Genotüübi mõju NK rakkude käitumisele rakukultuuris

TARTU ÜLIKOOLLOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKONDMOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUTRAKUBIOLOOGIA ÕPPETOOLAnna ŠtšerbakovaGenotüübi mõju NK rakkude käitumisele rakukultuurisMagistritööJuhendajad:Alar Aints, PhDSulev Ingerpuu, PhDTARTU 2008

SISUKORDSISUKORD ....................................................................................................................................2KASUTATUD LÜHENDID .........................................................................................................4SISSEJUHATUS............................................................................................................................61. KIRJANDUSE ÜLEVAADE....................................................................................................71.1. Inimese NK rakud.................................................................................................................71.1.1 NK rakkude fenotüüp......................................................................................................71.1.2 NK rakkude areng ...........................................................................................................91.1.3 NK rakkude funktsioon ...................................................................................................91.2 NK rakkude retseptorid........................................................................................................111.2.1 NK raku inhibiitorretseptorid........................................................................................141.2.2 NK raku aktivatsiooni regulatsioon ..............................................................................151.3 NK rakkude poolt vahendatud märklaudrakkude tapmismehhanismid...............................161.3.1 Loomulik tsütotoksilisus ...............................................................................................161.3.2 Surmaretseptori ligandi rada .........................................................................................181.3.3 Tsütokiinide sekretsioon ...............................................................................................191.3.4 Antikehast sõltuv rakuline tsütotoksilisus.....................................................................191.4 NK rakkude kliiniline kasutamine .......................................................................................201.4.1 NK rakkude roll vereloome tüvirakkude transplantatsioonis........................................201.4.2 NK rakkude kasutamine vähivastases immunoteraapias ..............................................211.5 NK rakkude in vitro ekspansioon perifeersetest vererakkudest...........................................231.6 Häired NK rakkude tsütotoksilises aktiivsuses....................................................................241.7 NK rakkude tsütotoksilise aktiivsuse mõõtmine .................................................................252. MATERJAL JA METOODIKA ............................................................................................302.1 NK rakkude kogumine.........................................................................................................302.1.1 Lümfopreparatsioon ......................................................................................................302.2.2 Krüopreservatsioon .......................................................................................................322.2 Inimese seerum ....................................................................................................................322.3 Kasutatud rakuliinid.............................................................................................................322.4 Doonorrakkude kultiveerimine ............................................................................................332.5 Kasvajarakuliinide kultiveerimine.......................................................................................332.6 Doonorrakkude immunofenotüpiseerimine .........................................................................332

2.7 Tsütotoksilisuse reaktsioonide ettevalmistus.......................................................................342.8 Voolutsütomeetria................................................................................................................352.9 Andmetöötlus.......................................................................................................................383. TULEMUSED JA ARUTELU ...............................................................................................393.1 Doonorite NK rakkude ekspansioon....................................................................................393.2 NK rakkude ekspansiooni sõltuvus doonori HLA-C epitoopide ekspressioonist................413.3 Tsütomeetriliste andmete analüüs bi-eksponentsiaalse visualiseerimise põhjal..................413.4 NK rakkude aktiivsuse analüüsiks sobilik efektor/märklaudrakkude suhte vahemik .........443.5 NK rakkude tsütotoksilise funktsiooni seos Michaelis-Menteni seadusega........................443.6 NK rakkude tsütotoksilisuse seos märklaudrakkude koesobivusantigeenide ekspressiooniga...................................................................................................................................................44KOKKUVÕTE ............................................................................................................................48SUMMARY..................................................................................................................................49KASUTATUD KIRJANDUS......................................................................................................523

KASUTATUD LÜHENDID7-AAD (7-amino-actinomycin D) – 7-aminoaktinomütsiin DADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity) – antikehast sõltuv rakuline tsütotoksilisusBCECF – 2',7'-bis-karboksüetüül-karboksüfluorestseiinCFDA (carboxyfluorescein diacetate) – karboksüfluorestseiin diatsetaatCFSE (carboxyfluoroscein succinimidyl ester) – karboksüfluorestsiin suktsiinimidüülesterCRA ( 51 Chromium-release assay) – radioaktiivse kroomi vabastamise analüüsCTLR (C-type lectin-like receptor) – C-tüüpi lektiini sarnane retseptorFlt3-L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand) – FMS-sarnase türosiinkinaas 3 ligandGM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) – granulotsüüdi-makrofaagikolooniaid stimuleeriv faktorGvHD (graft-versus-host disease) – transplantaat-peremehe-vastu haigusHFWT – Wilms`i tuumori rakuliinHLA (human leukocyte antigen) – inimese leukotsüüdi antigeenICAM (intercellular adhesion molecules) – intertsellulaarne adhesiooni molekulIL – interleukiinINF γ – interferoon gammaITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) – immunoretseptor türosiin-põhineaktivatsioonimotiivITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) – immunoretseptor türosiin-põhineinhibitormotiivKIR (killer cell immunoglobulin-like receptor) – tappurraku immunoglobuliin-sarnane retseptorLCL (lymphoblastoid cell line) – lümfoblastoidne rakuliinLFA-1 – leukotsüütide funktsiooni antigeen-1MHC (major histocompatibility complex) – suur koesobivuskompleksMICA (MHC class I polypeptide-related sequence A) – MHC klass I polüpeptiidi sarnanejärjestus AMICB (MHC class I polypeptide-related sequence B) – MHC klass I polüpeptiidi sarnanejärjestus BMTT – 3-(4,5-dimetüültiazool-2-üül)-2,5-difenüültetrazoolium bromiidMUH – 4-metüülumbelliferüül heptanoaatNCAM (neural cellular adhesion molecule) – neuraalsete rakkude adhesiooni molekul4

NCR (natural cytotoxicity receptor) – loomuliku tsütotoksilisuse retseptorNK rakud (natural killer cells) – loomulikud tappurrakudSCF (stem cell factor) – tüviraku faktorTCR (T cell receptor) – T raku retseptorTGF-β (transforming growth factor beta) – transformeeriv kasvufaktor beetaTLR (toll-like receptor) – toll-like retseptorTNF (tumor necrosis factor) – kasvaja nekroosi faktorTRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) – TNF-seotud apoptoosi indutseeriv ligand5

SISSEJUHATUSVähiregistri andmetel haigestub Eestis igal aastal vähki ligi 6000 inimest ja sureb 3300.Vähi ravi edukuses on oluline roll erinevate ravistrateegiate omavahelisel kombineerimisel.Üheks siiani vähekasutatud ravimeetodiks on rakuline immunoteraapia.NK rakud on loomuliku immuunsüsteemi efektorrakud. Nende funktsiooniks onviiruslikult nakatunud rakkude primaarne elimineerimine, immuunaktivatsioon, -regulatsioon,ning kasvajate immuun-monitooring ja metastaseerumise pidurdamine.NK rakke on võimalik kasutada pahaloomuliste haiguste ravil ning vereloome tüvirakkudetransplantatsioonil komplikatsioonide vähendamiseks. Ühelt doonorilt saadavate NK rakkudehulk aga ei ole piisav immunoteraapia edukaks läbiviimiseks.NK rakke on võimalik rakukultuuris kasvatada. Seejuures on oluline, nende hilisematkliinilist kasutamist silmas pidades, ennustada nende ekspansioonivõimet ning täpselt mõõtakasvatatud rakkude tsütotoksilist funktsiooni.Käesoleva töö eesmärgiks oli uurida NK rakkude ekspansioonivõime sõltuvust doonoriHLA genotüübist ning optimiseerida kliiniliseks kasutamiseks sobiv meetod nende tsütotoksilisefunktsiooni täpseks mõõtmiseks.6

1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE1.1. Inimese NK rakudLoomulikud tappurrakud (Natural Killer cells; edaspidi NK rakud), avastati 1970-ndateaastate keskel (Kiessling, Klein et al. 1975). Avastamise aluseks oli nende funktsioon lüüsidateatud tüüpi kasvajarakke in vitro ilma, et peremehe immuunsüsteem oleks eelnevaltsensibiliseerunud. Aja jooksul on täienenud teadmised nende rakkude päritolust,diferentseerumisest, retseptorite repertuaarist, efektorfunktsioonist ja võimest kujundadaadapiivset immuunvastust.NK rakud on spetsiifiline lümfotsüütide populatsioon, mis erineb nii B- kui ka T-rakkudest oma fenotüübilt, morfoloogialt ja funktsioonilt. Morfoloogliselt on enamik NK rakkesuured granulaarsed lümfotsüüdid, millel on neerukujuline tuum, tavaliste lümfotsüütidegavõrreldes rohkem tsütoplasmat ning suured intratsütoplasmaatilised azurofiilsed graanulid. Nenderakkude keskmine diameeter puhkeolekus on 7-8 µm ja aktiveerunult 10-12 µm (See, Khemka etal. 1997).Inimese perifeerses veres moodustavad NK rakud 5-15% kogu vereringes olevatestlümfotsüütidest. Nende osakaal võib varieeruda sõltuvalt inimese vanusest (Shearer, Rosenblattet al. 2003). Vastsündinul on perifeerse vere NK rakkude osakaal kõrge (keskmiselt 20%), kuidminimaalne nivoo läbitakse 5.-9. elukuul, mil see langeb keskmisele tasemele 5%. Seejärelhakkab nende osakaal taas kasvama kuni hilise teismelise eani (Comans-Bitter, de Groot et al.1997). NK rakke leidub peale vereringesüsteemi ka maksas, kopsudes, emakas ja põrnas ningpõletikulistes või kasvajalistes kudedes (Morris and Ley 2004). On tähelepanuväärne, etlümfivedelikus ja -sõlmedes on NK rakke vähe. Peale stimulatsiooni akumuleeruvad NK rakudsiiski kiiresti regionaalsetes lümfisõlmedes (Fox, Fong et al. 1984).1.1.1 NK rakkude fenotüüpFenotüübilt eristatakse NK rakke T rakkudest TCR/CD3 kompleksi ja immunoglobuliinipuudumise alusel nende pinnal (Cooper, Fehniger et al. 2001). Positiivse NK raku markerinainimesel kasutatakse CD56, mida tuntakse ka neuraalsete rakkude adhesiooni molekulina(NCAM, neural cellular adhesion molecule). Lisaks võib CD56 esineda ka osadel T rakkudel,mis vahendavad NK-sarnast aktiivsust (Godfrey, MacDonald et al. 2004). NK rakkude fenotüübimarkerina kasutatakse ka CD16 (madala affiinsusega FcγRIII), mis osaleb retseptorina antikeha7

vahendatud rakulises tsütotoksilisuses seondudes antikeha Fc osaga (Mandelboim, Malik et al.1999). Seega NK rakkude fenotüüpi saab defineerida kui CD56 + CD16 + CD3 − .90-ndatel aastatel identifitseeriti ja iseloomustati uus klass NK rakkude spetsiifilisiloomuliku tsütotoksilisuse retseptoreid (NCR, natural cytotoxicity receptors): NKp46 (Sivori,Vitale et al. 1997), NKp44 (Vitale, Bottino et al. 1998) ja NKp30 (Pende, Parolini et al. 1999).Kui NKp30 ja NKp46 ekspresseeruvad kõigil NK rakkudel nii puhke- kui kaaktivatsiooniseisundis, siis NKp44 vaid aktiveeritud NK rakkudel. Nende markerite kasutaminetsütomeetrias võimaldab NK rakke üheselt positiivselt defineerida.NK rakkude populatsioon ei ole tegelikult homogeenne, sest paljud rakumarkerid onekspresseeritud heterogeenselt. CD56 ekspressiooni taseme põhjal saab perifeerse vere NK rakkejagada kaheks alampopulatsiooniks: CD56 dim ja CD56 bright (Cooper, Fehniger et al. 2001). 90%inimese NK rakkudest on CD56 dim , millel ekspresseeritakse kõrgel tasemel ka CD16, ülejäänud10% moodustavad CD56 bright ja CD16 dim/neg . CD56 dim NK rakud teostavad efektiivseltloomulikku- ja antikeha vahendatud tsütotoksilisust. Seevastu CD56 bright rakud täidavadpeamiselt immunoregulatoorset funktsiooni: stimulatsioon IL-2 ja IL-12 põhjustab neil rakkudelsuurema tsütokiinide kasvaja nekroosi faktori α (TNF-α, tumor necrosis factor α), interferoon γ(IFN-γ) ja granulotsüüdi-makrofaagi kolooniaid stimuleeriva faktori (GM–CSF, granulocytemacrophagecolony-stimulating factor) ekspressiooni (Cooper, Fehniger et al. 2001). CD56 brightNK rakkudel ekspresseeritakse konstitutiivselt kõrge ja keskmise affiinsusega IL-2 retseptoreidning need rakud on seetõttu võimelised ekspandeeruma in vitro ja in vivo vastusena madalamatele(pikomolaarsetele) IL-2 doosidele (Caligiuri, Zmuidzinas et al. 1990). CD56 dim ja CD56 brightpopulatsioonid erinevad ka ekspresseeritavate retseptorite repertuaari poolest (Andre, Spertini etal. 2000). Puhkavad CD56 bright NK rakud on suured agranulaarsed rakud, mis ekspresseerivadkõrgel tasemel C-tüüpi lektiini CD94/NKG2 perekonna retseptoreid ja vähem tappurrakuimmunoglobuliini sarnaseid retseptoreid (KIR, killer cell immunoglobulin-like receptors)(Nagler, Lanier et al. 1989). Puhkavate CD56 dim NK rakkude pinnal on suhteliselt tihedaltekspresseeritud nii KIR kui ka C-tüüpi lektiini NK retseptoreid ning nende tsütoplasmas esinebpalju tsütolüütilisi graanuleid (Nagler, Lanier et al. 1989).Jonges jt. (Jonges, Albertsson et al. 2001) on defineerinud kokku vähemalt 48 erinevatperifeerse vere NK rakkude alampopulatsiooni. Heterogeenne pinnamarkerite ekspressioon võibolla seotud nii NK rakkude diferntseerumise kui ka funktsiooniga (Jonges, Albertsson et al.2001).8

1.1.2 NK rakkude arengNK rakud arenevad luuüdis CD34 + hematopoeetilistest eellasrakkudest. Luuüdimikrokeskkond toodab NK rakkude arengu jaoks vajalikke tsütokiine nagu IL-15, tüvirakufaktorit (SCF, stem cell factor) ning FMS-sarnast türosiinkinaas-3 ligandi (Flt3-L, FMS-liketyrosine kinase 3 ligand), mis on NK rakkude jaoks kriitilise tähtsusega (Perussia, Chen et al.2005). NK rakkude eellastest arenevad strooma rakkude kasvufaktorite mõjul NK rakkudeintermediaadid fenotüübiga CD34 + IL-2/IL-15Rβ + CD56 - , millest IL-15 toimel omakorda arenevadfunktsionaalsed CD56 + NK rakud. CD56 dim NK rakkude repertuaari tekkimist reguleeritavadfaktorid ei ole veel selged (Miller and McCullar 2001).1.1.3 NK rakkude funktsioonNK rakkude peamine funktsioon on viirustega infitseerunud ja/või kasvaja rakkudespontaanne lüüsimine (Hokland and Kuppen 2005). NK rakud võivad mõningates olukordadesosaleda mikroorganismidele suunatud immuunvastuses, näiteks Legionella pneumophila` jaMycobactyerium tuberculosis`e puhul. Senini pole teada, et NK rakud tunneksid otseselt ärabaktereid, seeni või parasiite. Mõned bakteriaalsed infektsioonid siiski indutseerivad NK rakkudeaktivatsiooniretseptori NKG2D ligandide ekspressiooni, mis võibki olla võimalikuks NK rakkudeaktivatsiooni mehhanismiks (Lanier 2008).NK rakud osalevad mediaatoritena või efektoritena ka arvukates immuunsüsteemiarengu-, regulatsiooni- ja kommunikatsiooni võrkudes. Aktiveeritud NK rakud toodavad mitmeidtsütokiine: hematopoeetilisi kasvufaktoreid, interferoone, interleukiine, kasvaja nekroosifaktoreid TNF-α ja β, transformeerivat ja teisi kasvufaktoreid (Perussia 1991).Lisaks osalevad NK rakud ka kontakt-sõltuvas kostimulatsioonis, ekspresseerides mitmeidko-stimulatoorseid ligande, näiteks CD40L (CD154) ja OX40L , mis võimaldavad neil edastadakostimulatoorseid signaale T ja B rakkudele (Zingoni, Sornasse et al. 2004) (Blanca, Bere et al.2001). Seega saab öelda, et NK rakud on „sillaks” loomuliku ja adaptiivse immuunsuse vahel.1.1.3.1 NK rakud ja viiruselised infektsioonidNK rakud kaitsevad organismi paljude viiruste eest. Need rakud on olulised kaitsel näiteksB-rakulist lümfoomi põhjustava Epstein-Barr`i viiruse (Mandelboim, Lieberman et al. 2001),Kaposi sarkomi indutseeriva inimese herpesviiruse 8 (Coscoy, Sanchez et al. 2001), inimese9

tsütomegaloviiruse, Varicella- zoster viiruse, Herpes simplex viiruse, poxviiruste, gripiviiruste,ning hepatiidiviiruste B ja C eest (See, Khemka et al. 1997).NK rakkude tähtsust viirusinfektioonide piiramisel näitab hiiremudel, kus antikehade abilinaktiveeriti hiire NK rakuline aktiivsus, mis põhjustas hiire tsütomegaloviiruse tiitrite ja üldiseinfektisoonitundlikkuse suurenemist (Biron, Nguyen et al. 1999).NK rakkude viirusevastased funktsioonid toimivad tsütolüüsi ja tsütokiinide vabastamisekaudu (Biron, Nguyen et al. 1999). Viirusinfektisoon põhjustab nakatunud rakkude suurekoesobivuskompleksi klass I (MHC I, major histocompatibility complex class I) molekulideekspressiooni vähenemist, mis muudab need tundlikeks NK rakkude poolt vahendatud lüüsile.Viirusega infitseerunud rakkude äratundmiseks on NK rakkudel olemas ka täiendavadmehhanismid. Nakatunud rakud võivad ekspresseerida stress-indutseeritud MHC klass Isarnaseid molekule MICA ja MICB (Bauer, Groh et al. 1999), mille tunneb ära NK rakuaktivatsiooniretseptor NKG2D. NK raku aktivatsiooniretseptorid võivad samuti ära tunda võiinterakteeruda viiruse poolt kodeeritud molekulidega. NK raku retseptorid NKp44 ja NKp46interakteeruvad gripiviiruse hemaglutiniiniga ja paragripi hemaglutiniin-neuraminidaasiga, mispõhjustab viiruse glükoproteiine ekspresseeriva raku lüüsi (Mandelboim, Lieberman et al. 2001).Viirustel on välja kujunenud mitmeid mehhanisme NK rakkude vahendatudimmuunvastuse vältimiseks (Cerwenka and Lanier 2001). Inimese tsütomegaloviiruse UL40valgu signaalpeptiid stabiliseerib HLA-E molekuli ekspressiooni, mis põhjustab NK rakkudeinhibitsiooni CD94/NKG2A retseptorite kaudu (Tomasec, Braud et al. 2000). C-hepatiidi viirusevalk E2 seondub NK rakkude CD81 molekuliga, mis vähendab NK rakkude kostimulatsiooni,tsütotoksilisust ja IFN-γ tootmist (Tseng and Klimpel 2002). Samuti on viiruste märklauaks NKrakkude aktivatsiooniretseptorid. On teada, et inimese tsütomegaloviiruse valk UL16 blokeeribtemaga seonduvate valkude ULBP1, ULBP2 ja MICB seondumist NKG2D retseptoriga ja seegaka NK raku aktivatsiooni (Spreu, Stehle et al. 2006).1.1.3.2 NK rakud ja kasvajadIn vitro uuringud on näidanud NK rakkude võimet tappa mitmeid erinevaid hiire jainimese kasvajalisi rakke (Wu and Lanier 2003). Otsene tõestus NK rakkude kasvajavastaseaktiivsuse kohta tuli nende interaktsioonide ex vivo uurimisest primaarsete kasvajarakkudega.Sellisel viisil on uuritud neuroblastoomide, munasarja kartsinoomide ja multiipse müeloomivastast aktiivsust (Carlsten, Bjorkstrom et al. 2007), (Castriconi, Dondero et al. 2004), (El-10

