. J. Biol. Chem., Vol. 283, pp. 7064-7073. 

Zuker, M. (2003). Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. 

Nucleic Acids Res 31: 3406-3415. 

Wang, X. Q. ja Rothnagel, J. A. (2004). 5'-untranslated regions with multiple upstream AUG 

codons can support low-level translation via leaky scanning and reinitiation. Nucleic 

Acids Res 32: 1382-1391. 

Watatani, Y., Ichikawa, K., Nakanishi, N., Fujimoto, M., Takeda, H., Kimura, N., Hirose, H., 

Takahashi, S. ja Takahashi, Y. (2008). Stress-induced translation of ATF5 mRNA is 

regulated by the 5'-untranslated region. J. Biol. Chem. 283: 2543-2553. 

Vattem, K. M. ja Wek, R. C. (2004). Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 

mRNA translation in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101: 11269-11274. 

56

Wek, R. C. ja Cavener, D. R. (2007). Translational control and the unfolded protein response. 

Antioxidants & redox signaling 9: 2357-2371. 

Wek, R. C., Jiang, H. Y. ja Anthony, T. G. (2006). Coping with stress: eIF2 kinases and 

translational control. Biochem. Soc. Trans. 34: 7-11. 

Werten, P. J., Stege, G. J. ja de Jong, W. W. (1999). The short 5' untranslated region of the 

betaA3/A1-crystallin mRNA is responsible for leaky ribosomal scanning. Mol. Biol. Rep. 

26: 201-205. 

Wong, W. L., Brostrom, M. A., Kuznetsov, G., Gmitter-Yellen, D. ja Brostrom, C. O. (1993). 

Inhibition of protein synthesis and early protein processing by thapsigargin in cultured 

cells. Biochem. J. 289 ( Pt 1): 71-79. 

Yamasaki, S. ja Anderson, P. (2008). Reprogramming mRNA translation during stress. Curr. 

Opin. Cell Biol. 20: 222-226. 

Yotov, W. V., Moreau, A. ja St-Arnaud, R. (1998). The alpha chain of the nascent polypeptideassociated 

complex functions as a transcriptional coactivator. Mol. Cell. Biol. 18: 1303- 

1311. 

Yotov, W. V. ja St-Arnaud, R. (1996). Differential splicing-in of a proline-rich exon converts 

alphaNAC into a muscle-specific transcription factor. Genes Dev. 10: 1763-1772. 

Yu, D. M., Wang, X. M., McCaughan, G. W. ja Gorrell, M. D. (2006). Extraenzymatic functions 

of the dipeptidyl peptidase IV-related proteins DP8 and DP9 in cell adhesion, migration 

and apoptosis. The FEBS journal 273: 2447-2460. 

57

KASUTATUD VEEBIAADRESSID 

ftp://ftp.ncbi.nih.gov – NCBI failiserver 

http://www.eclipse.org/ – Eclipse.org home 

http://www.fermentas.com/doubledigest/index.html – DoubleDigest - Buffer for 2 restrictases 

http://www.fermentas.com/techinfo/re/restrdigpcrii.htm – Cleavage Efficiency Close to the 

Termini of PCR Fragments 

http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/page2.html – BioEdit v7.0.9 General Information 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi – NCBI BLAST 

http://www.promega.com/enotes/faqspeak/9912/fq0013.htm – Which pRL Vector should I use 

for a Dual-Luciferase® Reporter Assay? 

http://www.promega.com/faq/catfaq.html#q16 – Where are the transcription start sites in the 

pCAT®3 Control Vector? 

http://www.promega.com/faq/lucifer.html – FAQs - Luciferase Assay System & Reporter 

Vectors 

http://www.promega.com/tbs/tb240/tb240.pdf – pRL-TK Vector (Technical Bulletin) 

http://www.promega.com/tbs/tm033/tm033.pdf – pGL3 Luciferase Reporter Vectors (Technical 

Manual) 

http://www.promega.com/tbs/tm040/tm040.pdf – Promega Dual-Luciferase Reporter Assay 

System 

http://www1.qiagen.com/HB/QIAGENPlasmidPurification_EN – QIAGEN Plasmid Purification 

Handbook (Third Edition, November 2005) 

https://www.finnzymes.fi/pdf/phusion_datasheet_f530sl_1_5_low.pdf – Finnzymes Phusion 

High-Fidelity DNA Polymerase Datasheet 

https://www.finnzymes.fi/tm_determination.html – Tm calculator for PCR 

58

Tiit Ãrd

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?

Tiit Ãrd