Sherbiny, Meade et al. 2007). Kliiniliselt on sooritatud ka NK rakkude allogeenseid ülekandeidvähihaigetele (Ljunggren and Malmberg 2007). Vaatamata arvukatele uuringutele, mis tõestavadNK rakkude kasvajavastast aktiivsust in vitro ja in vivo eksperimentaalmudelites (Wu and Lanier2003), on aktiveeritud NK rakkude ülekanne vähihaigetele kliiniliselt efektiivne vaid piiratudjuhtudel (Malmberg, Bryceson et al. 2008).Kõik kasvajad pole tundlikud NK rakkude vahendatud lüüsile. Resistentsust võivadpõhjustada mõnede kasvajarakkude endi spetsiifilised omadused ning kasvajate mõju NKrakkudele. Eksperimentaalmudelite ja inimsese kasvajate uuringud on näidanud kasvajarakkudepääsemist NK rakkude vahendatud lüüsist (Hayakawa and Smyth 2006) mõnedemetastaseeruvate kasvajarakkude kõrge MHC I ekspressioonitaseme tõttu ja/või NK rakuaktivatsiooniretseptorite ligandide kaotamise abil (Costello, Sivori et al. 2002). NK rakkudeaktivatsiooniretseptorite ekspressiooni vähenemist võib põhjustada transformeeriv kasvufaktor β(TGF-β, transforming growth factor β), mis selektiivselt surub maha mõnede nende retseptoriteekspressiooni (Castriconi, Cantoni et al. 2003). Seda võivad tingida NK rakkude interaktsioonidkasvajarakkudega, näiteks DNAM-1 ekspressiooni mahasurumine peale polioviiruse retseptoritekspreseerivate munasarja kartsinoomide äratundmist (El-Sherbiny, Meade et al. 2007).Kasvajarakud võivad piirata NK rakkude efektorfunktsiooni soodustades CD4 + CD25 + regulaatorT rakkude ekspansiooni, mis omakorda suruvad maha NK rakkude proliferatsiooni,tsütotoksilisuse ja IL-12 vahendatud IFN-γ tootmist (Smyth, Teng et al. 2006).1.2 NK rakkude retseptoridErinevalt teistest lümfotsüütidest, ei toimu NK rakkudel retseptorite klonaalsetselektsiooni. Seega võiks arvata, et NK rakud reageerivad vaid piiratud stiimulite arvule. Samason NK rakkudel mitmeid mehhanisme, mis võimaldavad reageerida paljudele infektsioonidele jakasvajatele:1) NK rakud ekspresseerivad retseptoreid, millest igaühel võib olla erinev diskreetsete stiimulitetagajärjel üle- või alaekspresseeritud ligand.2) Mõnda retseptorit ekspresseeritakse vaid kindlatel NK rakkude alampopulatsioonidel.3) Inimpopulatsioonis esineb NK retseptorite geneetiline diversiteet, eriti KIR molekulidel.Aastal 1986 avastasid Ljunggren ja Kärre, et MHC klass I molekule mitteekspresseerivadkasvajarakud olid tundlikud NK rakkude vahendatud lüüsile (Karre, Ljunggren et al. 1986). Sedanähtust seletati “puuduva enese” hüpoteesiga (“missing self” hypothesis): NK rakkude11

funktsiooon on ära tunda ja tappa autoloogseid rakke, mille pinnal puuduvad või on teistsugusedenese-MHC klass I molekulid (Ljunggren and Karre 1990). Inimese MHC molekule nimetatakseinimese leukotsüüdi antigeenideks (HLA, human leukocyte antigen). NK rakud on tolerantsednormaalsetele autoloogsetele rakkudele, kuid võivad ära tunda ja lüüsida viirusega nakatunud võitransformeerunud rakke, mis supresseerivad MHC I ekspressiooni. NK rakud ekspresseerivadmitmeid erinevaid inhibiitorretseptoreid klassikalistele (HLA-A, -B, -C) või mitteklassikalistele(HLA-E, -G) klass I molekulidele. MHC klass I pole alati vajalik kaitseks NK vahendatud lüüsieest ning MHC klass I inhibitoorsest funktsioonist ei pruugi piisata NK rakkude tsütotoksilisusepidurdamiseks. Näiteks NK rakud ei lüüsi puuduva MHC klass I mittehematopoeetilisi kudesid jafibroblaste in vitro isegi kui need on pärit β 2 -mikroglobuliin-null hiirelt, kes ei ekspresseeriMHC klass I (Zijlstra, Auchincloss et al. 1992). Ja vastupidi – mõned viirusega infitseerunudrakud, mis säilitavad MHC klass I ekspressiooni on tundlikud autoloogsete NK rakkude lüüsile(Malnati, Lusso et al. 1993). Lisaks sellele on IL-2 aktiveeritud NK rakkudel suurem lüütilineaktiivsus võrreldes aktiveerimata rakkudega ning need võivad seetõttu lüüsida ka muidu NKresistentseidmärklaudrakke (Caligiuri, Zmuidzinas et al. 1990). Need näited viitavad, et NKrakkude efektorfunktsioonide regulatsioonis mängivad tähtsat rolli aktivatsiooniretseptorid. IgaNK rakk ekspresseerib individuaalset aktiveerivate ja inhibeerivate retseptorite repertuaari jatsütotoksilisus on reguleeritud nendelt retseptoritelt tulevate signaalide tasakaalu kaudu (Lanier2005).MHC klass I spetsiifilised aktivatsiooni- ja inhibiitorretseptorite komplektid onstruktuurselt ja funktsionaalselt erinevad. Struktuuri alusel saab jagada need kahte perekonda(Joonis 1):1) tappurraku immunoglobuliin-sarnased retseptorid (KIR)2) C-tüüpi lektiini sarnased retseptorid (CTLR, C-type lectin-like receptor)12

Joonis 1. Inimese NK rakkude MHC klass I spetsiifilised retseptorid. Inimese NK rakudekspresserivad kahte MHC I spetsiifiliste retseptorite perekonda. Nende struktuurne diversiteetekstratsellulaarses regioonis on kohandunud erinevatele MHC I klassidele. Tsütoplasmaatiliseosa diversiteet on seotud nende inhibiitor- või aktivatsiooni funktsioonidega. Sulgudes on antudNK retseptorite individuaalsed ligandid. K – retseptori transmembraanses domäänis olev lüsiin(Rajalingam 2002).KIR molekulid on immunoglobuliin-sarnaste retseptorite klassi liikmed, mida kodeerivadleukotsüüdi retseptorkompleksi 14 polümorfset geeniperekonda (Wilson, Torkar et al. 2000). KIRjaotatakse gruppideks ekstratsellulaarse regiooni immunoglobuliini-domäänide arvu jatsütoplasmaatilise saba pikkuse alusel. Omavahel eristatakse kolme- ja kahte immunoglobuliinidomäänisisaldavaid retseptoreid, vastavalt KIR3D ja KIR2D (Andre, Biassoni et al. 2001).Tsütoplasmaatilise osa pikkuse alusel saab neid edasi gruppeerida kas pika (L) sabaga KIR võilühikese (S) sabaga KIR rühmadeks. KIR-L tsütoplasmaatilises osas asuvad üks või kaksimmunoretseptor türosiin-põhist inhibitoorset motiivi (ITIM) ning nad vahendavad inhibitoorseidsignaale. Lühikese sabaga KIR molekulidel ITIM puuduvad, kuid on olemas laetudaminohappejääk transmembraanses osas, mis seondub positiivset signaali edastavaadaptormolekuliga DAP12.C-tüüpi lektiini sarnaseid retseptoreid kodeerib kuus konserveerunud geeni, mis asuvadNK geeni kompleksis (Yabe, McSherry et al. 1993). Neid ekspresseritakse heterodimeeridena(CD94:NKG2) või homodimeeridena (NKG2D:NKG2D). Nendest vaid NKG2A-l omab ITIMmotiivi tsütoplasmaatilises osas, mis edastab inhibiitorsignaale. Teistel selle perekonnaretseptoritel puudub ITIM, kuid nagu KIR-S molekulidelgi, on olemas laetud aminohappejääkDAP12 ja DAP10 seondamiseks.KIR geenid on väga polümorfsed (Rajalingam, Gardiner et al. 2001), mis põhjustabunikaalse haplotüübilise diversiteedi tekkimist KIR geenide tüüpides ja arvus (Wilson, Torkar etal. 2000). Kuna HLA on samuti polümorfsed, eristab indiviide üksteisest kombineeritud13

haplotüüpide ja allotüüpide mitmekesisus (Shilling, Guethlein et al. 2002). Lisaks sellele tekitabalternatiivne RNA splaising täientavat diversiteeti mõnede KIR järjestustele transkriptisoonitasemel (Dohring, Samaridis et al. 1996). Inimese NK rakud ekspresseerivad erineval arvul KIRja NKG2 molekule (1 kuni 19) ning erinevaid inhibiitor- ja aktivatsiooniretseptoritekombinatsioone, mis lisab NK rakkude retseptorite repertuaari veel täiendavat keerukust(Valiante, Uhrberg et al. 1997). NK rakud võivad ekspresseerida 2-9 KIR, mille seast vähemaltüks on inhibiitorretseptor enese- MHC klass I molekulile.1.2.1 NK raku inhibiitorretseptoridNK rakud ekspresseerivad inhibiitorretseptoreid, mis seonduvad MHC I molekulidega(inhibitoorsed KIR, LIR-1 ja NKG2A) ning inhibiitorretseptoreid, mis seonduvad mitte-MHC Iligandidega (KLRG1, NKP-P1, Siglec-7 ja -9, IRp60). Peale ligandiga seondumist toimub nenderetseptorite ITIM motiivis oleva türosiini fosforüleerimine, mis rakendab ja aktiveerib rakuaktivatsiooni takistavaid Src homoloogiat sisaldavaid türosiinfosfataase SHP-1 ja SHP-2.NKG2A ligandiks on mitte-klassikaline MHC klass I molekul HLA-E, mis omakordafunktsioneerib klassikaliste MHC klass I molekulide ekspressiooni „andurina“, sest seepresenteerib HLA molekulide liiderpeptiide (Lee, Llano et al. 1998). NK inhibiitorretseptor LIR-1 seob lisaks mitte-klassikalisele MHC I molekulile HLA-G ka mitmeid klassikaliste MHC klassI allelle (Chapman, Heikeman et al. 1999).Tappurraku lektiini-sarnane inhibiitorretseptor KLRG1, mis on ekspresseeritud fenotüübiltküpsete puhkavate NK rakkude alampopulatsioonil (Voehringer, Koschella et al. 2002), seobrakuliideste valkude perekonna kadheriini molekule (Ito, Maruyama et al. 2006). E-kadheriiniekspressiooni kadumine epiteliaalsete kasvajate metastaseerumise käigus võimaldab KLRG1ekspresseerivate NK rakkude aktivatsiooni nende epiteliaalse kasvajarakkude vastu (Ito,Maruyama et al. 2006). Veel üks lektiini-sarnane inhibiitorretseptor, loomuliku tappurrakuretseptorvalk NKR-P1 (CD161), seondub kadheriini sarnase, kuid laialdasema ekspressioonigalektiini sarnase transkriptiga LLT1 (Rosen, Bettadapura et al. 2005). NK rakkudealampopulatsioonid ekspresseerivad samuti siaalhappega seonduvaid retseptoreid Siglec-7 (ehkCD238) ja Siglec-9 (ehk CD239) (Avril, Floyd et al. 2004). Inhibiitorretseptorit IRp60 (ehkCD300a) ekspresseerivad kõik NK rakud (Cantoni, Bottino et al. 1999), kuid selle ligandi veel eiteata.14

1.2.2 NK raku aktivatsiooni regulatsioonNK rakkude pinnal ekspresseeritud aktivatsioonikompleksid moodustuvadtransmembraansetest ligandi siduvatest retseptor-polüpeptiididest ja signaali edastavatestadaptorvalkudest. NK rakud ekspresseerivad adaptorvalke CD3ζ, FcεRIγ ja DAP12, missisaldavad enda tsütoplasmaatilises osas ühte või kolme immunoretseptor türosiin-põhistaktivatsioonimotiivi (ITAM); ning DAP10, mis sisaldab ITAM asemel YxxM motiivi (Lanier2003). Retseptorid CD16, NKp30 ja NKp46 interakteeruvad adaptorvalkudega CD3ζ ja FcεRIγ;retseptorid CD94/NKG2C, NKp44 ja aktivaator-KIR (KIR-S) seonduvad adaptorvalgugaDAP12; ning aktivatsiooniretseptor NKG2D seondub DAP10. ITAM sisaldava adaptoriligeerimine aktiveerib Src perekonna proteiin-türosiinkinaase (näiteks p56lck ja p59fyn), misfosforüleerivad ITAM motiivi türosiine, põhjustades sellega Syk perekonna proteiintürosiinkinaaside(näiteks Syk ja ZAP70) rakendamist ja aktivatsiooni. Edasisesaktivatsioonisignaali ülekandes osalevad erinevad transmembraansed (näiteks LAT) jatsütosoolsed (näiteks SLP-76 ja 3BP2) adaptorid (Joonis 2). DAP10 signaali rada on ITAMsignaalirajast erinev ning ei sõltu Syk-perekonna proteiin-türosiinkinaasidest – selles osalevadGrb-2, fosfolipaas C-γ1, SLP-76 ja fosfatidüülinositool 3-kinaas. ITAM-sisaldavatelt ja DAP10adaptorvalkudelt tulevad signaalid ühinevad NK raku tsütotoksilisuse rajal, milles toimub Racaktivatsioon, mis omakorda põhjustab MEK ja ERK kinaaside aktivatsiooni (Lanier 2003)(Joonis 2). Selle tulemusena toimub intratsütoplasmaatiliste graanulite ümberpaiknemine jaeksotsütoos NK- ja märklaudraku kokkupuute kohta. Tsütotoksilisuse ja tsütokiinide sekretsioonsõltub erinevatest signaaliradadest (Billadeau, Upshaw et al. 2003).NK rakkude aktivatsioonis osalevad samuti retseptorid, mis ei seondu ITAM-sisaldavateadaptorvalkude ega DAP10-ga. 2B4 (CD244), NTB-A, CD160 ja integriinid funktsioneerivad koaktivaatoritevõi ko-stimulaatoritena, kuuludes retseptorkomplekside koosseisu (Lanier 2003).15

Joonis 2. NK raku signaali ülekande rajad. Näidatud on oligomeersed aktivatsiooniretseptorid,mis sisaldavad ITAM-kandvaid molekule (sinised) või DAP10 (rohelised); ning MHC klass Ispetsiifilised inhibiitorretseptorid (punased). * – tähistab transmembraanset laetud aminohapet.(Vivier, Nunes et al. 2004).1.3 NK rakkude poolt vahendatud märklaudrakkude tapmismehhanismidNK rakud võivad kasutada kasvajarakkude ja viirusega infitseerunud rakkude tapmisekserinevaid otseseid ja kaudseid mehhanisme: tsütotoksiliste graanulite eksotsütoosi (loomuliktsütotoksilisus), death-retseptori vahendatud apoptoosi indutseerimist, tsütokiinide tootmist ningantikehast sõltuvat rakulise tsütotoksilisuse mehhanismi.1.3.1 Loomulik tsütotoksilisusLoomulikku tsütotoksilisust initsieerivad adhesiooni retseptorid, mis toovad NK jamärklaudrakke kokku. Nende vahele moodustub tihe kontakt ning käivitub NK rakkudeaktivatsioon (Kagi, Ledermann et al. 1996). NK rakud ekspresseerivad mitmeid integriine, kuid16

dominantset rolli märklaudraku lüüsis mängib tõenäoliselt leukotsüütide funktsiooni antigeen-1(LFA-1) (Helander and Timonen 1998). LFA-1 integriin on α L (CD11a) ja β 2 (CD18)polüpeptiidide heterodimeer, mis seondub rakupinnal ekspresseeritud intertsellulaarseteadhesiooni molekulidega (ICAM, intercellular adhesion molecule) ICAM-1, ICAM-2 ningICAM-3. Bryceson jt. (Bryceson, March et al. 2005) on näidanud, et puhkeolekus NK rakkudeLFA-1 seondumine ICAM-1 või ICAM-2 on piisav adhesiooni indutseerimiseks. LFA-1 sõltuvatadhesiooni soodustavad eksogeensed IL-2 ja IL-15. Märklaudraku pinnal ekspresseeritavad CD2,CD16 ja 2B4 ligandid tugevdavad puhkavate NK rakkude adhesiooni (Bryceson, March et al.2005). Eraldivõetult need retseptorid adhesiooni ei indutseeri. LFA-1 sõltuvat adhesioonistimuleerib ka immunoglobuliini perekonna molekul CD44 (Matsumoto, Nghiem et al. 1998).Peale adhesiooni toimub NK rakus tsütoskeleti aktiini, Golgi aparaadi, mikrotuubulitening tsütotoksiliste graanulite polarisatsioon. Tsütotoksilised graanulid (lüütilised lüsosoomid)sisaldavad seriin-proteaase gransüüm A ja B, membraani kahjustavat valku perforiini jaantimikroobset lüütilist molekuli granulüsiini (Lieberman 2003). Graanulite sees moodustavadperforiin ja gransüümid kompleksi proteoglükaani serglütsiiniga, mis täidab kandjamolekuli rollining võib samuti kergendada gransüümi pääsemist märklaudrakku. Varasema teooria kohaseltvõis gransüümi internalisatsioon toimuda perforiini poolt moodustanud pooride kaudurakumembraanis, mis võimaldaks gransüümide passiivset diffusiooni rakku (Metkar, Wang et al.2002). Hiljutised andmed viitavad siiski sellele, et perforiin mitte ei “puuri” auke märklaudrakumembraani, vaid pigem võimaldab lüütiliste kompleksite vabanemist endotsütootilistestmärklaudraku vesiiklitest, kuhu need vastasel juhul kinni jääksid (Metkar, Wang et al. 2002).Erinevalt T rakkudest, toimub polarisatsioon NK rakus astmeliselt, mis viitabkontrollpunktide olemasolule selles protsessis (Wulfing, Purtic et al. 2003). Tsütotoksilistegraanulite polarisatsiooniks puhkavates või IL-2-ga aktiveeritud NK rakkudes piisab LFA-1retseptori interaktisoonist ligandiga ICAM-1. Bryceson jt. (Bryceson, March et al. 2005) onnäidanud, et LFA-1 on oluline mitte ainult adhesioonis, vaid ka tsütotoksilisuse aktivatsioonis.Graanulite polarisatsioon võib toimuda ka LFA-1 osaluseta CD16 ja 2B4 retseptoritelt tulenevatesignaalide kombinatsiooni tulemusena (Bryceson, March et al. 2005).Degranulatsiooni toimumiseks pole LFA-1 retseptor vajalik. LFA-1 sõltuva signaalipuudumisel piisab degranulatsiooni aktiveerimsieks CD16 retseptori interaktsioonist temaligandiga (Bryceson, March et al. 2005). NK raku degranulatsiooniks on vajalik kaltsium ningseda protsessi indutseerib proteiinkinaas C G-valgust sõltuva raja kaudu (Ting, Schoon et al.17

1992). Samas näidati ka, et tsütosoolne Ca 2+ on piisav degranulatsiooni indutseerimiseks (Liu, Xuet al. 2005).Peale märklaudraku äratundmist liiguvad lüütilised granulid immunoloogilise sünapsijuurde, graanuli välismembraan ühineb plasmamembraaniga ning vabastab oma lüütilise sisusünaptilisse ruumi, eksponeerides seega oma luumenipoolse pinna väljapoole. Graanulitemembraan sisaldab suurel hulgal lüsosomaalseid membraanivalke LAMP-1 (ehk CD107a) jaLAMP-2 (ehk CD107b) (Chang, Karageorgos et al. 2002). Reeglina on nad peidetud graanulitesisse, kuid degranulatsiooni prosessi käigus satuvad nad raku pinnale, kus neid saab detekteeridaCD107-spetsiifiliste antikehade abil.Peale gransüümide toimetamist märklaudraku tsütosooli indutseeritakse raku surmerinevate kaspaasidest sõltumatute (gransüüm A ja B) ja sõltuvate (gransüüm B) apoptootilisteradade aktivatsiooni kaudu (Lieberman 2003).1.3.2 Surmaretseptori ligandi radaNK rakud ekspresseerivad vähemalt kolme TNF perekonna ligandi (Fas ligandi, TNF-α jaTRAIL) mis, aktiveerides tsütoplasmaatilist surma-domääni sisaldavaid retseptoreid (misomakorda kaudselt aktiveerivad kaspaase) kutsuvad esile kasvajarakkude apoptoosi (Ashkenazi2002). Reeglina ekspresseerib TRAIL molekule väike populatsioon maksa NK rakke (~25–35%)(Zitvogel 2002), kuid selle ekspressiooni teistel rakkudel võivad indutseeida tsütokiinid IL-15 jaIFN-γ (Zhang, Sun et al. 1998). TRAIL on tähtis immuunefektormolekul kasvaja tekkimise,kasvu ja leviku takistamises. NK rakkude stimulatsioon tsütokiinide, vastavate märklaudrakkudevõi FcγRIIIA ligandidega indutseerib neil funktsionaalse Fas ligandi tootmist (Zamai, Ahmad etal. 1998), mis põhjustab konstitutiivselt Fas ekspresseerivate kasvajate lüüsi (Bradley, Zeytun etal. 1998). NK rakud võivad samuti põhjustada Fas ekspressiooni suurenemist Fas-negatiivsetelkasvajatel ning seejärel lüüsida need Fas-sõltuval mehhanismil (Screpanti, Wallin et al. 2001).Fas ligandi ekspresserivad NK rakud hävitavad maksa kasvajate metastaase (Takeda, Hayakawaet al. 2001). Teiste TNF perekonna molekulide osatähtsus NK rakkude poolt vahendatudkasvajakontrollis pole veel täpselt selgunud (Cifone, D'Alo et al. 1999).On näidatud, et aktiveeritud NK rakud ise ekspresseerivad mõningaid surma retseptoreid,nagu CD95 (Taylor, Ward et al. 2002), mis osaleb NK rakkude funktsiooni negatiivses kontrollis.Mirandola jt. (Mirandola, Ponti et al. 2004) on näidanud, et aktiveeritud inimese NK ja CD8 +rakud ekspresseerivad nii TRAIL kui ka TRAIL retseptoreid, kuid on resistentsed TRAIL-18

vahendatud tsütotoksilisusele. TRAIL apoptootilise efekti eest kaitseb NK ja T rakke c-FLIPvalgu ekspressioon, mis on põhiline TRAIL ja teiste surma ligandide põhjustatud raku surmaregulaator.1.3.3 Tsütokiinide sekretsioonPeale aktivatsiooni võivad NK rakud sekreteerida mitmeid efektortsütokiine, nagu IFN-γ,ja TNF-α, ning kemokiine, mis võivad otseselt mõjutada kasvajate arenemist, indutseeridapõletikulist või viirusevastast vastust, reguleerida hematopoeetiliste rakkude diferentseerumist jaaktiveerida adaptiivse immuunvastuse jaoks tähtsaid immuunefektorrakke. Kasvajavastaseimmuunsuse kontekstis on nendest tsütokiinidest enim uuritud IFN-γ (Street, Cretney et al. 2001;Ikeda, Old et al. 2002), mis lisaks tähtsale rollile kaasasündinud ja adaptiivse immuunsuseregulatsioonis võib otseselt mõjutada kasvajarakke, vähendades nende proliferatsiooni jametaboolset aktiivsust ning inhibeerides angiogineesi CXC kemokiinide (näiteks interferoonindutseeritavavalgu IP-10) ja monokiinide indutseerimise kaudu. IFN-γ osaleb samuti surmaretseptori vahendatud tapmismehhanismi regulatsioonis, surudes maha anti-apoptootilisi valke(Irmler, Thome et al. 1997) või aktiveerides surmaretseptori vahendatud apoptoosis olulistekaspaaside ekspressiooni (Griffith, Chin et al. 1998). Teiste tsütokiinide funktsioone kasvajatekontrollis on uuritud vähem.1.3.4 Antikehast sõltuv rakuline tsütotoksilisusSarnaselt granulotsüütidele võivad NK rakud tappa antikehadega kaetud rakke antikehastsõltuva rakulise tsütotoksilisuse mehhanismi abil (ADCC, antibody dependent cellularcytotoxicity). NK raku pinnaretseptor CD16 (madala afiinsusega immunoglobuliin G retseptor,FcγRIII) seondub raku pinnal oleva antikeha Fc osaga, põhjustades retseptoriga seotud FcγRI jaTCR-ζ adaptorvalkude ITAM fosforüleerimist, mis käivitab aktivatsioonisignaalide kaskaadi.Selle tulemusena aktiveerub NK rakkude tsütokiinide tootmine ja tsütotoksiliste graanulitevabastamine, mis põhjustavad märklaudraku apoptoosi (Buentke, Heffler et al. 2002). Sellinemehhanism on oluline kasvajate ravil antikehadega ning samuti kaasasündinud ja adaptiivseimmuunvastuse regulatsioonis (Cerwenka and Lanier 2001).19

1.4 NK rakkude kliiniline kasutamine1.4.1 NK rakkude roll vereloome tüvirakkude transplantatsioonisHematopoeetiliste tüvirakkude transplantatsiooni kasutatakse verehaiguste ravil.Allogeense transplantatsiooni korral kantakse patsiendile üle HLA tüübilt sobiva inimesetüvirakke. Leukeemia korral soodustavad transplantaadis olevad doonori T-rakud selleimplanteerumist, hävitavad leukeemilisi rakke ja taastavad immuunsust (Kolb, Schmid et al.2004). Kahjuks põhjustavad T rakud transplantaat-peremehe-vastu haigust (GvHD, graft-versushostdisease). GvHD korral ründavad doonori tsütotoksilised CD8 + efektor T rakud näiteksretsipiendi nahka, soolestikku ja maksa. GvHD on oluline allogeense transplantatsiooni järgsesuremuse põhjustaja.GvHD ja selle vältimiseks kasutatav immunosuppressioon on peamine transplantatsiooniebaõnnestumise põhjus, mis soodustab infektisoone ja neoplastilise retsidiivi tekkimist. GvHD jaäratõuke riskide vähendamiseks on oluline doonori ja retsipiendi HLA sobimine, kuid sobilikkedoonoreid leidub ainult 60% patsientidest. Transplantatsiooni saab teha veelgi vähematele, sestdoonori otsimine ja luuüdi kogumine võtavad aega. Teoreetiliselt, on igal patsiendil olemaspereliige, kes on temaga identne ühe HLA haplotüübi poolest ja täiesti sobimatu teise HLAhaplotüübi poolest (ehk “haploidentne”) ning kes võib olla doonoriks. Allogeensehematopoeetilise transplantatsiooni tingimustes on oluline tähtsus ka alloreaktiivsetel NKrakkudel: puutudes kokku sobimatute allogeensete märklaudrakkudega tunnevad nad ära eneseMHC I molekulide puudumise ja vahendavad alloreaktsioone. Inimesel saavad NK rakkudealloreaktsioonid toimuda tänu KIR molekulide HLA spetsiifilisusele. KIR2DL1 on HLA-C grupp2 alleelide retseptor, KIR2DL2/3 retseptorid on spetsiifilised HLA-C grupp 1 alleelidele jaKIR3DL1 on HLA-Bw4 alleelide retseptor. NK rakkude alloreaktsioonid tekkivad indiviididevahel, kes on sobimatud HLA-C ja/või HLA-Bw4 grupi poolest. Näiteks, inimene, kesekspresseerib grupp 2 HLA-C alleele ja omab NK rakke, mis ekspresseerivad grupp 2 HLA-Calleelide jaoks spetsiifilisi KIR molekule (KIR2DL1) on alloreaktiivsed sellise inimese rakkudevastu, kes ei ekspresseeri grupp 2 HLA-C alleele olles homosügootne grupp 1 HLA-C alleelidesuhtes.NK rakkude rolli transplantatsioonides täheldati esmakordselt transplantatsioonihübriidresistentsuse hiiremudeli analüüsil (Cudkowicz and Bennett 1971) (Yu, George et al.1996). Need eksperimendid on näidanud, et NK rakkude alloreaktsioonid peremees-20

transplantaadi-vastu suunas põhjustavad äratõuget ja on olulised allogeensete rakkudeäratundmisel in vivo. See mudel on ka näidanud, et NK alloreaktiivsus avaldub ainultlümfohematopoeetiliste märklaudrakkude vastu (hübriidsetel retsipienthiirtel ei toimunud naha jaorganite äratõuget). NK rakkude vahendatud transplantatsiooni hübriidresistentsust põhjustab NKrakkude aktivatsioon puuduvate immunoloogiliste enese-markerite tõttu.In vivo NK alloreaktiivsusest lähtudes püstitati hüpotees, et selline nähtus esineb kavastupidises suunas (transplantaat-peremehe-vastu) ning võib avaldada transplantaat-leukeemiavastuefekti (Ruggeri, Capanni et al. 2002), (Karre 2002). Oluliseks alloreaktiivsete NK rakkudeomaduseks transplantatsiooni tingimustes on nende võime tappa retsipiendi dendriitrakke, misalgatavad T-rakkude vahendatud transplantaat-peremehe-vastu haigust, presenteerides retsipiendiantigeene doonori T rakkudele (Shlomchik, Couzens et al. 1999). Seega takistabprekonditsioneerimise osana tehtud doonor-versus-retsipient alloreaktiivsete NK rakkudeinfusioon T-rakkude vahendatud GvHD (Ruggeri, Capanni et al. 2002), mis võimaldab siirata Trakke sisaldavaid muidu sobimatuid luuüdi transplantaate.In vitro uuringud inimese rakkudega näitavad, et alloreaktiivsed NK rakud tapavadakuutse müeloidse leukeemia ja kroonilise müeloidse leukeemia rakke (Ruggeri, Capanni et al.1999). NK rakkude alloreaktiivsus on tuvastatud ka primaarse lümfohematopoeetilise liinikasvajarakkude vastu (Caligiuri, Velardi et al. 2004).Haploidentsed hematopoeetilised transplantatsioonid potentsiaalse NK vahendatudtransplantaat-peremehe-vastu aktiivsusega on läbi viidud ka kliinilisel tasemel. Tulemusednäitavad, et implanteerunud tüvirakkudest kasvab välja doonori päritoluga NK rakkudepopulatsioon, mis regenereerib sama repertuaari, mis doonor, kaasa arvatud doonor-versusretsipientalloreaktiivsed rakud (Ruggeri, Capanni et al. 1999). Samuti on näidatud, et NKalloreaktiivsed transplantaadid soodustavad implanteerumist, kaitsevad GvHD vastu, kontrollivadleukeemia retsidiivi ja parandavad haigusevaba elulemust (Caligiuri, Velardi et al. 2004).1.4.2 NK rakkude kasutamine vähivastases immunoteraapiasIL-2 aktiveeritud NK rakkudel põhinevat teraapiat testiti esmakordselt kompaktseteprimaarsete või metastaseeruvate kasvajatega patsientidel varajastel 1980-ndatel (Rosenberg,Lotze et al. 1993). NK rakke stimuleerivate IL-2 dooside injektsioonid või preaktiveeritud NKrakkude infusioonid (adoptiivne lümfokiin-aktiveeritud tapjarakkude ülekanne) andsid 15-30 %positiivset efekti arenenud neerurakkude kartsinoomi või melanoomiga patsientidel (Rosenberg,21

Lotze et al. 1993). Nende vähkkasvajate tundlikkus TNF ligandide kaudu indutseeritudapoptoosile on siiski varieeruv ning neeruvähi rakkude kliirens hiire mudeli korral sageli isegi eivajanud perforiin-vahendatud rada (Seki, Brooks et al. 2002). Seega osalevad IL-2 ravimisejärgses vähivastases vastuses ka NK rakkude (ning T rakkude) loomulike tappurrakkuderetseptoritest sõltumatud tsütotoksilisuse rajad. Kahjuks on IL-2 kasutamine seotud eluohtlikutoksilisusega, mille põhjuseks on kapillaaride lekkimise sündroom (Fehniger, Cooper et al. 2002).NK rakkude vahendatud ADCC-d kasvajarakkude vastu on võimalik esile kutsudakasvajaga seotud antigeenide monoklonaalsete antikehadega (Caligiuri, Velardi et al. 2004).Vaatamata tõelise spetsiifilisuse puudumisele ja piiratud efektiivsusele on sellel meetodilunikaalne toimemehhanism, mis ei põhjusta rist-resistentsust (cross-resistance) või kattuvattoksilisust konventsionaalsete ravimitega (Caligiuri, Velardi et al. 2004) ning on seetõttukombineeritav tsütokiinidel põhinevate immunoteraapiatega. NK rakkude vastust ravilemonoklonaalsete antikehadega suurendavad mõned tsütokiinid (Fehniger, Cooper et al. 2002).Kõrge tsütokiinide doosi manustamisest tingitud kõrvaltoimete vähendamiseks on püütudkasutada tsütokiinide juhtimiseks kasvajarakkudesse rekombinantseid liitvalke kasvajaspetsiifilisteantikehadega (Fehniger, Cooper et al. 2002). Alternatiivselt võib NK rakkeaktiveerida TLR3 ja TLR9 otsese aktiveerimisega (Sivori, Carlomagno et al. 2006). Selleks onvälja töötatud ja testitud sünteetilised molekulid, mis võivad mimikeerida viiruseliste võibakteriaalsete produktide immunostimulatoorset aktiivsust toll-like retseptori kaudu (Sivori,Carlomagno et al. 2006).Kuigi NK rakkude kasvajavastane efektiivsus on ilmnenud väga paljudes in vitro ja in vivoloomamudelites, on aktiveeritud NK rakkude teraapia osutunud efektiivseks ainult vähesteljuhtudel (Zamai, Ponti et al. 2007). Seda põhjustab tõenäoliselt kasvajate “pääsemine” NKrakkude funktsiooni muutmise tõttu ja kasvaja lüüsumis-resistentsus, mis on seotud kasvajaprogressiooni ja kroonilise põletikuga. Oluline on nentida, et enamik NK rakkudel põhinevatestimmunoteraapia katsetest tehti kaugele arenenud kasvajatega patsientidel, kes ei saanud enam abikonventsionaalsest teraapiast.Edukamateks immunoteraapia strateegiateks on osutunud sellised meetodid, miskasutavad allogeenseid NK rakke KIR ja MHC I ligandide mittesobivusega doonoritelt. Edukaravitulemuse saamiseks oli vajalik ka kõrgdoosi kemoteraapia, mis põhjustas ülekantud NKrakkude in vivo ekspansiooni IL-15 taseme suurenemise kaudu (Miller, Soignier et al. 2005).22

Seega võib järeldada, et NK rakkude immunoteraapias on õigustatud suuremate rakudoosidekasutamine.1.5 NK rakkude in vitro ekspansioon perifeersetest vererakkudestNK rakkude in vitro ekspansiooniks kasutatakse enamasti perifeerseid vererakke seoseskerge kättesaadavusega. NK rakkude ekspansiooniks kultiveeritakse kas kõiki perifeerse veremononukleaarseid rakke või ainult eraldatud puhtaid NK rakke. NK rakkude ekspandeerimisekslümfotsüütide kultuuris aktiveeritakse neid kas tsütokiinide abil, kasvatatakse koos feederrakuliinidega(nagu näiteks K562, HFWT, LCL, RPMI 8866) või kasutatakse kiiritatudautoloogseid või allogeenseid perifeerse vere mononukleaarseid rakke. Perussia ja Silva(Perussia, Ramoni et al. 1987) uuringud on näidanud, et inimese NK rakkude ekspansiooniks onkasulikud ka B lümfoblastid ja leukafereesi teel saadud perifeerse vere tüvirakud. Sekine jt.(Sekine, Shiraiwa et al. 1993) on välja töötanud alternatiivse meetodi lümfotsüütideekspansiooniks perifeersest verest: rakke kultiveeritakse IL-2 ja immobiliseeritud anti-CD3monoklonaalsete antikehade juuresolekul. Igarashi jt. (Igarashi, Wynberg et al. 2004) on samutinäidanud magnet-separatsiooni abil perifeerse vere mononukleaarsetest rakkudest isoleeritud NKrakkude ekspansiooni kultiveerides neid koos feeder-rakkudega või ilma. 14 päeva jooksulekspandeerusid NK rakud 100 korda ilma feeder-rakkudeta, ning 1000 korda koos feederrakkudega.Tervete doonorite perifeerse vere mononukleaarseid rakke on kasvatatud ka koosWilms`i tuumoril põhineva rakuliiniga HFWT 10-21 päeva jooksul, saades 58-401 kordselümfotsüütide ekspansiooni. Selline NK ekspansiooni meetod vajab otsest kontakti lümfotsüütideja elusate fikseerimata HFWT rakkude vahel. Harada jt. (Harada, Saijo et al. 2002) on samutiseda meetodit kasutanud. Neil moodustasid CD16+CD56+ NK rakud 70% ekspandeerunudrakkude populatsioonist. Samadel feeder-rakkudel kasvatati hepatotsellulaarse kartsinoomipatsientide perifeerse vere mononukleaarseid rakke saades 50% CD56+CD16+ NK rakkekultuurist (Peng, Liang et al. 2004).NK rakkude ekspansiooniks on kasutatud peale Wilms`i tuumori rakke ka K562 rakuliini,mis andis 2,5 kordse ekspansiooni. Kui feeder-rakkudena kasutati aga 4-1BBL+mIL-15 (4-1BBligand ja membraanseoseline IL-15) transfekteeritud K562 rakuliini, siis saadi 14-päevaseinkubatsiooni tulemusena keskmiselt 10000-kordne NK rakkude ekspansioon (Imai, Iwamoto etal. 2005). NK rakkude ekspansioon saavutati ka akuutse lümfoblastilise leukeemia patsientidevererakkudest, kui neid kasvatati kas kiiritatud allogeensete perifeerse vere mononukleaarsete23

akkude või RPMI 8866 rakuliini juuresolekul. Peale 12-päevast kasvatust ekspandeerusid NKrakud 40 korda (Torelli, Guarini et al. 2002).Perez jt. (Perez, Mahaira et al. 2005) on samuti näidanud NK rakkude ekspandeerumistdoonori perifeerse vere mononukleaarsetest rakkudest, mis olid kasvatatud hüdrokortisooni, IL-2ja IL-15 juuresolekul. Sellistel tingimustel saadi 100-kordne NK rakkude ekspansioon.Lähtuvalt sellest, et feeder-rakuliinide ja veiseseerumi kasutamisega võib kaasnedakontaminatsiooni ja immuundüsregulatsiooni oht, ei sobi need kasvatusmeetodidimmunoteraapiaks.Carlens jt. (Carlens, Gilljam et al. 2001) avastasid NK rakkude ekspansiooni meetodi, misvõimaldas saada keskmiselt 193-kordset NK rakkude ekspansiooni ning on sobilik kliinilisekskasutamiseks. Selle meetodi järgi kasvatatakse perifeerse vere mononukleaarseid rakke CellGrotüvirakkude söötmes 5% inimese seerumi ja IL-2 (500 U/ml) ning antikeha OKT-3 (10 ng/ml)juuresolekul.1.6 Häired NK rakkude tsütotoksilises aktiivsusesNK rakkude aktiivsuse häired jaotatakse madala või liiga kõrge NK aktiivsusegaseisunditeks. Mõlemas kategoorias võivad need anomaaliad olla kas ajutised (näiteks seotudfüüsilise treeningu, stressiolukordade, külmetuse ja tõsisemate viirusinfektsioonidega) võipüsivad. Krooniliselt madal NK aktiivsus esineb näiteks suurte tuumorite või metastaaside,erinevate immuunpuudulikkussündroomide, ägedate eluohtlike viirusinfektsioonide,autoimmuunhaiguste ja käitumishäirete korral (Whiteside and Herberman 1994). Lisaks võibmadal NK aktiivsus olla riskifaktoriks pahaloomuliste kasvajate tekkeks ning ka prognostiliseksväärtuseks retsidiivi tekke, ravile alluvuse ja metastaasidest vaba elulemuse aja ennustamiseksvähihaigetel patsiendidel (Whiteside and Herberman 1994). Reeglina esineb madala NKaktiivsusega patsientidel kõrgem infektsioonide risk, pikem haiguse kestvus või ägedamadsümptomid võrreldes normaalse NK aktiivsusega patsientidega. Krooniliselt kõrge NK rakkudeaktiivsus on seotud näiteks lümfoproliferatiivsete sündroomide (sealhulgas agressiivnesuurerakuline lümfotsütaarne leukeemia) ja mõnede maksa häiretega (Whiteside and Herberman1994).. NK rakkude madala aktiivsuse põhjuseks võivad olla perekondlikult päranduvadhemofagotsütaarsed lümfohistiotsütoosid (FHL1-FHL4), kus mutatsioonid asetsevad perforiiniPRF1 (FHL2) (Dufourcq-Lagelouse, Pastural et al. 1999), munc13-4 (FHL3) (Feldmann,24

Callebaut et al. 2003) või syntaxin-11 (FHL4) (zur Stadt, Schmidt et al. 2005) geenides. FHL1-gaseotud geeni ei ole kindlaks tehtud, kuid selle asukoht on kaardistatud 9q22kromosoomipiirkonda (Ohadi, Lalloz et al. 1999). Ka Chediak-Higashi sündroom, mis on seotudgeeniga CHS1/LYST (Karim, Nagle et al. 1997) ja Griscelli sündroom, mis on seotud geenigaRab27a (Rath, Jain et al. 2004), avalduvad muu hulgas NK rakkude lüütilise aktiivsusepuudumise ja T-rakkude ning monotsüütide kontrollimatu aktiviseerumise näol. X-liitelinelümfoproliferatiivne haigus (geen SH2D1A/SAP), mis avaldub ülirasketes herpesviirusteinfektsioonides (põhiliselt Epstein-Barr`i viirus) on seotud 2B4 retseptori signaaliülekanderegulatsiooni häirega (Nakajima, Cella et al. 2000). Eelpool mainitud geneetilised haigused onsiiski üsna haruldased.Kliinilises kasutamises on oluline ka doonorilt eraldatud NK rakkude säilitamine kunipatsiendile üle kandmiseni. In vitro uuringud on viidanud aga võimalusele, et NK rakkudeproliferatsiooni aktiivsus väheneb temperatuuril -150°C aja jooksul (Orlova 2007).1.7 NK rakkude tsütotoksilise aktiivsuse mõõtmineLisaks sellele, et NK rakkude aktiivsuse mõõtmist saab kasutada diagnostikas, on seevajalik ka NK rakkude kasutamisel immunoteraapiaks ja transplantatsiooni eelselt selgitamaksdoonori ja retsipiendi rakkude omavahelist reaktiivsust.Alates 1968 aastast (Brunner, Mauel et al. 1968) kasutataske traditsiooniliseltefektorrakkude tsütotoksilise aktiivsuse mõõtmiseks radioaktiivse kroomi ( 51 Cr) vabastamisemeetodit (CRA, 51 Chromium-release assay) (Roder, Haliotis et al. 1980) (Morales and Ottenhof1983). Selle meetodi järgi inkubeeritakse märklaudrakke Na 51 2 CrO 4 lahuses, mis difundeerubpassiivselt rakku ja seondub seal intratsellulaarsete valkudega. 51 Cr märgistatud märklaudrakkeinkubeeritakse 4-16 tundi koos efektorrakkudega ning seejärel määratakse lüüsitud rakkudestvabanenud 51 Cr hulk supernatandis beeta või gamma loenduriga. Vabanenud 51 Cr hulk onproportsionaalne tapetud märklaudrakkude arvuga. Oluline on, et lüüsitud märklaudrakkudestvabanenud 51 Cr ei inkorporeeru tagasi lümfotsüütidesse või tapmata märklaudrakkudesse, mislihtsustab tulemuste analüüsi. Antud meetod on hästi reprodutseeritav ja usaldusväärne ning onseetõttu muutunud tsütotoksilisuse mõõtmise „kuldseks standardiks”. Siiski on CRA-l kajärgnevad puudused:1) radioaktiivsusega kaasnevad terviseriskid ning suured rahalised kulud, sest 51 Cr on lühikesepoolestusajaga ning vajab pidevat asendamist uuega25

2) saab kasutada ainult selliste märklaudrakkude märgistamiseks, mis spontaanselt seovad lüüsidetekteerimiseks piisaval kogusel 51 Cr3) CRA tundlikkus sõltub taustast ehk elusatest rakkudest vabanenud 51 Cr kogusest analüüsi ajal– analüüs ei ole interpreteeritav, kui spontaanne 51 Cr vabanemine on liiga kõrge4) CRA tulemuste analüüsisisene varieeruvus on suhteliselt suur5) CRA funktsionaalsed piirangud seisnevad selles, et tulemused on üheparameetrilised, suremustei saa kvantitatiivselt hinnata ühe raku tasemel ning sagedad on ka probleemid erinevatemärklaudrakkude liinide märgistamisega (Kim, Donnenberg et al. 2007).Tsütotoksilise aktiivsuse mõõtmiseks on kasutatud ka meetodeid, mis põhinevadmärklaudrakkude DNA radioaktiivsel märgistamisel isotoopidega H 3 (Jagarlamoody, Aust et al.1971) või I 125 (Cohen, Burdick et al. 1971). I 125 märgistatud DNA vabaneminemärklaudrakkudest võimaldab hinnata tsütotoksilisust. Hiljem on siiski täheldatud, et teatudtingimustes ei korreleeru radioaktiivse märgisega DNA vabanemine CRA analüüsi tulemustega(Munger, Berrebi et al. 1988).Lähtudes radioaktiivsete meetodite puudustest, hakati arendama teisi, mitteradioaktiivsetekomponentide vabanemisel põhinevaid meetodeid. Aja jooksul on ilmunud erinevaidfluorimeetrial ja vabanenud intratsellulaarsete ensüümide detekteerimisel põhinevaidtsütotoksilisuse hindamise meetodeid.Kõige levimumad on meetodid, mis põhinevad rakkude loomulike endogeenseteensüümide – näiteks happelise (Martin and Clynes 1991) või aluselise fosfataasi (Szekeres, Pacsaet al. 1981), laktaadi dehüdrogenaasi (Decker and Lohmann-Matthes 1988), adenülaadi kinaasi(Niles, Moravec et al. 2007) või glükoos-6-fosfaadi dehüdrogenaasi (Batchelor and Zhou 2004)aktiivsuse mõõtmsiel. Näiteks laktaadi dehüdrogenaasi meetodi aluseks on järgmine põhimõte:lüüsitud rakkudest vabanenud laktaadi dehüdrogenaas osaleb reaktsioonides, mis põhjustavadkollase tetrazoliumsoola muutumist formazaani klassi kuuluvaks fluorestseeruvaks punaseksvärviks. Formazaani hulk on proportsionaalne laktaadi dehüdrogenaasi hulgale, mis omakorda onseotud surnud või kahjustatud rakkude hulgaga. Selle meetodi puuduseks on märkimisväärnelaktaadi dehüdrogenaasi taustaktiivsus enamikes seerumit sisaldavates rakusöötmetes (Batchelorand Zhou 2004).Üldiselt on ensüümidel põhinevate meetodite kasutamine piiratud, sest nende hulkerinevates rakuliinides on varieeruv ning aktiivsuse hindamine keeruline ja töömahukas. Sellisedmeetodid võimaldavad hinnata ravimite tsütotoksilisi omadusi, kuid pole kohandatud26

efektorrakkude funktsiooni hindamiseks. Oluliseks puuduseks on, et neid endogeenseid ensüümeekspresseerivad ka efektorrakud, põhjustades sageli kõrgeid taustväärtusi (Bachy, Bonnin-Rivalland et al. 1999). Probleemi lahendamiseks pandi modifitseeritud märklaudrakudekspresseerima unikaalseid efektorrakkudes puuduvaid ensüüme. Bachy jt. (Bachy, Bonnin-Rivalland et al. 1999) töötasid välja tsütotoksiliste T lümfotsüütide aktiivsuse hindamiseks β-galaktosidaasi vabanemise meetodi, nakatades erinevaid märklaudrakuliine rekombinantseEscherichia coli β-galaktosidaasi sisaldava vaktsiinia viirusega. Lüüsitud rakkudest vabanenudensüümi aktiivsust mõõdeti kemiluministsentse substraadi abil ning vastavalt sellele määrati kalüüsitud rakkude hulk.Tsütolüüsi saab määrata ka surnud märklaudrakkudest vabanenud fluorestseeruvatevärvide alusel, mida mõõdetakse fluorimeetri abil. Fluorestseeruvate värvidena kasutataksenäiteks MTT [3-(4,5-dimetüültiazool-2-üül)-2,5-difenüültetrazoolium bromiidi] (Hussain, Nouriet al. 1993), MUH (4-metüülumbelliferüül heptanoaati), Alamar sinist (Nociari, Shalev et al.1998), CFDA (karboksüfluorestseiin diatsetaati) (Bruning, Kardol et al. 1980), BCECF (2',7'-biskarboksüetüül-karboksüfluorestseiini)(Kolber, Quinones et al. 1988), Hoechst 33342 (Brenanand Parish 1988), lantaniide (Blomberg 1994), calcein AM (Iwanowicz, Densmore et al. 2004).Üldiselt sarnanevad sellised meetodid 51 Cr vabanemise meetodile, kuid neid saab kasutadarohkemate märklaudrakuliinide märgistamiseks. Lisaks sellele vabaneb fluorestseeruv värv rakustkiiremini, kui valkudega seondunud 51 Cr. Nende meetodite piiranguks on spontaanne värvivabanemine, mis võib olla küllaltki intensiivne, seega on nad kasutatavad ainult lühiajalisteanalüüside jaoks. Samuti on need väga tundlikud reaktsiooni mahu kõikumise suhtes ningmiinuseks on ka fluorestseeruva signaali madal intensiivsus, mis vähendab analüüsi tundlikkust.Voolutsütomeetrial põhinevad meetodid on välja töötatud alternatiivina 51 Cr vabastamiseanalüüsile. Need võimaldasid osaliselt vältida selle meetodi kasutamisel tekkivaid probleemening läbi viia analüüsi üksiku raku tasemel. Voolutsütomeetriliste meetodite aluseks on efektorjamärklaudrakkude eristamine. Esialgu prooviti eristada efektor ja märklaudrakke nendeerinevate valguse hajumise omaduste põhjal (Vitale, Neri et al. 1989), kuid see osutusproblemaatiliseks ja ebatäpseks. Selle asemel võeti kasutusele kahevärvilise voolutsütomeetriameetodid, mis põhinevad märklaudrakkude värvimisel erinevate markeritega, nagu näiteks CFDA(karboksüfluorestseiin diatsetaat) (McGinnes, Chapman et al. 1986), [DiO 18 (3)] (3,3′dioktadetsüüloksakarbotsüaniin perkloraat) (Chang, Gusewitch et al. 1993), PKH2 (roheliseltfluorestseeruv Cell Linker) (Flieger, Gruber et al. 1995), fluorestseiin isotiotsüanaat (Karawajew,27

Jung et al. 1994), või calcein AM (Papadopoulos, Dedoussis et al. 1994). Peale inkubatsiooniefektorrakkudega lisatakse rakkudele DNA-ga seonduvaid värve, näiteks propiidium jodiidi(Papa, Vitale et al. 1988), mille abil märgistatakse permeabiliseeritud membraanigamärklaudrakke, või anneksiin V (Shounan, Feng et al. 1998), mis märgistab varajaseidapoptootilisi rakke.Käesolevas töös kasutati Lecoeur jt. (Lecoeur, Fevrier et al. 2001) kirjeldatud meetodit,mille järgi värvitakse märklaudrakke roheliselt fluorestseeruva karboksüfluorestsiinsuktsiinimidüülestriga (CFSE, carboxyfluoroscein succinimidyl ester) ning surnud rakkudeeristamiseks elusatest kasutatakse 7-aminoaktinomütsiini D (7-AAD).CFSE on värvitu ja mittefluorestseeruv molekul, mis difundeerub rakku passiivselt. Rakusolevad esteraasid lõikavad CFSE molekuli atsetaatrühmi, mille tulemusena moodustubintensiivse fluorestsentsiga (emissiooni maksimum 518 nm juures) membraani mitteläbivmolekul, mis ei takista raku normaalset funktsioneerimist. Suktsiinimidüülestri rühm reageeribintratsellulaarsete amiinidega, moodustades fluorestseeruvaid konjugaate, mis jäävad püsimaraku tsütoplasmasse – seega puudub värvi lekkimise ja naaberrakkude värvimise oht. NK rakkudepoolt lüüsitud märklaudrakkude hulga määramiseks värvitakse rakke peale ko-inkubatsiooniefektorrakkudega punaselt fluorestseeruva 7-AAD-ga (emissiooni maksimum 647 nm juures). 7-AAD on DNA värv mis interkaleerub DNA kaksikahelaga ja omab kõrget affiinsust GCregioonide suhtes. 7-AAD ei läbi intaktset elusa raku membraani ning värvib seega ainult surnudrakke, mille membraan on permeabiliseeritud.CFSE-põhine tsütotoksilise aktiivsuse analüüsi meetod on kiire, lihtne ja usaldusväärne(Lecoeur, Fevrier et al. 2001). Võrreldes klassikalise radioaktiivse kroomi vabastamise meetodigaomab see praktilisi ja teaduslikke eeliseid mitmel põhjusel:1) Kasutatakse mitteradioaktiivseid markereid, mis ei vaja erilisi käsitlemistingimusi.2) CFSE on „universaalne marker“, millega on võimalik värvida kõiki märklaudrakke- seegakaob vajadus spetsiifiliste monoklonaalsete antikehade järele, mida kasutatakse teistevoolutsütomeetria analüüsi meetodites (Goldberg, Sherwood et al. 1999).3) Analüüsis kasutatud kontsentratsioonis on CFSE mittetoksiline.4) CFSE seondumine on stabiilne ja seda saab kasutada pikaajaliste tsütotoksilisuse analüüsidejaoks.5) 7-AAD värvimine rakkude lüüsi kvantitatiivseks analüüsiks on hästi reprodutseeritav jausaldusväärne.28

6) Erinevalt teistes analüüsi meetodites kasutatavatest DiO 18 või annexin V on 7-AAD-gavärvimine resistentne fikseerimise ja permeabiliseerimise protseduurdele (kui tahetakse teha kamärklaudrakkude intratsellulaarset värvimist) (Lecoeur, Ledru et al. 1998).Erinevalt 51 Cr vabastamise analüüsist põhineb CFSE/7AAD meetod üksikute rakkudeanalüüsimisel, mis võimaldab hinnata samaaegselt rakkude suremust ja immunofenotüpiseeridaefektorrakke.Antud meetod on tundlikum kui 51 Cr vabastamise meetod, eriti madalate efektor/märklaudsuhete korral, tõenäoliselt sellepärast, et 7-AAD värvib ka varajases apoptoosi staadiumis olevaidväheste membraani muutustega rakke, mis ei vabasta kroomi (Schmid, Uittenbogaart et al. 1994).Kuid kõrgete efektor-/märklaudrakkude suhete korral, kui enamik märklaudrakke on lüüsitud,võib tekkida olukord, kus tulemuste analüüsil satuvad väikesed apoptootilised kehakesed rakkudepiirkonnast välja, mis põhjustab märklaudrakkude hulga alahindamist. Kroomi vabastamisemeetodil sellist puudust pole, sest see on kumulatiivne.Samuti võimaldab tsütomeetriline meetod lisaks tsütotoksilisuse mõõtmisele samaaegseltdefineerida efektorrakkude fenotüüpi ning analüüsida nende omavahelisi seoseid.29

2. MATERJAL JA METOODIKA2.1 NK rakkude kogumineTöös kasutatud lümfotsüüdid pärinevad Utrechti Ülikooli haiglast ja Tartu ÜlikooliHematoloogia ja Onkoloogia Kliiniku Hematoloogia ja Luuüdi Transplantatsiooni osakonnast.Utrechti Ülikooli haigla rakud saadi kahekümne kaheksa terve omavahel suguluses mitte olevadoonori perifeersest verest. Eelnevalt oli doonor informeeritud vastavalt Utrechti Ülikoolieetikakomisjoni nõuetele. Tartu Ülikooli Kliinikumi rakud olid saadud ühe terve doonoriperifeersest verest vastavalt Tartu Ülikooli Inimuuringute Eetika Komiteelt saadud nõusolekule(151/101; 21.08.2006).Utrechti Ülikooli doonorite HLA-A, -B ja -C tüpiseerimise andmed saadi sekveneerimiseabil, kasutades SBTexcellator kiti koos SBTengine tarkvaraga (Genome Diagnostics, Utrecht,Holland). HLA-C epitoobi analüüs tehti Q-PCR analüüsi abil. KIR genotüübid olid määratud SSP(Sequence Specific Priming) analüüsi abil. Doonorite HLA ja KIR andmed on esitatud tabelis 1.Tartu Ülikooli doonori kohta ei ole HLA ja KIR tüpiseerimise andmeid veel teada.2.1.1 LümfopreparatsioonKõikide doonorite perifeerse vere mononukleaarsed rakud eraldati täisverestgradienttsentrifuugimisega lümfopreparatsioonil Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences)kiti abil. Täisveri (25 ml) segati võrdses mahus DPBS-ga (Invitrogen, Gibco, Grand Island, NY,USA). Lahjendatud veri (50 ml) lisati ettevaatlikult kahte 15 ml tuubi Ficoll-Paque kihile vältidessegunemist. Peale tsentrifuugimist (400×g, 30 minutit, 18°C) aspireeriti ettevaatlikultmoodustunud lümfotsüütide kiht seroloogilise pipetiga. Seejärel pesti rakke kaks korda DPBS-gaja külmutati krüoviaalides 10-20×10 6 kaupa.30

Tabel 1. Doonorite KIR ja HLA repertuaar.Tulpades 2-14 on toodud doonorite andmed erinevate inhibiitor- (KIR-L) või aktivatsiooni- (KIR-S) retseptoreid kodeerivate KIR geenidekohta. Vastava KIR geeni olemasolu doonoril on tähistatud halli lahtrina. Seonduv alleel – näitab KIR molekuliga seonduva alleeli olemasolu(+) või puudumist (-). ? – KIR geeni ei ole määratud. HLA-C epitoobi grupp on näidatud HLA-C kõrge resolutsiooniga tüpiseerimise tulemustetulba kõrval. He= heterosügoot, Ho gr 1= homosügoot grupp 1, Ho gr 2= homosügoot grupp 2. amb – ambivalentne. Seonduv alleel – näitabKIR molekuliga seonduva alleeli olemasolu (+) või puudumist (-).

2.2.2 KrüopreservatsioonUtrechti Ülikooli haiglas eraldatud lümfotsüüdid külmutati vitaalselt: 0,5 ml RPMI 1640söötmes (25mM HEPES ja l-glutamiin sisaldusega) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 0,01%penitsilliin/streptomütsiini manulusel, üles võetud rakkudekle lisati vahetult enne külmutamist0,5 ml segu, mis koosnes RPMI 1640 söötmest, 40% termotöödeldud (56°C, 1 tund)vasikaseerumist (Invitrogen, Gibco, Grand Island, NY, USA) ja 20% dimetüülsulfoksiidist(AppliChem, Darmstadt, Saksamaa). Külmutatud rakke säilitati vedellämmastikus kunikasutamiseni.Tartu Ülikooli Hematoloogia ja Onkoloogia kliiniku rakud külmutati 0,5 ml 20% inimeseseerumi albumiinis (HSA; Octapharma, Wien, Austria), kuhu oli lisatud 0,5 ml 20%dimetüülsulfoksiidi sisaldusega 20%-list inimese seerumi albumiini. Rakke säilitati temperatuuril-150°C.2.2 Inimese seerumSöötmesse lisatav inimese seerum eraldati Tartu Ülikooli Kliinikumi Verekeskuseskogutud AB reesuspositiivse veregrupiga meessoost doonori verest. Vere hüübimiseks hoiti ilmaantikoagulandita kogutud täisverd 4 tundi temperatuuril 37°C. Seejärel hüübimata osa aspireeritija tsentrifuugiti (4000×g, 30 minutit, 4°C). Eraldatud seerum jagati 15 ml polüpropüleenisttuubidesse (BD labware Europe, Maylan Cedex, Prantsusmaa) 10 ml kaupa ja säilitatitemperatuuril -20°C. Enne kasutamist seerum sulatati ja säilitati temperatuuril 4°C.2.3 Kasutatud rakuliinidKäesolevas töös kasutati NK rakkude tsütotoksilise aktiivsuse testimiseks kuut erinevatrakuliini:1) K562 (HLA-C negatiivne) – inimese erütroleukeemia rakuliin, mis pärineb rakupangastAmerican Type Culture Collection2) Namalwa (HLA-C*07) – inimese lümfoblastoidne Epstein-Barr`i viirust kandevviiruspartikleid mitte tootev rakuliin, mis on saadud Burkitti lümfoomist (pärineb rakupangastAmerican Type Culture Collection)3) LCL 721.221-wt (HLA-C negatiivne) – inimese B-lümfoblastoidne rakuliin4) kolme erinevate HLA-C alleelelidega transfekteeritud LCL 721.221 rakuliini: LCL 721.221-Cw*0401 (IHW03096), 721.221-Cw*1202 (IHW03093) ja 721.221-Cw*1403 (IHW03094).

HLA Cw*0401 alleel kannab grupp 2 epitoopi ning HLA-Cw*1202 ja HLA-Cw*1403 alleelidelon grupp 1 epitoobid. LCL 721.221-wt ja transfekteeritud rakuliinid saadi Utrechti Ülikoolist.2.4 Doonorrakkude kultiveerimineKülmutatud lümfotsüüdid sulatati toatemperatuuril, pesti 10 ml DPBS-ga(dimetüülsulfoksiidi eemaldamiseks) ning tsentrifuugiti (400×g, 5 minutit). Seejärel pandi rakudkasvama 6 kaevuga koekultuuri plaadile (Falcon BD, Le Point De Claix, Prantsusmaa)tihedusega 1×10 6 rakku/ml. Söötmena kasutati CellGro SCGM (CellGenix GmbH, Freiburg,Saksamaa) kuhu lisati inimese seerumit (5% mahust), IL-2 (Proleukin, Chiron)lõppkontsentratsioonini 1000 Ü/ml ja OKT3 (hiire monoklonaalne inimese CD3 vastaneantikeha, ortokloon OKT3) (Ortho Biotech Inc, Raritan, NJ, USA) lõppkontsentratsioonini 10ng/ml (Carlens, Gilljam et al. 2001) modifitseeritud protokoll (Orlova 2007). Erinevalt Carlens jt.lisati antikeha OKT3 kogu kasvatuse vältel. Antibiootikume söötmesse ei lisatud.Lümfotsüüte kasvatati kultuuris tiheduse juures 1×10 6 rakku/ml 22 päeva, vahetadessöödet 1-2 päeva järel. Rakke inkubeeriti termokapis temperatuuril 37°C 5% CO 2 keskkonnas.2.5 Kasvajarakuliinide kultiveerimineKõik kasvaja rakuliinid kasvatati 50 ml koekultuuri pudelites (BD labware Europe,Maylan Cedex, Prantsusmaa) 5-6 ml RPMI 1640 söötmes (Invitrogen Gibco, Grand island, NY,USA) 10% vasika seerumiga (Invitrogen Gibco, Grand island, NY, USA) tiheduse juures250000-500000 rakku/ml, ning söödet vahetati iga kahe päeva järel. Rakke inkubeerititermokapis temperatuuril 37°C 5% CO 2 keskkonnas.2.6 Doonorrakkude immunofenotüpiseerimineKultuuris kasvavate NK rakkude ekspansiooni jälgimiseks fenotüpiseeriti doonorrakkekasvatuse jooksul vähemalt kolm korda (päevadel 0, 15 ja 21). Samuti fenotüpiseerititsütotoksilisuse aktiivsuse analüüsiks kasutatavaid doonorrakke, kasutades järgmisi antikehadekomplekte:Komplekt I- NKp46-APC, CD3-PerCP-Cy5.5, CD4-FITC, CD25-PE, CD19-APC-Cy7 ja CD33-PE-Cy7; NK rakud defineeriti kui NKp46 + CD3 - CD4 - CD19 - CD33 - .Komplekt II- CD56-PE, CD3-PerCP-Cy5.5, CD158a-FITC, NKG2D-APC, CD19-APC-Cy7 jaCD33-PE-Cy7; NK rakud defineeriti kui CD56 + CD3 - CD19 - CD33 - .33

Töös kasutatud antikehad olid ostetud BD Biosciences Pharmigen, San Jose, CA, USA.Ühe proovi jaoks võeti ligikaudu 100000 rakku, tsentrifuugiti eppendorfi põhja (500×g 5minutit), pesti kaks korda DPBS-ga, resuspendeeriti 20 µl 0,1% inimese albumiini sisaldusegaDPBS-s ning lisati 1µl igat antikeha. Seejärel segati proovid Vortex`il ning inkubeeriti jääl 20-30minutit. Seondumata antikehade eemaldamiseks pesti rakud kaks korda DPBS-ga, resuspendeeritiseejärel 50-100 µl DPBS-s ning hoiti enne analüüsimist jääl.2.7 Tsütotoksilisuse reaktsioonide ettevalmistusDoonori NK rakkude aktiivsust analüüsiti kuue kasvaja rakuliini vastu: K562, Namalwa,LCL 721.221- HLA negatiivse rakuliini ning kolme erineva HLA-C grupi alleeligatransfekteeritud LCL 721.221 rakuliini. Nende rakuliinide kasutamine võimaldas hinnata NKrakkude aktiivsuse sõltuvust nende KIR molekulidest ja märklaudrakkude pinnal olevatest MHCklass I ligandidest.Doonorrakkude (edaspidi efektorrakud) ja kasvajarakkude (edaspidi märklaudrakud) suhevarieerus vahemikus 12:1 kuni 0,5:1.Rakukultuuri plaadil olevad doonorrakudrakud suspendeeriti hoolikalt ning seejärel loetiBürkeri hematotsütomeetris (Brand GMBH, Wertheim, Saksamaa). Vajalik kogusrakususpensiooni (~ 4 miljonit rakku) koguti tuubi ja tsentrifuugiti põhja 500×g 5 minutit. Rakudresuspendeeriti RPMI 1640 söötmes tihedusega 1×10 6 /ml ning hoiti enne kasutamist jääl.Märklaudrakud suspendeeriti, loeti ning vajalik hulk (300000-400000 rakku) tõsteti tuubi.Peale tsentrifuugimist (500×g 5 minutit) resuspendeeriti rakud 1 ml RPMI 1640 söötmes.Märklaudrakkude värvimiseks kasutati CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit (MolecularProbes, Leiden, Holland). RPMI 1640 söötmes resuspendeeritud rakkudele lisati CFSE lahustlõppkontsentratsioonini 1 µM ning inkubeeriti temperatuuril 37°C 15 minutit. Seejäreltsentrifuugiti rakud põhja (500×g 5 minutit) ning seondumata CFSE eemaldamiseks pesti kakskorda RPMI 1640 söötmes, misjärel tsentrifuugiti rakud uuesti põhja ja resuspendeeriti RPMI1640 söötmes tihedusega 1×10 6 /ml. Proove hoiti enne kasutamist jääl.Tsütotoksilisuse reaktsioonid segati kokku 96 kaevuga V-kujulise põhja ristlõikegamikrotiiter plaadil (Deltalab S.L., Barcelona, Hispaania). Enamikes reaktsioonides jäetimärklaudrakkude hulk konstantseks (10000 rakku) ning muudeti efektorrakkude hulka(vahemikus 10000-120000 rakku), välja arvatud väga madala efektor/märklaudrakkude suhtegareaktsioonid, kus suurendati märklaudrakkude hulka. Esimesena kanti plaadile märklaudrakud,34

seejärel lisati efektorrakud ning RPMI 1640 sööde, et kõikides kaevudes oleva reaktsioonisegumaht oleks võrdne (100-120 µl). Samuti kanti plaadile kontrollproovide jaoks mõeldud rakud:1) Värvimata efektorrakkude proov on vajalik efektorrakkude piirkonna defineerimiseks dotplotilning negatiivse kontrollina CFSE positiivsete rakkude piirkonna defineerimisel.2) CFSE-ga värvitud märklaudrakkude proov on vajalik CFSE positiivsete rakkude piirkonnadefineerimiseks dotplotil ning voltaaži reguleerimiseks CFSE kanalis.3) Osa CFSE-ga värvitud märklaudrakke värviti peale inkubatsiooni 7-AAD-ga (MolecularProbes, Leiden, Holland) 3µg/ml. Proov on vajalik märklaudrakkude spontaanse suremuse(L spont ) protsendi määramiseks.4) Osa CFSE-ga värvitud märklaudrakke lüüsiti Triton X-100 (Sigma) 0,01% detergendilahusega ning värviti 7-AAD-ga. Proov on vajalik permeabiliseeritud märklaudrakkude piirkonnadefineerimiseks dotplotil ja maksimaalse lüüsi väärtuse määramiseks (L max ).Plaadile kandmise järgselt rakud resuspendeeriti, seejärel plaat tsentrifuugiti 500×g 2minutitit ning inkubeeriti 4 tundi temperatuuril 37°C.Seejärel lisati kõikidele tsütotoksilisuse reaktsioonidele ning vastavatelekontrollproovidele 7-AAD lahust lõppkontsentratsioonini 3µg/ml. Proovid segati korralikult ningjäeti mõneks minutiks värvuma. Seejärel tsentrifuugiti (500×g, 5 minutit) rakud põhja, aspireeritisupernatant ning rakud resuspendeeriti 100-150 µl DPBS-s. Saadud proove hoiti enneanalüüsimist jääl.2.8 VoolutsütomeetriaProovide analüüsiks kasutati Becton Dickinson LSRII voolutsütomeetrit, millel on sinine(λ=488nm) ja punane (λ=633nm) laser ning kuus filtrit fluorestsentse signaali analüüsiks (sininelaser: 530/30nm, FITC/GFP; 575/26nm, PE/PI; 695/40nm, PerCP-Cy5.5/7-AAD; 780/60nm, PE-Cy7 ja punane laser: 660/20nm, APC/AlexaFluor647; 780/60nm, APC-Cy7). FACS analüüsiandmete visualiseerimiseks nii andmete kogumisel kui ka analüüsimisel kasutati klassikaliselogaritmilise esitlusviisi asemel BD FACSDiva tarkvara võimaldatud bi-eksponetsiaalsetesitlusviisi.Immunofenotüpiseerimise proovid lahjendati enne analüüsimist 500 µl DPBS-s ning loetisisse kasutades FACS tuube (BD Falcon, Le Point De Claix, Prantsusmaa). Esimese etapinadefineriti SSC (side scatter) versus FSC (forward scatter) dotplotil elusate rakkude populatsioon,35

eristades neid rakufragmentidest, seejärel reguleeriti erinevate kanalite voltaažid. Salvestati10000-20000 elusa raku andmed.Tsütotoksilisuse analüüsi proovide sisselugemiseks kasutati BD LSRII kõrgeläbilaskevõimega lugejat, mis võimaldab analüüsida proove otse mikrotiiterplaadilt. Esmaltdefineeriti SSC versus FSC dotplotil rakkude piirkond R1 (rakud) eristamaks neidrakufragmentidest ja prügist (Joonis 4A). Edaspidi defineeriti 7-AAD versus CFSE dotplotilefektorrakkude populatsioon (R4), kasutades selleks värvimata efektorrakkude kontrollproovi(Joonis 4D). R4 piirkonnast jäeti välja 7-AAD positiivsed surnud efektorrakud. Märklaudrakkudepiirkonna (R2) defineerimiseks 7-AAD versus CFSE dotplotil analüüsiti CFSE ja 7-AAD-gavärvitud märklaudrakke (ilma efektorrakkudeta kontrollproov) (Joonis 4B). R3 –permeabiliseerunud märklaudrakkude piirkonna leidmiseks analüüsiti TritonX-100-lüüsitudmärklaudrakke (Joonis 4C). Mõlemad piironnad võeti piisavalt kitsad, et välistadarakufragmentide sattumine anlüüsipiirkonda. 7-AAD-ga värvitud märklaudrakkude anlüüsimiselarvestati sellega, et permeabeliseeritud rakkude populatsioon võib olla 7-AAD teljel kaheosaline(Joonis 3). Analüüsi täpsuse huvides salvestati igast proovist andmeid 10000-20000 raku kohta.Joonisel 2 on kujutatud ühe tsütotoksilise reaktisooni 7-AAD versus CFSE näidis dotplot ningselle statistilised andmed.ABJoonis 3: Tsütotoksilisuse reaktsiooni analüüs. 7-AAD versus CFSE dotplot (A) ningpopulatsioonide hierarhia ja väärtused (B).36

ABCDEFJoonis 4: Rakupopulatsioonide defineerimine tsütomeetril. A: R1 määrab analüüsitavate rakkude populatsiooni SSCversus FSC plotil. Kaasa arvatud on surnud rakud (kõrge SSC ja madal FSC), kuid mitte väikesed rakufragmendid. B: R2määrab 7-AAD versus CFSE plotil märklaudrakkude populatsiooni. C: R3 määrab 7-AAD versus CFSE plotilpermeabiliseerunud märklaudrakkude populatsiooni. D: R4 määrab 7-AAD versus CFSE plotil efektorrakkudepopulatsiooni. E: Populatsioonide hierarhia ning kontrollväärtused maksimaalse tsütolüüsi (L max ) puhul F:kontrollväärtused spontaanse tsütolüüsi (L spont ) puhul.37

2.9 AndmetöötlusImmunofenotüpiseerimisel saadud andmed doonorite NK rakkude ja teisterakupopulatsioonide protsentide kohta kanti MS Exceli programmi.Tsütotoksilisuse analüüsis saadud andmete põhjal määrati tsütolüüsi efektiivsus, võrreldesNK rakkudega ko-inkubeeritud märklaudrakkude lüüsi samades tingimustes ilma efektorrakkudejuuresolekuta inkubeeritud kontrollproovi märklaudrakkude lüüsiga. Spetsiifilist tsütotoksilisustC (NK rakkude poolt põhjustatud märklaudrakkude lüüsi) arvutati järgmise valemi järgi:C=( L( Lmaxmax−−LLspontspont)× 100)kus L spont tähistab märklaudrakkude spontaanset lüüsi ning L exp – eksperimentaalset lüüsi(märklaudrakkude lüüsi tsütotoksilise reaktsiooni proovis).Tsütotoksilisuse hindamisel on oluline efektor/märklaudrakkude suhe. Tegelikeefektoritena arvestati ainult NK rakke (nende protsentuaalset hulka kõikidest lümfotsüütidestmäärati fenotüpiseerimise analüüsiga). Tegelikku efektor/märklaudrakkude suhet (N) arvutatijärgmise valemi järgi:NK %N = ( efektorrakkude %( R4)× ) / märklaudrakkude %( R2)100Andmete analüüsiks kasutati MS Excel ja GraphPad Prism 4 statistikaprogrammi.38

3. TULEMUSED JA ARUTELU3.1 Doonorite NK rakkude ekspansioonKahekümne kaheksa doonori NK ekspansiooni 21 päeva jooksul iseloomustab sarnanedünaamika, kuid NK rakkude protsent kõikidest lümfotsüütidest on doonoritel erinev. Kultuurialustamise päeval moodustavad NK rakud erinevatel doonoritel 2-19,3 % kõikidestlümfotsüütidest, kultuuri 5.-8. päevaks NK rakkude protsent langeb ning seejärel hakkab uuestitõusma, saavutades oma maksimumi 15. päevaks. Peale kahenädalast ekspansiooni rakkude kasvkultuuris aeglustub ja NK rakkude protsent hakkab samuti langema. 15. päeval on NK rakkude %erinevatel doonoritel väga erinev ning varieerub vahemikus 3,6% (doonor 61) kuni 71,6%(doonor 63) (Joonis 5 ja Tabel 2).NK %1009080706050403020100Kõikide doonorite NK rakkude ekspansioon0 5 10 15 20 25Aeg (päevad)56721222324283145464749516162637172737580818283849394Joonis 5. Doonorite NK rakkude protsent kõikidest lümfotsüütidest erinevatel päevadelkolmenädalase in vitro ekspansiooni jooksul.39

Tabel 2. NK rakkude protsendi sõltuvus kasvatuse kestvusest. HLA-C alleelide tähistus onjärgmine: He – HLA-C heterosügootne; Ho gr 1 – HLA-C grupp 1 homosügootne ja Ho gr 2 –HLA-C grupp 2 homosügootne. (†) tähistab doonori kohta puuduvaid andmeid, sest rakud onkultuuris selleks päevaks surnud. Päeva 15. andmed kasutati HLA-C epitoobi ja NK rakkudeekspansiooni sõltuvuse analüüsis.Doonori HLA-C päev 0 päev 2 päev 3 päev 7 päev 9 päev 12 päev 15 päev 21number grupp5 He 12,50 17,90 1,40 3,30 10,60 3,306 He 14,60 6,30 3,40 7,40 53,00 19,707 He 5,90 0,90 1,20 0,80 13,10 58,0021 Ho gr 1 3,48 0,76 7,96 3,1422 He 6,12 4,64 9,62 12,1223 He 2,90 1,43 6,78 8,1924 He 6,45 5,57 3,03 3,35 6,6028 He 12,87 14,84 5,03 12,21 14,4631 Ho gr 1 19,32 15,02 3,87 20,25 13,4145 Ho gr 2 6,20 8,10 19,10 11,7 26,8046 Ho gr 2 4,90 6,50 1,60 11 30,9047 Ho gr 2 10,00 14,70 4,30 33,5 49,90 14,3249 Ho gr 2 9,60 13,90 4,40 34,6 30,20 12,3651 Ho gr 1 7,66 8,80 6,60 †61 He 2,30 17,30 3,61 5,4762 Ho gr 1 2,70 40,70 14,32 20,1963 He 1,40 12,60 71,64 80,9171 He 2,30 3,60 †72 He 12,00 3,90 10,47 10,6473 He 7,10 4,60 28,35 18,4675 Ho gr 1 4,60 1,60 5,44 13,9980 He 7,00 8,20 12,00 16,90 9,5181 He 0,50 3,90 3,70 9,40 3,4982 He 2,00 10,20 7,40 12,60 9,7283 He 6,60 9,70 19,40 17,00 5,0384 He 10,20 10,50 10,40 31,80 37,3693 Ho gr 1 1,95 1,88 †94 Ho gr 1 5,73 4,30 2,88 †40

3.2 NK rakkude ekspansiooni sõltuvus doonori HLA-C epitoopide ekspressioonistViieteistkümnenda päeva andmete alusel võrreldi varieeruvust 24 doonori NK rakkudeprotsentides erinevaid HLA-C gruppe omavate doonorite vahel – omavahel võrreldi HLA-Cheterosügootseid, HLA-C grupp 1 homosügootseid ja HLA-C grupp 2 homosügootseid doonoritegruppe. Statistilise analüüsi jaoks kasutati programmi GraphPad Prism 4 ja Mann-Whitney testi.Analüüs näitas, et HLA-C grupp 2 homosügootsete doonorite NK % 15. päeval oli oluliseltkõrgem, kui HLA-C grupp 1 homosügootsetel doonoritel (p

võimalik visualiseerida kõiki rakupopulatsioone, isegi madala või taustfluorestsentsigapopulatsioone. Kahedimensionaalse logaritmilise esituse korral paigutuvad kõik rakud, millefluorestsents on null või nullilähedane vastu telgi. Need rakud võivad moodustada üllatavaltsuure osa analüüsitud rakkudest, kuigi visuaalsel hinnangul tundub, et neid vastu telge olevaidrakke on vähe. Bi-eksponentsiaalse esituse korral on need rakud täiesti nähtavad eraldipopulatsioonina, mis paigutub nullväärtuse ümber (Herzenberg, Tung et al. 2006). Joonisel 7 onkujutatud sama tsütotoksilisuse reaktisooni analüüsi andmed, esindatuna kas bi-eksponentsiaalselvõi tavalisel logaritmilisel plotil. Bi-eksponentsiaalsel esitusel on värvimata efektorrakud (midaon 75 % rakkude koguhulgast) nähtavad eraldi populatsioonina, logaritmilisel esitusel näeb neistainult väga väikest osa ning jääb petlik mulje, et märklaudrakke on rohkem, kui efektorrakke.Bi-eksponentsiaalse esituse vaatamisel tekib küsimus, kuidas saab raku fluorestsents ollanegatiivne ja miks on rakud sageli sümmeetriliselt paigutatud nulli ümber. Põhjus on tsütomeetriandmete kogumise ja korrigeerimise (kompenseerimise) viisisis. Taustavalgusel ja elektrooniliselmüral on tegelikult väike, kuid tähtis osakaal igalt rakult saadud üldise signaali väärtuses –tsütomeeter mõõdab taustavalguse väärtust ning lahutab selle igalt rakult saadud signaaliväärtusest. Instrumendi taustakorrektsioon toob sisse statistilist varieeruvust, mis põhjustab seda,et detektori poolt mõõdetud näitaja võib olla natuke kõrgem või madalam instrumendi nulliksmääratud väärtusest. Selle tulemusena jaotuvad korrigeeritud näitajad sümmeetsiliselt nulliümber. Seda jaotumist laiendavad ka spektraalse kattuvuse efektid värvide vahel. Tsütomeetriandmete kogumise käigus mõõdavad iga fluorokroomi valgust eraldi detektorid. Kuid osa sellefluorokroomi valgusest võib olla kiiratud ja detekteeritud teise fluorokroomi jaoks mõeldudlainepikkuse piirkonnas (Herzenberg, Tung et al. 2006).Fluorestsentsi kompensatsioon on protsess, mille käigus määratakse spektraalse kattuvuseväärtust ja lahutatakse see kogusignaalist, mida iga detektor mõõdab mitme värviga märgistatudrakkude analüüsil. Joonisel 7A ja 7B on esitatud kompenseerimata andmed – bi-eksponentsiaalselesitlusel on selgelt näha, et CFSE positiivsete märklaudrakkude popultasioon onalakompenseeritud, sest see ei asu ühel teljel CFSE negatiivsete efektorrakkude populatsiooniga.Joonisel 7C ja 7D on esitatud andmed peale kompneseerimist. Erinevalt logartimilisest esitusestvõimaldab bi-eksponentsiaalne esitus väga täpset kompenseerimist, logaritmilise esituse puhultoimub kompenseerimine pigem silma järgi.Kaasaegsed tsütomeetrid salvestavad analüüsi andmeid ilma kompensatsioonita.Kompensatsioon toimub juba hiljem andmete analüüsi käigus. Bi-eksponetsiaalne esitusviis42

pakub väga head võimalust kõikide rakupopulatsioonide visualiseerimiseks ja õigekskompenseerimiseks, mis oluliselt suurendab andmete täpsust. Logaritmiline esitus eeldab agamingil määral pimesi kompenseerimist, mistõttu analüüsiandmete täpsus väheneb (Herzenberg,Tung et al. 2006).ABCDJoonis 7. Näidis tsütotoksilisuse reaktsioon esitatuna logaritmilisel ja bi-eksponentsiaalsel viisil.Kompenseerimata algandmed bi-eksponentsiaalsel (A) ja logaritmilisel (B) plotil.Kompenseeritud andmed bi-eksponentsiaalsel (C) ja logaritmilisel (D) plotil.43

3.4 NK rakkude aktiivsuse analüüsiks sobilik efektor/märklaudrakkude suhte vahemikDoonorrakkude tsütotoksilisuse aktiivsuse mõõtmisel on vajalik täpselt jälgidaefektor/märklaudrakkude suhet. Käesolevas töös varieeriti efektor/märklaudrakkude suhet laiadespiirides (0,05-20) ning N väärtus jäi reeglina vahemikku N = 0,1-10 (Joonis 8). Sellisespiirkonnas on tsütomeetriline analüüsi abil võimalik määrata NK rakkude spetsiifilisttsütotoksilisust (C) 5% täpsusega.Joonis 8. Tsütotoksilisuse analüüsi piirkond. Analüüsi tundlikkus võimaldab määrata spetsiifilisttsütotoksilisust (C) efektor/märklaudrakkude suhte (N) vahemikus 0,1-10. Näidatud on Cväärtused kolme erineva rakuliini jaoks (K562, Namalwa ja LCL 721.221- wt).3.5 NK rakkude tsütotoksilise funktsiooni seos Michaelis-Menteni seadusegaNK rakkude tsütotoksilise aktiivsuse analüüsil selgus, et spetsiifilise tsütotoksilisuse (C) jaefektor/märklaudrakkude vaheline seos ei ole lineaarne, vaid järgib massitoime (Michaelis-Menteni) seadust (Joonis 8). Seejuures kirjeldab lüüsi intensiivsuse sõltuvust efektorrakkudehulgast ühe seondumiskohaga retseptor-ligandi mudel. Tüüpilisel juhul langes spetsiifilisetsütotoksilisuse näitaja (C) alla 5% N=0,1 juures ning lüüs küllastus N=5 kuni N=10 juures.3.6 NK rakkude tsütotoksilisuse seos märklaudrakkude koesobivusantigeenideekspressioonigaOn teada, et NK rakud on võimelised teisi rakke lüüsima paljude erinevateaktivatsioonisignaalide tulemusel ning isiklikud erinevused NK rakkude aktiivususes on44

märkimisväärsed. Erinevate märklaudrakuliinide analüüsil selgus, et märklaudrakkude tundlikkusNK rakkude poolse lüüsi suhtes on erinev, kuid allub sarnasele mehhanismile (Joonis 9).K562, Namalwa ja LCL 721.221- wt regressioonianalüüsi graafikute alusel leitipoolmaksimaalse lüüsi N väärtused (N C50 ), mis näitavad seda, mis efektor/märkaludrakkudesuhte korral lüüsitakse pool märklaudrakkudest. K562 N C50 =0,7; Namalwa N C50 =1,9 ja LCL721.221- wt N C50 =0,3. LCL 721.221- wt rakuliini lüüsitundlikus oli kõige kõrgem ning jõudismaksimaalse lüüsi väärtuseni 100%. Seega oli spetsiifiline tsütotoksilisus oluliselt kõrgem HLA Inegatiivsete rakuliinide vastu (K562 ja LCL 721.221- wt) võrreldes HLA-C ekspresseeritavarakuliiniga (Namalwa) (p

ABCNNNJoonis 9. Tsütotoksilisuse reaktsioon järgib massitoime reeglit. Graafikud kujutavad NK rakkudetsütotoksilisust (C) sõltuvalt NK rakkude arvust ühe märklaudraku kohta (N) kolme erinevarakuliini vastu: K562 (HLA-C negatiivse) (A), Namalwa (HLA-C*07) (B) ja LCL 721.221-wt(HLA-C negatiivse) (C). Näidatud on parima sobivuse kõver, R 2 väärtus ning 95% konfidentsusintervall(tähistatud katkendjoonena). Regressioonanalüüsil on kasutatud ühe seondumiskohagaretseptori-ligandi mudelit. NK rakkude tsütotoksilisus on kõrgem HLA-C negatiivsete rakuliinidevastu, kui HLA-C positiivse rakuliini vastu.46

A721.221-wtB721.221-040110010080806060CC40R 2 =0.9740R 2 =0.99202000 2 4 6 8 10N00 2 4 6 8 10NC721.221-1202D721.221-140310010080806060CC40R 2 =0.9940R 2 =0.97202000 2 4 6 8 10N00 2 4 6 8 10NJoonis 10: NK rakkude tsütotoksilisuse analüüs HLA-C negatiivse LCL 721.221-wt (A) ja kolmeerinevate HLA-C alleelidega transfekteeritud rakuliini (LCL 721.221-0401 (B), LCL 721.221-1202 (C) ja LCL 721.221-1403 (D)) vastu. NK rakkude aktiivsus oli kõige kõrgem LCL721.221-wt rakuliini vastu ja kõige madalam LCL 721.221-1403 vastu.47

KOKKUVÕTEDoonorite ekspansiooni uuringutest võib järeldada, et käesolevas töös kasutatud NKdoonorrakud olid väga erineva ekspansioonivõimega – peale kahenädalast ekspansiooni varieeruserinevate doonorite NK rakkude protsent 3,6% ja 71,6% vahemikus. Nende rakkude geneetilisestja funktsionaalsest analüüsist võib teha järgmised järeldused:1) NK rakkude ekspansioon on indiviiditi erinev ning sõltub doonori HLA-C epitoopidest: HLA-C grupp 2 homosügootsete doonorite NK % oli oluliselt kõrgem, kui HLA-C grupp 1homosügootsetel doonoritel.2) Tsütomeetriline andmete analüüs bi-eksponentsiaalse visualiseerimise põhjal suurendabanalüüsi täpsust, võrreldes logaritmilise visualiseerimisega.3) Tsütomeetriline analüüs võimaldab täpselt määrata NK rakkude tsütotoksilist aktiivsust laiasefektor/märklaudsuhte vahemikus (N=0,1-10).4) NK rakkude tsütotoksiline funktsioon järgib massitoime (Michaelis-Menteni) seadust.5) Erinevate märklaudrakkude tundlikkus NK rakkude vahendatud lüüsi suhtes on erinev ningsõltub nende pinnal ekspresseeritud koesobivusantigeenidest – spetsiifiline tsütotoksilisus olikõrgem HLA-negatiivsete rakuliinide vastu, võrreldes HLA-C ekspresseerivate rakkudega.Kokkuvõtteks võib öelda, et NK rakkude tsütotoksilise funktsiooni tsütomeetriline analüüson täpne ning sobib kasutamiseks kliinilistes laborites, mis ei ole varustatud tööksradioistoopidega. NK rakkude võime hävitada märklaudrakke säilib in vitro kultuuris ning allubKIR-HLA interaktsiooni reeglitele. Samuti on võimalik HLA-C genotüübi alusel ennustada NKrakkude ekspansiooni võimet.48

„Influence of genotype on NK cell behaviour in culture“Anna ŠtšerbakovaSUMMARYIntroduction: NK (Natural Killer) cells are cellular effectors of the innate immune system. Theycomprise 5-15% of the peripheral blood mononuclear cells. Their functions include the primaryelimination of virally infected cells, immune activation via cytokines, immune regulation viakilling of immature dendritic cells, and tumour control and inhibition of metastatic spread. NKcells can be used in immunotherapy for malignant diseases, and for reducing the risk ofcomplications in haematopoietic stem cell transplantation. Unfortunately, the amount of cellsavailable from one donor is not sufficient for effective therapy. To expand the amount of NKcells the lymphocytes are cultureid in vitro.Aim: Analysis of cytotoxic functions is required for characterization of cells for cell-basedimmunotherapy. However, radioisotope-based methods used so far require specific workingconditions and equipment. In order to optimize a non-radioactive method for analysis of in vitrocultured Natural Killer (NK) cells’ cytotoxic function for use in clinical laboratories we haveinvestigated the use of cytometry. The aim of this work was to characterize the dependance of invitro NK cell expansion on the donor HLA-C epitope and evaluate susceptibility of target cells toNK mediated lysis depending on their surface expression of histocompatibility antigens.Methods: Lymphocytes of 28 donors were cultured in vitro during 3 weeks and NK cellexpansion was monitored by flow cytometry. By using CFSE and 7-AAD double labelling oftarget cells and simultaneous multiparameter analysis of effector cells, we have also optimizedthe analysis of cytotoxicity as a cytometry-based assay.Results: Donor NK cells expansion varied significantly – NK cell percentage from alllymphocytes ranged between 3,6% and 71,6%. The results show, that individuals homozygousfor HLA-C allele group 2 had significantly better NK cell expansion in comparison to HLA-Cgroup 1 homozygous individuals. Flow cytometry analysis of cytotoxicity data on the basis of biexponentialdisplay was more precise in comparison to logaritmic display and enabled measuringof specific cytotoxicity in wide efector/target ratio interval. Our results establish the useful rangeof effector/target ratio to be 0,1 to 10. We found that cytolysis depends on effector/target ratioaccording to the law of mass action. The in vitro cultivated NK cells are highly cytotoxic, yet49

their function is regulated by target cell histocompatibility antigens (MHC I). The standard errorof our assays at C max was 2.0-2.6% and 95% confidence interval ±

TÄNUAVALDUSEDKäesoleva töö valmimist on toetanud Eesti Teadusfond (Grant ETF-6976),Haridusministeerium (SF0180161s08 "Kasvajaliste haiguste märklaudravi – peremeesorganismimõjutamise võimalused"), Ettevõtluse Arendamise Sihtasutus, Eesti Vabariigi ja Euroopa LiiduStruktuurifondid.Tahaks tänada Utrechti Ülikooli Prof. Marcel Tilanust ja Dr. Jennifer Schelleckensi tööskasutatud rakkude eest.Soovin tänada oma juhendajat doktor Alar Aintsi ja Madis Tõnsi mõistava ja sõbralikusuhtumise ning suure abi eest käesoleva töö koostamisel ja vormistamisel. Suur tänu SvetlanaOrlovale, kes aitas mind labori töövõtete omandamisel ja Helen Lustile moraalse toe ja optimismieest. Olen väga tänulik ka Eve Proovelile, kes õpetas mind kasutama FACS analüsaatorit.51

KASUTATUD KIRJANDUSAndre, P., R. Biassoni, et al. (2001). "New nomenclature for MHC receptors." Nat Immunol 2(8):661.Andre, P., O. Spertini, et al. (2000). "Modification of P-selectin glycoprotein ligand-1 with anatural killer cell-restricted sulfated lactosamine creates an alternate ligand for L-selectin." Proc Natl Acad Sci U S A 97(7): 3400-5.Ashkenazi, A. (2002). "Targeting death and decoy receptors of the tumour-necrosis factorsuperfamily." Nat Rev Cancer 2(6): 420-30.Avril, T., H. Floyd, et al. (2004). "The membrane-proximal immunoreceptor tyrosine-basedinhibitory motif is critical for the inhibitory signaling mediated by Siglecs-7 and -9,CD33-related Siglecs expressed on human monocytes and NK cells." J Immunol 173(11):6841-9.Bachy, M., A. Bonnin-Rivalland, et al. (1999). "Beta galactosidase release as an alternative tochromium release in cytotoxic T-cell assays." J Immunol Methods 230(1-2): 37-46.Batchelor, R. H. and M. Zhou (2004). "Use of cellular glucose-6-phosphate dehydrogenase forcell quantitation: applications in cytotoxicity and apoptosis assays." Anal Biochem329(1): 35-42.Bauer, S., V. Groh, et al. (1999). "Activation of NK cells and T cells by NKG2D, a receptor forstress-inducible MICA." Science 285(5428): 727-9.Billadeau, D. D., J. L. Upshaw, et al. (2003). "NKG2D-DAP10 triggers human NK cell-mediatedkilling via a Syk-independent regulatory pathway." Nat Immunol 4(6): 557-64.Biron, C. A., K. B. Nguyen, et al. (1999). "Natural killer cells in antiviral defense: function andregulation by innate cytokines." Annu Rev Immunol 17: 189-220.Blanca, I. R., E. W. Bere, et al. (2001). "Human B cell activation by autologous NK cells isregulated by CD40-CD40 ligand interaction: role of memory B cells and CD5+ B cells." JImmunol 167(11): 6132-9.Blomberg, K. (1994). "Simultaneous measurement of natural killer cell cytotoxicity against eachof three different target cell lines." J Immunol Methods 168(2): 267-73.Bradley, M., A. Zeytun, et al. (1998). "Role of spontaneous and interleukin-2-induced naturalkiller cell activity in the cytotoxicity and rejection of Fas+ and Fas- tumor cells." Blood92(11): 4248-55.Brady, J., Y. Hayakawa, et al. (2004). "IL-21 induces the functional maturation of murine NKcells." J Immunol 172(4): 2048-58.Brenan, M. and C. R. Parish (1988). "Automated fluorometric assay for T cell cytotoxicity." JImmunol Methods 112(1): 121-31.Bruning, J. W., M. J. Kardol, et al. (1980). "Carboxyfluorescein fluorochromasia assays. I. Nonradioactivelylabeled cell mediated lympholysis." J Immunol Methods 33(1): 33-44.Brunner, K. T., J. Mauel, et al. (1968). "Quantitative assay of the lytic action of immunelymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibodyand by drugs." Immunology 14(2): 181-96.Bryceson, Y. T., M. E. March, et al. (2005). "Cytolytic granule polarization and degranulationcontrolled by different receptors in resting NK cells." J Exp Med 202(7): 1001-12.Buentke, E., L. C. Heffler, et al. (2002). "Natural killer and dendritic cell contact in lesionalatopic dermatitis skin--Malassezia-influenced cell interaction." J Invest Dermatol 119(4):850-7.52

Caligiuri, M. A., A. Zmuidzinas, et al. (1990). "Functional consequences of interleukin 2 receptorexpression on resting human lymphocytes. Identification of a novel natural killer cellsubset with high affinity receptors." J Exp Med 171(5): 1509-26.Caligiuri, M. A., A. Velardi, et al. (2004). "Immunotherapeutic approaches for hematologicmalignancies." Hematology Am Soc Hematol Educ Program: 337-53.Cantoni, C., C. Bottino, et al. (1999). "Molecular and functional characterization of IRp60, amember of the immunoglobulin superfamily that functions as an inhibitory receptor inhuman NK cells." Eur J Immunol 29(10): 3148-59.Carlens, S., M. Gilljam, et al. (2001). "A new method for in vitro expansion of cytotoxic humanCD3-CD56+ natural killer cells." Hum Immunol 62(10): 1092-8.Carlsten, M., N. K. Bjorkstrom, et al. (2007). "DNAX accessory molecule-1 mediatedrecognition of freshly isolated ovarian carcinoma by resting natural killer cells." CancerRes 67(3): 1317-25.Castriconi, R., C. Cantoni, et al. (2003). "Transforming growth factor beta 1 inhibits expressionof NKp30 and NKG2D receptors: consequences for the NK-mediated killing of dendriticcells." Proc Natl Acad Sci U S A 100(7): 4120-5.Castriconi, R., A. Dondero, et al. (2004). "Natural killer cell-mediated killing of freshly isolatedneuroblastoma cells: critical role of DNAX accessory molecule-1-poliovirus receptorinteraction." Cancer Res 64(24): 9180-4.Cerwenka, A. and L. L. Lanier (2001). "Natural killer cells, viruses and cancer." Nat RevImmunol 1(1): 41-9.Chang, L., G. A. Gusewitch, et al. (1993). "Rapid flow cytometric assay for the assessment ofnatural killer cell activity." J Immunol Methods 166(1): 45-54.Chang, M. H., L. E. Karageorgos, et al. (2002). "CD107a (LAMP-1) and CD107b (LAMP-2)." JBiol Regul Homeost Agents 16(2): 147-51.Chapman, T. L., A. P. Heikeman, et al. (1999). "The inhibitory receptor LIR-1 uses a commonbinding interaction to recognize class I MHC molecules and the viral homolog UL18."Immunity 11(5): 603-13.Chawla-Sarkar, M., D. J. Lindner, et al. (2003). "Apoptosis and interferons: role of interferonstimulatedgenes as mediators of apoptosis." Apoptosis 8(3): 237-49.Cifone, M. G., S. D'Alo, et al. (1999). "Interleukin-2-activated rat natural killer cells expressinducible nitric oxide synthase that contributes to cytotoxic function and interferongammaproduction." Blood 93(11): 3876-84.Cohen, A. M., J. F. Burdick, et al. (1971). "Cell-mediated cytotoxicity: an assay using 125 I-iododeoxyuridine-labeled target cells." J Immunol 107(3): 895-8.Comans-Bitter, W. M., R. de Groot, et al. (1997). "Immunophenotyping of blood lymphocytes inchildhood. Reference values for lymphocyte subpopulations." J Pediatr 130(3): 388-93.Cooper, M. A., T. A. Fehniger, et al. (2001). "The biology of human natural killer-cell subsets."Trends Immunol 22(11): 633-40.Cooper, M. A., T. A. Fehniger, et al. (2001). "Human natural killer cells: a unique innateimmunoregulatory role for the CD56(bright) subset." Blood 97(10): 3146-51.Coscoy, L., D. J. Sanchez, et al. (2001). "A novel class of herpesvirus-encoded membrane-boundE3 ubiquitin ligases regulates endocytosis of proteins involved in immune recognition." JCell Biol 155(7): 1265-73.Costello, R. T., S. Sivori, et al. (2002). "Defective expression and function of natural killer celltriggeringreceptors in patients with acute myeloid leukemia." Blood 99(10): 3661-7.Cudkowicz, G. and M. Bennett (1971). "Peculiar immunobiology of bone marrow allografts. II.Rejection of parental grafts by resistant F 1 hybrid mice." J Exp Med 134(6): 1513-28.53

Decker, T. and M. L. Lohmann-Matthes (1988). "A quick and simple method for the quantitationof lactate dehydrogenase release in measurements of cellular cytotoxicity and tumornecrosis factor (TNF) activity." J Immunol Methods 115(1): 61-9.Dohring, C., J. Samaridis, et al. (1996). "Alternatively spliced forms of human killer inhibitoryreceptors." Immunogenetics 44(3): 227-30.Dufourcq-Lagelouse, R., E. Pastural, et al. (1999). "Genetic basis of hemophagocyticlymphohistiocytosis syndrome (Review)." Int J Mol Med 4(2): 127-33.El-Sherbiny, Y. M., J. L. Meade, et al. (2007). "The requirement for DNAM-1, NKG2D, andNKp46 in the natural killer cell-mediated killing of myeloma cells." Cancer Res 67(18):8444-9.Fehniger, T. A., M. A. Cooper, et al. (2002). "Interleukin-2 and interleukin-15: immunotherapyfor cancer." Cytokine Growth Factor Rev 13(2): 169-83.Feldmann, J., I. Callebaut, et al. (2003). "Munc13-4 is essential for cytolytic granules fusion andis mutated in a form of familial hemophagocytic lymphohistiocytosis (FHL3)." Cell115(4): 461-73.Flieger, D., R. Gruber, et al. (1995). "A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based onthe differential assessment of living and killed target and effector cells." J ImmunolMethods 180(1): 1-13.Fox, R. I., S. Fong, et al. (1984). "Characterization of recirculating lymphocytes in rheumatoidarthritis patients: selective deficiency of natural killer cells in thoracic duct lymph." JImmunol 132(6): 2883-7.Godfrey, D. I., H. R. MacDonald, et al. (2004). "NKT cells: what's in a name?" Nat Rev Immunol4(3): 231-7.Goldberg, J. E., S. W. Sherwood, et al. (1999). "A novel method for measuring CTL and NK cellmediatedcytotoxicity using annexin V and two-color flow cytometry." J ImmunolMethods 224(1-2): 1-9.Griffith, T. S., W. A. Chin, et al. (1998). "Intracellular regulation of TRAIL-induced apoptosis inhuman melanoma cells." J Immunol 161(6): 2833-40.Hamerman, J. A., K. Ogasawara, et al. (2005). "NK cells in innate immunity." Curr OpinImmunol 17(1): 29-35.Harada, H., K. Saijo, et al. (2002). "Selective expansion of human natural killer cells fromperipheral blood mononuclear cells by the cell line, HFWT." Jpn J Cancer Res 93(3): 313-9.Hayakawa, Y. and M. J. Smyth (2006). "Innate immune recognition and suppression of tumors."Adv Cancer Res 95: 293-322.Helander, T. S. and T. Timonen (1998). "Adhesion in NK cell function." Curr Top MicrobiolImmunol 230: 89-99.Herzenberg, L. A., J. Tung, et al. (2006). "Interpreting flow cytometry data: a guide for theperplexed." Nat Immunol 7(7): 681-5.Hokland, M. and P. J. Kuppen (2005). "Natural killer cells: from "disturbing" background tocentral players of immune responses." Mol Immunol 42(4): 381-3.Hussain, R. F., A. M. Nouri, et al. (1993). "A new approach for measurement of cytotoxicityusing colorimetric assay." J Immunol Methods 160(1): 89-96.Igarashi, T., J. Wynberg, et al. (2004). "Enhanced cytotoxicity of allogeneic NK cells with killerimmunoglobulin-like receptor ligand incompatibility against melanoma and renal cellcarcinoma cells." Blood 104(1): 170-7.Ikeda, H., L. J. Old, et al. (2002). "The roles of IFN gamma in protection against tumordevelopment and cancer immunoediting." Cytokine Growth Factor Rev 13(2): 95-109.54

Imai, C., S. Iwamoto, et al. (2005). "Genetic modification of primary natural killer cellsovercomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells." Blood106(1): 376-83.Irmler, M., M. Thome, et al. (1997). "Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP."Nature 388(6638): 190-5.Ito, M., T. Maruyama, et al. (2006). "Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members ofthe classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity." J Exp Med 203(2): 289-95.Iwanowicz, L. R., C. L. Densmore, et al. (2004). "Calcein AM release-based cytotoxic cell assayfor fish leucocytes." Fish Shellfish Immunol 16(2): 127-37.Jagarlamoody, S. M., J. C. Aust, et al. (1971). "In vitro detection of cytotoxic cellular immunityagainst tumor-specific antigens by a radioisotopic technique." Proc Natl Acad Sci U S A68(6): 1346-50.Jonges, L. E., P. Albertsson, et al. (2001). "The phenotypic heterogeneity of human natural killercells: presence of at least 48 different subsets in the peripheral blood." Scand J Immunol53(2): 103-10.Kagi, D., B. Ledermann, et al. (1996). "Molecular mechanisms of lymphocyte-mediatedcytotoxicity and their role in immunological protection and pathogenesis in vivo." AnnuRev Immunol 14: 207-32.Karawajew, L., G. Jung, et al. (1994). "A flow cytometric long-term cytotoxicity assay." JImmunol Methods 177(1-2): 119-30.Karim, M. A., D. L. Nagle, et al. (1997). "Mutations in the Chediak-Higashi syndrome gene(CHS1) indicate requirement for the complete 3801 amino acid CHS protein." Hum MolGenet 6(7): 1087-9.Karre, K. (2002). "Immunology. A perfect mismatch." Science 295(5562): 2029-31.Karre, K., H. G. Ljunggren, et al. (1986). "Selective rejection of H-2-deficient lymphomavariants suggests alternative immune defence strategy." Nature 319(6055): 675-8.Kiessling, R., E. Klein, et al. (1975). ""Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells withspecificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according togenotype." Eur J Immunol 5(2): 112-7.Kim, G. G., V. S. Donnenberg, et al. (2007). "A novel multiparametric flow cytometry-basedcytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h51Cr-release assay." J Immunol Methods 325(1-2): 51-66.Kobayashi, H., S. Dubois, et al. (2005). "Role of trans-cellular IL-15 presentation in theactivation of NK cell-mediated killing, which leads to enhanced tumorimmunosurveillance." Blood 105(2): 721-7.Kolb, H. J., C. Schmid, et al. (2004). "Graft-versus-leukemia reactions in allogeneic chimeras."Blood 103(3): 767-76.Kolber, M. A., R. R. Quinones, et al. (1988). "Measurement of cytotoxicity by target cell releaseand retention of the fluorescent dye bis-carboxyethyl-carboxyfluorescein (BCECF)." JImmunol Methods 108(1-2): 255-64.Lanier, L. L. (2003). "Natural killer cell receptor signaling." Curr Opin Immunol 15(3): 308-14.Lanier, L. L. (2005). "NK cell recognition." Annu Rev Immunol 23: 225-74.Lanier, L. L. (2008). "Evolutionary struggles between NK cells and viruses." Nat Rev Immunol8(4): 259-68.Lecoeur, H., M. Fevrier, et al. (2001). "A novel flow cytometric assay for quantitation andmultiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity." J Immunol Methods253(1-2): 177-87.55

Lecoeur, H., E. Ledru, et al. (1998). "A cytofluorometric method for the simultaneous detectionof both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes." JImmunol Methods 217(1-2): 11-26.Lee, N., M. Llano, et al. (1998). "HLA-E is a major ligand for the natural killer inhibitoryreceptor CD94/NKG2A." Proc Natl Acad Sci U S A 95(9): 5199-204.Lieberman, J. (2003). "The ABCs of granule-mediated cytotoxicity: new weapons in the arsenal."Nat Rev Immunol 3(5): 361-70.Liu, D., L. Xu, et al. (2005). "Rapid biogenesis and sensitization of secretory lysosomes in NKcells mediated by target-cell recognition." Proc Natl Acad Sci U S A 102(1): 123-7.Ljunggren, H. G. and K. Karre (1990). "In search of the 'missing self': MHC molecules and NKcell recognition." Immunol Today 11(7): 237-44.Ljunggren, H. G. and K. J. Malmberg (2007). "Prospects for the use of NK cells inimmunotherapy of human cancer." Nat Rev Immunol 7(5): 329-39.Loza, M. J., L. Zamai, et al. (2002). "Expression of type 1 (interferon gamma) and type 2(interleukin-13, interleukin-5) cytokines at distinct stages of natural killer celldifferentiation from progenitor cells." Blood 99(4): 1273-81.Malmberg, K. J., Y. T. Bryceson, et al. (2008). "NK cell-mediated targeting of human cancer andpossibilities for new means of immunotherapy." Cancer Immunol Immunother.Malnati, M. S., P. Lusso, et al. (1993). "Recognition of virus-infected cells by natural killer cellclones is controlled by polymorphic target cell elements." J Exp Med 178(3): 961-9.Mandelboim, O., N. Lieberman, et al. (2001). "Recognition of haemagglutinins on virus-infectedcells by NKp46 activates lysis by human NK cells." Nature 409(6823): 1055-60.Mandelboim, O., P. Malik, et al. (1999). "Human CD16 as a lysis receptor mediating directnatural killer cell cytotoxicity." Proc Natl Acad Sci U S A 96(10): 5640-4.Martin, A. and M. Clynes (1991). "Acid phosphatase: endpoint for in vitro toxicity tests." InVitro Cell Dev Biol 27A(3 Pt 1): 183-4.Matsumoto, G., M. P. Nghiem, et al. (1998). "Cooperation between CD44 and LFA-1/CD11aadhesion receptors in lymphokine-activated killer cell cytotoxicity." J Immunol 160(12):5781-9.McGinnes, K., G. Chapman, et al. (1986). "A fluorescence NK assay using flow cytometry." JImmunol Methods 86(1): 7-15.Metkar, S. S., B. Wang, et al. (2002). "Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforindelivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane poreformation." Immunity 16(3): 417-28.Miller, J. S. and V. McCullar (2001). "Human natural killer cells with polyclonal lectin andimmunoglobulinlike receptors develop from single hematopoietic stem cells withpreferential expression of NKG2A and KIR2DL2/L3/S2." Blood 98(3): 705-13.Miller, J. S., Y. Soignier, et al. (2005). "Successful adoptive transfer and in vivo expansion ofhuman haploidentical NK cells in patients with cancer." Blood 105(8): 3051-7.Mirandola, P., C. Ponti, et al. (2004). "Activated human NK and CD8+ T cells express both TNFrelatedapoptosis-inducing ligand (TRAIL) and TRAIL receptors but are resistant toTRAIL-mediated cytotoxicity." Blood 104(8): 2418-24.Morales, A. and P. C. Ottenhof (1983). "Clinical application of a whole blood assay for humannatural killer (NK) cell activity." Cancer 52(4): 667-70.Moretta, L., G. Ferlazzo, et al. (2006). "Effector and regulatory events during natural killerdendriticcell interactions." Immunol Rev 214: 219-28.Morris, M. A. and K. Ley (2004). "Trafficking of natural killer cells." Curr Mol Med 4(4): 431-8.56

Munger, W. E., G. A. Berrebi, et al. (1988). "Possible involvement of CTL granule proteases intarget cell DNA breakdown." Immunol Rev 103: 99-109.Nagler, A., L. L. Lanier, et al. (1989). "Comparative studies of human FcRIII-positive andnegative natural killer cells." J Immunol 143(10): 3183-91.Nakajima, H., M. Cella, et al. (2000). "Patients with X-linked lymphoproliferative disease have adefect in 2B4 receptor-mediated NK cell cytotoxicity." Eur J Immunol 30(11): 3309-18.Nakano, H., T. Kishida, et al. (2006). "Interleukin-21 triggers both cellular and humoral immuneresponses leading to therapeutic antitumor effects against head and neck squamous cellcarcinoma." J Gene Med 8(1): 90-9.Niles, A. L., R. A. Moravec, et al. (2007). "A homogeneous assay to measure live and dead cellsin the same sample by detecting different protease markers." Anal Biochem 366(2): 197-206.Nociari, M. M., A. Shalev, et al. (1998). "A novel one-step, highly sensitive fluorometric assay toevaluate cell-mediated cytotoxicity." J Immunol Methods 213(2): 157-67.Ohadi, M., M. R. Lalloz, et al. (1999). "Localization of a gene for familial hemophagocyticlymphohistiocytosis at chromosome 9q21.3-22 by homozygosity mapping." Am J HumGenet 64(1): 165-71.Orlova (2007). In vitro cultivation of natural killer (NK) cells for autologous and aIn vitrocultivation of natural killer (NK) cells for autologous and allogenic cellularimmunotherapy. Faculty of biology and geography. Tartu, Tartu University. Msc: 47.Papa, S., M. Vitale, et al. (1988). "Natural killer function in flow cytometry. I. Evaluation of NKlytic activity on K562 cell line." J Immunol Methods 107(1): 73-8.Papadopoulos, N. G., G. V. Dedoussis, et al. (1994). "An improved fluorescence assay for thedetermination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry." J ImmunolMethods 177(1-2): 101-11.Parks, D. R., M. Roederer, et al. (2006). "A new "Logicle" display method avoids deceptiveeffects of logarithmic scaling for low signals and compensated data." Cytometry A 69(6):541-51.Pende, D., S. Parolini, et al. (1999). "Identification and molecular characterization of NKp30, anovel triggering receptor involved in natural cytotoxicity mediated by human naturalkiller cells." J Exp Med 190(10): 1505-16.Peng, B. G., L. J. Liang, et al. (2004). "Expansion and activation of natural killer cells fromPBMC for immunotherapy of hepatocellular carcinoma." World J Gastroenterol 10(14):2119-23.Perez, S. A., L. G. Mahaira, et al. (2005). "A potential role for hydrocortisone in the positiveregulation of IL-15-activated NK-cell proliferation and survival." Blood 106(1): 158-66.Peron, J. M., C. Esche, et al. (1998). "FLT3-ligand administration inhibits liver metastases: roleof NK cells." J Immunol 161(11): 6164-70.Perussia, B. (1991). "Lymphokine-activated killer cells, natural killer cells and cytokines." CurrOpin Immunol 3(1): 49-55.Perussia, B., Y. Chen, et al. (2005). "Peripheral NK cell phenotypes: multiple changing of facesof an adapting, developing cell." Mol Immunol 42(4): 385-95.Perussia, B., C. Ramoni, et al. (1987). "Preferential proliferation of natural killer cells amongperipheral blood mononuclear cells cocultured with B lymphoblastoid cell lines." NatImmun Cell Growth Regul 6(4): 171-88.Rajalingam, R. (2002). "Diversity of NK cell receptors and their HLA class I ligands." ScientificCommunications(ASHI Quarterly): 68-72.57

Rajalingam, R., C. M. Gardiner, et al. (2001). "Identification of seventeen novel KIR variants:fourteen of them from two non-Caucasian donors." Tissue Antigens 57(1): 22-31.Rath, S., V. Jain, et al. (2004). "Griscelli syndrome." Indian J Pediatr 71(2): 173-5.Rodella, L., L. Zamai, et al. (2001). "Interleukin 2 and interleukin 15 differentially predisposenatural killer cells to apoptosis mediated by endothelial and tumour cells." Br J Haematol115(2): 442-50.Roder, J. C., T. Haliotis, et al. (1980). "A new immunodeficiency disorder in humans involvingNK cells." Nature 284(5756): 553-5.Rosen, D. B., J. Bettadapura, et al. (2005). "Cutting edge: lectin-like transcript-1 is a ligand forthe inhibitory human NKR-P1A receptor." J Immunol 175(12): 7796-9.Rosenberg, S. A., M. T. Lotze, et al. (1993). "Prospective randomized trial of high-doseinterleukin-2 alone or in conjunction with lymphokine-activated killer cells for thetreatment of patients with advanced cancer." J Natl Cancer Inst 85(8): 622-32.Ruggeri, L., M. Capanni, et al. (1999). "Role of natural killer cell alloreactivity in HLAmismatchedhematopoietic stem cell transplantation." Blood 94(1): 333-9.Ruggeri, L., M. Capanni, et al. (2002). "Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity inmismatched hematopoietic transplants." Science 295(5562): 2097-100.Schmid, I., C. H. Uittenbogaart, et al. (1994). "A rapid method for measuring apoptosis and dualcolorimmunofluorescence by single laser flow cytometry." J Immunol Methods 170(2):145-57.Screpanti, V., R. P. Wallin, et al. (2001). "A central role for death receptor-mediated apoptosis inthe rejection of tumors by NK cells." J Immunol 167(4): 2068-73.See, D. M., P. Khemka, et al. (1997). "The role of natural killer cells in viral infections." Scand JImmunol 46(3): 217-24.Seki, N., A. D. Brooks, et al. (2002). "Tumor-specific CTL kill murine renal cancer cells usingboth perforin and Fas ligand-mediated lysis in vitro, but cause tumor regression in vivo inthe absence of perforin." J Immunol 168(7): 3484-92.Sekine, T., H. Shiraiwa, et al. (1993). "A feasible method for expansion of peripheral bloodlymphocytes by culture with immobilized anti-CD3 monoclonal antibody and interleukin-2 for use in adoptive immunotherapy of cancer patients." Biomed Pharmacother 47(2-3):73-8.Shaw, S. G., A. A. Maung, et al. (1998). "Expansion of functional NK cells in multiple tissuecompartments of mice treated with Flt3-ligand: implications for anti-cancer and anti-viraltherapy." J Immunol 161(6): 2817-24.Shearer, W. T., H. M. Rosenblatt, et al. (2003). "Lymphocyte subsets in healthy children frombirth through 18 years of age: the Pediatric AIDS Clinical Trials Group P1009 study." JAllergy Clin Immunol 112(5): 973-80.Shilling, H. G., L. A. Guethlein, et al. (2002). "Allelic polymorphism synergizes with variablegene content to individualize human KIR genotype." J Immunol 168(5): 2307-15.Shlomchik, W. D., M. S. Couzens, et al. (1999). "Prevention of graft versus host disease byinactivation of host antigen-presenting cells." Science 285(5426): 412-5.Shounan, Y., X. Feng, et al. (1998). "Apoptosis detection by annexin V binding: a novel methodfor the quantitation of cell-mediated cytotoxicity." J Immunol Methods 217(1-2): 61-70.Sinkovics, J. G. and J. C. Horvath (2005). "Human natural killer cells: a comprehensive review."Int J Oncol 27(1): 5-47.Sivori, S., S. Carlomagno, et al. (2006). "Comparison of different CpG oligodeoxynucleotideclasses for their capability to stimulate human NK cells." Eur J Immunol 36(4): 961-7.58

Sivori, S., M. Vitale, et al. (1997). "p46, a novel natural killer cell-specific surface molecule thatmediates cell activation." J Exp Med 186(7): 1129-36.Smyth, M. J., M. W. Teng, et al. (2006). "CD4+CD25+ T regulatory cells suppress NK cellmediatedimmunotherapy of cancer." J Immunol 176(3): 1582-7.Spreu, J., T. Stehle, et al. (2006). "Human cytomegalovirus-encoded UL16 discriminates MICmolecules by their alpha2 domains." J Immunol 177(5): 3143-9.Szekeres, J., A. S. Pacsa, et al. (1981). "Measurement of lymphocyte cytotoxicity by assessingendogenous alkaline phosphatase activity of the target cells." J Immunol Methods 40(2):151-4.Street, S. E., E. Cretney, et al. (2001). "Perforin and interferon-gamma activities independentlycontrol tumor initiation, growth, and metastasis." Blood 97(1): 192-7.Zamai, L., M. Ahmad, et al. (1998). "Natural killer (NK) cell-mediated cytotoxicity: differentialuse of TRAIL and Fas ligand by immature and mature primary human NK cells." J ExpMed 188(12): 2375-80.Zamai, L., C. Ponti, et al. (2007). "NK cells and cancer." J Immunol 178(7): 4011-6.Zhang, X., S. Sun, et al. (1998). "Potent and selective stimulation of memory-phenotype CD8+ Tcells in vivo by IL-15." Immunity 8(5): 591-9.Zijlstra, M., H. Auchincloss, Jr., et al. (1992). "Skin graft rejection by beta 2-microglobulindeficientmice." J Exp Med 175(4): 885-93.Zingoni, A., T. Sornasse, et al. (2004). "Cross-talk between activated human NK cells and CD4+T cells via OX40-OX40 ligand interactions." J Immunol 173(6): 3716-24.Zitvogel, L. (2002). "Dendritic and natural killer cells cooperate in the control/switch of innateimmunity." J Exp Med 195(3): F9-14.zur Stadt, U., S. Schmidt, et al. (2005). "Linkage of familial hemophagocytic lymphohistiocytosis(FHL) type-4 to chromosome 6q24 and identification of mutations in syntaxin 11." HumMol Genet 14(6): 827-34.Takeda, K., Y. Hayakawa, et al. (2001). "Involvement of tumor necrosis factor-related apoptosisinducingligand in surveillance of tumor metastasis by liver natural killer cells." Nat Med7(1): 94-100.Taylor, M. A., B. Ward, et al. (2002). "Perforin- and Fas-dependent mechanisms of natural killercell-mediated rejection of incompatible bone marrow cell grafts." Eur J Immunol 32(3):793-9.Ting, A. T., R. A. Schoon, et al. (1992). "Interaction between protein kinase C-dependent and Gprotein-dependent pathways in the regulation of natural killer cell granule exocytosis." JBiol Chem 267(33): 23957-62.Tomasec, P., V. M. Braud, et al. (2000). "Surface expression of HLA-E, an inhibitor of naturalkiller cells, enhanced by human cytomegalovirus gpUL40." Science 287(5455): 1031.Torelli, G. F., A. Guarini, et al. (2002). "Expansion of cytotoxic effectors with lytic activityagainst autologous blasts from acute myeloid leukaemia patients in completehaematological remission." Br J Haematol 116(2): 299-307.Tseng, C. T. and G. R. Klimpel (2002). "Binding of the hepatitis C virus envelope protein E2 toCD81 inhibits natural killer cell functions." J Exp Med 195(1): 43-9.Valiante, N. M., M. Uhrberg, et al. (1997). "Functionally and structurally distinct NK cellreceptor repertoires in the peripheral blood of two human donors." Immunity 7(6): 739-51.Whiteside, T. L. and R. B. Herberman (1994). "Role of human natural killer cells in health anddisease." Clin Diagn Lab Immunol 1(2): 125-33.59

Wilson, M. J., M. Torkar, et al. (2000). "Plasticity in the organization and sequences of humanKIR/ILT gene families." Proc Natl Acad Sci U S A 97(9): 4778-83.Vitale, M., C. Bottino, et al. (1998). "NKp44, a novel triggering surface molecule specificallyexpressed by activated natural killer cells, is involved in non-major histocompatibilitycomplex-restricted tumor cell lysis." J Exp Med 187(12): 2065-72.Vitale, M., L. M. Neri, et al. (1989). "Natural killer function in flow cytometry. II. Evaluation ofNK lytic activity by means of target cell morphological changes detected by right anglelight scatter." J Immunol Methods 121(1): 115-20.Vivier, E., J. A. Nunes, et al. (2004). "Natural killer cell signaling pathways." Science 306(5701):1517-9.Voehringer, D., M. Koschella, et al. (2002). "Lack of proliferative capacity of human effector andmemory T cells expressing killer cell lectinlike receptor G1 (KLRG1)." Blood 100(10):3698-702.Wu, J. and L. L. Lanier (2003). "Natural killer cells and cancer." Adv Cancer Res 90: 127-56.Wulfing, C., B. Purtic, et al. (2003). "Stepwise cytoskeletal polarization as a series of checkpointsin innate but not adaptive cytolytic killing." Proc Natl Acad Sci U S A 100(13): 7767-72.Yabe, T., C. McSherry, et al. (1993). "A multigene family on human chromosome 12 encodesnatural killer-cell lectins." Immunogenetics 37(6): 455-60.Yu, Y. Y., T. George, et al. (1996). "The role of Ly49A and 5E6(Ly49C) molecules in hybridresistance mediated by murine natural killer cells against normal T cell blasts." Immunity4(1): 67-76.60